Engineering skjelettmuskulatur vev fra Murine Myoblast stamceller og anvendelse av elektrisk stimulering

Summary

Engineered muskelvev har stort potensial i regenerativ medisin, som sykdom modell og også som en alternativ kilde for kjøtt. Her beskriver vi prosjektering av en muskel konstruere, i dette tilfellet fra mus myoblast stamceller og overstimulering av elektriske pulser.

Abstract

Konstruert muskelvev kan brukes for flere forskjellige formål, som omfatter produksjon av vev for anvendelse som en sykdom modell i vitro, for eksempel for å studere trykksår, for regenerativ medisin og som en kjøtt alternativ ^1. De første rapporterte 3D muskel konstruerer har blitt gjort for mange år siden og pionerer i feltet er Vandenburgh og kolleger ^2,3. Fremskritt gjort i muskelvev engineering er ikke bare et resultat av den enorme gevinsten i kunnskap om biokjemiske faktorer, stamceller og stamceller, men er spesielt basert på innsikter fått av forskere at fysiske faktorer spiller viktige roller i kontrollen av celle atferd og vev utvikling. State-of-the-art utviklet muskel konstruerer består i dag av celle-befolkede hydrogel konstruksjoner. I vårt laboratorium disse består vanligvis av murine myoblast stamceller isolert fra murine hind lem muskler eller en murine myoblast cellelinje C2C12, mifestes med en blanding av kollagen / Matrigel og belagt mellom to forankringspunkter, etterligne muskel leddbånd. Andre celler kan betraktes som godt, f.eks alternative cellelinjer som L6 rotte myoblasts ^4, neonatal muskel stammer progenitorceller ^5, celler avledet fra voksne muskel vev fra andre arter som menneske ⁶ eller indusert pluripotent stamceller (iPS-celler) ⁷ . Cell kontraktilitet fører justering av celler langs den lange aksen av konstruksjonen ^8,9 og differensiering av muskel stamceller etter ca en uke av kultur. Dessuten kan anvendelsen av elektrisk stimulering forbedre prosessen med differensiering til en viss grad ^8. På grunn av sin begrensede størrelse (8 x 2 x 0,5 mm) den komplette vev kan bli analysert ved hjelp av konfokal mikroskopi å overvåke f.eks levedyktighet, differensiering og cellejustering. Avhengig av den spesifikke applikasjonen kravene til engineerød muskelvev vil variere, f.eks bruk for regenerativ medisin krever oppskalering av vev størrelse og vaskularisering, mens for å tjene som en kjøtt alternativ oversettelse til andre arter er nødvendig.

Protocol

1. Culture of Murine Myoblast stamceller eller C2C12 Cells

1. Isoler cellene i henhold til protokollen opprinnelig publisert av Shefer og kolleger ¹⁰ og senere tilpasset av Collins et al. ¹¹ og Boonen mfl.. ¹² og lagrer disse i flytende nitrogen. Dette krever mus, f.eks C57BL / 6. Alternative metoder blir brukt i andre laboratorier, for eksempel en metode publisert i Journal of visualisert Experiments av Li Y et al. ^13. For reagenser og utstyr du blir henvist til tabellen på side 7 og 8. Fra muskel fra en mus vil du vanligvis få nok celler til å cryopreservere ca 20 ampuller i flytende nitrogen. Deretter starter vi protokollen for å tine cellene fra flytende nitrogen oppbevaring.
2. Plasser cellene fra en ampulle i en 25 cm ^to Matrigel (1 mg / ml) belagt vevskultur kolbe og tilsett dyrkningsmedium (GM) bestående av (335 ml DMEM avanserte, 100 ml fosterets bovine serum (FBS), 50 ml HS, 5 ml penicillin / streptomycin, 5 ml L-Glutamin, 5 ml kylling embryo ekstrakt (CEE)).

Merknad: belegge i 2 timer ved romtemperatur og fjern Matrigel ved aspirasjon.

3. Subkultur cellene omtrent 01:03 hver 3 dager.
   Dette betyr: på dag 3: Passage celler fra en 25 cm ² til en 75 cm ² kolbe, på dag 6: passage celler fra en 75 cm ² kolbe til to 150 cm ² kolber (med 30 min preplating i ubestrøket flasker). På dag 9 overføring en 150 cm ² kolbe til en trippel 150 cm ² kolbe, eller hvis utilgjengelig for tre 150 cm ² kolber (om nødvendig preplate igjen avhengig fenotypen av cellene). På dag 12 cellene er klare for seeding i en muskel konstruere.

Merknader: - Per triple 150 cm ² antall celler vil være ca 4,5 x 10 ⁶ celler.
- Bruk vials fra ulike isoleringer å blande dem for å oppnå en blandet populasjon av celler på tidspunktet for såing.

Merk: Hvis du velger å ikke jobbe med primære celler, C2C12 myoblasts er et godt alternativ.

2. Engineering skjelettmuskulatur vev

1. Forbered silisium lim ved å blande "elastomer" med "herder" (10:01). Skjær + / - 5 mm firkantet segmenter av borrelås med trekantet side (hus-lignende form, figur 1). Lim borrelås inn i brønnene til en 6-brønns dyrkingsplate på en plass av ca 12 mm mellom rutene.

Merknader: - Bruk bare den myke siden av borrelås og møte denne siden opp.
- Sørg for at takene er vendt mot hverandre.
- Bare dekke borrelås med silisium lim, ikke spre limet hele godt.
- For senere elektrisk stimulering er det relevant å justere konstruerer i vertikal retning av brønnen plspiste (langs den lange aksen).

2. La tørke over natten i vakuum ovn, ikke oppvarmet, primært for å fjerne luftbobler. Steriliser ved tilsetning 70% EtOH til brønnene og inkuber i 15 min. Skyll 3x med PBS og satt under UV i 15 min. Fjern alle PBS fra brønnene og borrelås og plasser i inkubator inntil bruk.
3. Tine Matrigel løsning i kjøleskapet og forberede kollagen løsningen til ønsket konsentrasjon kort tid før 3D konstruksjoner. Fortynn lager kollagen med steril 0,02% eddiksyre (sluttkonsentrasjon 3,2 mg / ml).

Merk: la alt på is.

4. Trypsinize cellene, resuspender i GM og teller. Forlate cellene i sentrifugerøret i kuvøse.
5. Legg ønsket mengde kollagen stamløsningen for antall konstruksjoner som du ønsker å gjøre til et rør (i henhold til tabell 1), legge 0.5M NaOH til denne kollagen løsning inntil en lys rosa color indikerer en pH på 7,5. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned og unngå bobledannelse. Deretter legger du til Matrigel og bland veldig forsiktig, men grundig. Til slutt legger du GM til Kollagen / Matrigel blanding (for de aktuelle beløpene se tabell 1).

Merknader: - Utfør hvert trinn på isen! Matrigel og kollagen vil lett gel ved økende temperatur.
- Pass på at fargen faktisk er rosa! En økning i pH vil også indusere hurtig gelering.
- Sluttkonsentrasjon av kollagen: 1,6 mg / ml.

6. Sentrifuger ønsket mengde av celler ved 1000 opm i 5 minutter og fjern supernatanten.

Merk: - avhengig av aktiviteten av cellene antall celler per konstruere trenger å justeres. Vanligvis ligger antall celler mellom 750.000 og 1.250.000 celler per konstruere.

7. Bruke noe av gel-blanding for å resuspendere cellepelletenog overføre cellene til den gjenværende blanding, og bland grundig, men uten å innføre luftbobler.
8. Ta forvarmede brønnplatene ut av inkubatoren og pipetten 0,35 -0,4 ml av celle-gel-blanding inn borrelåsen først. Deretter begynner å pipettere blandingen fra sentrum mellom forankringsdelene områder og utvide til borrelås. Slutt bruker resten av gelen for å fylle opp mellomrommet mellom de to borrelåsbånd ankere og pipetter rundt Velcro stykker.
9. Nøye kontrollere etter 5-10 min hvis gels er solide nok til å bli overført, dvs. banke forsiktig rettene og inspisere visuelt hvis gel er stiv. I så fall nøye plassere retter i en inkubator. Vanligvis kan de bli plukket opp etter ti minutter. Deretter, etter at 1-2 hr, forsiktig overlegg hver gel med 4 ml varm GM.

Merk:-Ikke gjør noen kraftige bevegelser ved håndtering av platene.

10. Erstatt GM etter differensiering medium (vekstmediumuten chick embryo ekstrakt) etter 24 timer, og erstatte med frisk medium hver 2-3 dager. På dag 7 bør du ha fått modne orientert muskelfibre, som kan evalueres med flekker for cross striation utvikling i smeltet muskelfibre.

3. Elektrisk stimulering

1. Steriliser elektrodene fra ionoptix plate (se tabell av reagenser og utstyr) før bruk med 70% etanol og deretter tørt under UV på en sikkerhetskabinett. Sett platen med elektroder bort på kultur plate med konstruerer og dekk med lokket fra kultur plate og overføring til en inkubator. Koble Ionoptix C-Pacer med de riktige kablene.

Merk: Elektroder plasseres parallelt langs muskel konstruere (figur 2).

2. Påfør stimulering protokollen som forventet.

Merk: Vi bruker vanligvis 4 V / CM,6ms pulser ved en frekvens på 2 Hz. Endre kulturen medium hver 24-timers løpet stimulering.

Representative Results

Sluttproduktet vil være muskel konstruerer som angitt i figur 3.. Størrelsen på vevet vil bli ca 8 mm lange, 2 mm brede og 0,5 mm tykke. Elektrisk stimulering under differensiering vil endre ekspresjonen av myosin tungkjede isoformer, men ikke i stor grad forbedre differensiering prosessen som indusert ved differensieringen medium 8, men elektrisk stimulering kan også påføres ved slutten av prosessen for å sjekke for funksjonalitet av muskelen , fordi en muskel med fullt utviklede sarcomeres vil kunne trekke på en elektrisk puls.

Differensiering og modning kan også bli analysert ved hjelp av kvantitativ PCR for genuttrykk evaluering og farging for muskel modning markører eller kryss striation utvikling (f.eks farging for alpha actinin) på enten seksjoner laget av vev eller hele mount farget vevsprøver. Muskel modning og differensiering related gener og myosin tungkjede expression inkluderer f.eks MyoD, myogenin, MFR4 og MLP, og 1 MYH, 2, 4 og ⁸ 8. Bevis på at muskelvev som dannes faktisk er muskelvev, basert på genekspresjon, immunhistokjemiske stainings og sammentrekning induksjon av elektrisk stimulering, har blitt publisert tidligere ⁸ og en figur med farget tverrsnitt av muskel vev laget av myoblast stamceller og C2C12 celler fra dette papiret er vist i figur 4.

Oppløsning	Volum (hvis gjør 10 muskler) i ul
Kollagen (3,2 mg / ml, fortynnet med 0,02% eddiksyre)	2570 (51,3%)
NaOH (0,5 M)	10 (0.2%)
Matrigel	430 (8,6%)
Vekstmedium	2000 (39,9%)
total	5010 (bør være nok med nok for søl og pipettering tap)

Tabell 1. Blanding av celler og gel for generering av et vev konstruert muskel konstruere.

Figur 1. Kutte bitene av borrelås.

Figur 2. Et bilde tatt fra bunnen av en muskel konstruere i en brønn av en 6-brønns plate som viser plasseringen av elektrodene. Elektrodene (angitt med de hvite piler) er plassert parallelt med muskel konstruksjoner.

Figur 3. En vevkonstruert muskel i mellom to stykker av borrelås i en 6-brønns dyrkingsplate.

Figur 4. Typiske eksempler på kryss-striations i C2C12 (A) og MPC (B) i konstruerte skjelettlidelser muskelvev. Frosne deler av ikke-stimulerte mBAMs (dag 8 av differensiering) var farget for sarcomeric α-actinin (rød), sarcomeric myosin (grønn ) og kjerner (blå). (Aa-Ab og Ba-Bb) Forstørrelser av eske områder i (A, B) α-Actinin (rød) og sarcomeric myosin (grønn). Gjengitt med tillatelse fra ^8. Klikk her for å se større figur.

Discussion

Prosjektering av muskel vev har et stort potensial for bruk som en sykdom modell, for narkotika screening, i regenerativ medisin og for kjøttproduksjon. Imidlertid kravene til disse applikasjonene varierer. Vi valgte å arbeide med en kombinasjon av kollagen og Matrigel, fordi kollagen tillater cellejustering og fordi myoblast stamceller krever tilstedeværelse av basalmembran avledet proteiner som bestemt i tidligere 2D studier ^12. Videre har fibrin gels blitt testet i vårt laboratorium og synes ikke å støtte C2C12 og myoblast stamceller som gjør blandingen av kollagen og Matrigel ™ og spesielt ikke fører til vev komprimering ^14. Modellen som er beskrevet her har blitt brukt allerede i studier på trykksår skade mens ved hjelp av en cellelinje ^15. For regenerativ medisin programmer har oversettelsen til menneskelige satellitt celler nylig blitt gjort ^6,16. I tillegg,som en alternativ kilde for kjøttforbruket teknikken har stort potensial ^1. Etter vår mening må imidlertid den nåværende teknologien for å avansere til et neste trinn til ytterligere sin bruk i klinikken samt for konsum. For eksempel, stopper differensiering på rundt neonatal scenen og også tvinge produksjonen er mye mindre enn en muskel produserer in vivo. I tillegg, selv mus, rotte og menneske stamceller kan implementeres i 3D konstruksjoner, isolasjon og særlig differensiering og modning av husdyr avledet muskel stamceller ikke utvikles så langt ennå ^en. Også bruk av Matrigel og animalsk avledet serum behov utelates ^1. For å fremme anvendelsen i regenerativ medisin, har vevet størrelsen økes, og krever (neo) vascularization og bruk av perfusjon bioreaktor systemer å overvinne oksygen og næringsstoffer diffusjonsprosesser begrensninger. Noen innledende vascularization studier på små konstruksjoner have blitt gjort i de siste årene ^9,17,18.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel-growth factor reduced	Beckton and Dickinson
DMEM (high glucose)*	Gibco	42430
Advanced DMEM	Gibco	12491
Horse serum	Gibco	65050-122
Fetal bovine serum	Greiner	758075
0.45 and 0.22 μm syringe filter*	Whatmann (Schleicher and Scheull)	10462100
L-glutamine	Gibco	25030024
Penicillin/streptomycin	Gibco	10378016
Amphotericin	Gibco	15290-018
Culture plastic	Greiner		Includes culture flasks and pipets
Chick embryo extract	United States Biological	C3999
Pasteur pipet*	Hilgenberg		Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm
Pasteur pipet*	Hilgenberg		Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm
Pasteur pipet	VWR	612-1702
Collagenase type I*	Sigma	C0130-16
40 μm cell strainer*	BD Falcon	352340
19G needle
Elastomer	Dow Corning corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Curing agent	Dow Corning corporation		Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regular store		You can buy this at a regular store, only use the soft side
Collagen type I, rat tail	BD Biosciences	3544236
C-Pace EP Culture Pacer	Ionoptix
6-well culture dishes for electrical stimulation	Beckton Dickinson-Falcon	BD Falcon #353846
C-Dish culture dish electrodes	Ionoptix
* Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit