Summary
Dit artikel en de bijbehorende video presenteren ons protocol voor het genereren van weefsel-engineered darm in muizen, waarbij een organoid units-on-scaffold benadering.
Abstract
Weefselmanipulatieproducten dunne darm (TESI) is met succes gebruikt om Lewis ratten redden na massale dunne darm resectie, waardoor terugkeer naar preoperatieve gewicht binnen 40 dagen. 1 in mensen, massieve dunne darm resectie kan resulteren in korte darmsyndroom, functionele malabsorptieve stellen dat significante morbiditeit, mortaliteit en zorgkosten zoals parenterale voeding afhankelijkheid leverfalen en cirrose, en de noodzaak multiviscerale orgaantransplantatie. 2 In dit document geeft beschrijven en documenteren ons protocol voor het maken weefselmanipulatieproducten darm in een muismodel met een meercellige organoid eenheden-op-steiger aanpak. Organoid units zijn meercellige aggregaten afgeleid van de darm dat zowel mucosale en mesenchymale elementen bevatten, 3 de relatie tussen die behoudt de intestinale stamcellen niche. 4 In lopend en toekomstig onderzoek, de overgang van onze techniek in demuis zal voor onderzoek van de processen in TESI vorming door gebruikmaking van de transgeen materiaal in deze soort. 5 De beschikbaarheid van immuungecompromitteerde muizenstammen laat tevens ons de techniek toepassing humane intestinale weefsel en de vorming van menselijke TESI optimaliseren als muis xenograft vóór de overgang naar de mens. Onze methode maakt gebruik van Good Manufacturing Practice (GMP) reagentia en materialen die al zijn goedgekeurd voor gebruik in menselijke patiënten, en biedt daarom een belangrijk voordeel ten opzichte van benaderingen die steunen op gedecellulariseerde dierlijke weefsels. Het uiteindelijke doel van deze methode is de vertaling naar de mens als regeneratieve geneeskunde therapeutische strategie voor short bowel syndrome.
Protocol
1. Organoid Eenheden Voorbereiding
- Instrumenten die geschikt is voor de muis dissectie (schaar en pincet) moet worden gesteriliseerd door autoclaaf.
- Humaan euthanaseren de donor muis volgens de lokale IACUC protocollen. Zorg ervoor dat het dier dood is voordat u verder gaat.
- Een incisie om toegang tot de buikholte krijgen. Huidplooien worden gereflecteerd als nodig om de belichting.
- Eviscerate de dunne darm en verdeel het net distaal van het ligament van Treitz. Scheid de dunne darm van de mesenterium met behulp van scherpe en zachte stompe dissectie. Identificeer de Bauhin knooppunt en verdeel de dunne darm 5 mm proximaal van deze.
- Met een schaar lengte opent de darm langs de rand antimesenteric in een petrischaal met 10 ml 4 ° C, steriele zoutoplossing Hanks '(HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiotica antifungale (Anti-Anti, Invitrogen) oplossing. Wis fecale materie uit de geopende darm metzachtjes schudden vervolgens over geopend darm aan een 15 ml centrifugebuis met 10 ml van 4 ° C, steriele HBSS / 1X anti-anti.
- Was de darm geopend driemaal in 10 ml van 4 ° C, steriele HBSS / 1X anti-anti in een reageerbuis. Elke wassing kan worden uitgevoerd met mild schudden van de 15 ml buis gedurende 30 sec. Na het schudden het darmweefsel zinkt naar de bodem van de buis. Ontdoen drijvend materiaal dat mesenchymale vuil. Verwijder voorzichtig het wassen oplossing met een pipet.
- Hak de gewassen darm in een petrischaal met 10 ml van 4 ° C, steriele HBSS / 1X anti-anti minder dan 1 mm vierkante stukken met een schaar. Verzamel de gehakte materiaal met een automatische pipet en plaats deze in een reageerbuis.
- Centrifugeer het buisje bij 500 rpm gedurende 8 min. Verwijder het supernatant, dat vet bevat en mesenchym.
- Digereren van het gehakt, gewassen materiaal met 10 ml steriel HBSS / 1X anti-anti plus 0,125 mg / ml dispase (Invitrogen) en 800 eenheden / ml collagenase type 1 (Worthington, Lakewood NJ). Aan 40 ml van de spijsvertering oplossing te bereiden afgewogen 5 mg dispase, 142 mg collagenase en voeg steriele HBSS tot een volume van 40 ml. Bereid deze oplossing vers telkens organoid eenheden bereid en houden bij 4 ° C tot gebruik. Voeg de digestieoplossing direct naar de pellet uit stap 1.8.
- Incubeer het buisje met het gehakt, gewassen materiaal bij de vertering oplossing bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
- Haal de reageerbuis en verder de verteerde weefsel kan verstoren door fijnwrijven met een 10 ml pipet. Herhalen tussen 20 tot 50 keer totdat een uniform uiterlijk wordt verkregen.
- Centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 800 rpm. Verwijder het supernatant, dat enkele cellen.
- Stop de digestie reactie met 10 ml 4 ° C, steriele Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen) plus 10% v / v hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (HI-FBS, Invitrogen). Resuspendeer de pellet en schud de buis.
- Centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 800 rpm. Verwijder voorzichtig het supernatant met een automatische pipet tot de laatste paar druppels. Gebruik een wegwerp plastic pipet voor de laatste paar druppels te voorkomen resuspenderen de pellet.
2. Laden van polyglycolzuur Steiger
- Form 2 mm lang en 5 mm buitendiameter cilindrische scaffolds van nonwoven polyglycolzuur (2-mm plaatdikte, 60 mg cm-3 stortgewicht; porositeit> 95%, Concordia Fibers, Coventry RI) zoals beschreven in Ref. 4.
- Knip de distale 2 mm van een wegwerp 1000 microliter pipet tip met een schaar bereid met 70% ethanol in gedestilleerd water.
- Plaats de steiger in een 4-well cultuur plaat. Plaats de organoid eenheden op de scaffold met 1000 microliter pipet, eerst in het lumen en op het buitenoppervlak. Gebruik een tang om coating van het lumen te verzekeren. Niet verstoren of open te breken de cilindrische vorm van het polymeer.
3. Implantatie in Host Mouse
- Gebruik een syngene gastheer muis op dezelfde achtergrond als de donor indien beschikbaar. Anders, gebruik een immunogecompromitteerde nonobese diabetische / ernstige gecombineerde immunodeficiëntie of NOD / SCID-dier (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
- Laten algemene anesthesie met isofluraan. Scheren, prep en drapeer de muis buik.
- Maak een 5 mm middellijn incisie om toegang tot de peritoneale holte te krijgen. Identificeer en zorgvuldig uithalen de grotere omentum. Plaats het geladen polymeer op het omentum en wikkel met het weefsel. Niet scheuren het omentum.
- Bevestig de polymeer aan het omentum met een 5-0 hechting monocryl. Voorzichtig vervangen omentum de verpakte polymeer in de anatomische positie.
- Sluit de abdominale incisie in lagen met 4-0 vicryl hechtingen. Voer de spier sluiting en let op dat de buikorganen onder de incisie verwonden. Gebruik onderbroken hechtingen voor de huid.
- Dien postoperatieve analgesie met 2 mg / kg ketoprofen (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) in steriel water als subcutane wheal naast de insnijding. Proefdieren moeten dagelijks worden geëvalueerd en indien het dier te tonen tekenen van pijn of ongemak, een bijkomende dosis van ketoprofen kunnen worden toegediend op post-operatieve dag 2. Door de derde postoperatieve dag, moet het dier volledig worden hersteld zonder bewijs van pijn of ongemak. Als pijn of angst gaat verder op post-operatieve dag 3, wordt dit beschouwd als abnormaal en moet worden behandeld in overeenstemming met de IACUC en verzorging van dieren faciliteit protocollen.
- Laat de muis om te herstellen en het weefsel vervaardigde darm te groeien gedurende vier weken. Geef het dier ad libitum toegang tot knaagdier chow (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis, MO) en water met Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml (Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) bij 1:100 verdunning.
4. Oogst
- HumaNely euthanaseren de host dier vier weken na de implantatie.
- Open de oorspronkelijke incisie en geven de huid craniale toegang tot de buikholte vergemakkelijken.
- Open de spierlaag en identificeren van de tissue-engineering construct zoals een bol van weefsel.
- Take down verklevingen aan het construct van intra-abdominale ingewanden met behulp van scherpe dissectie.
- Bevestig het construct in formaline voor later paraffine montage of gebruik het weefsel vers voor biochemische assays, zoals real-time PCR of eiwit isolatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 een algemeen schema voor de hier beschreven protocol. Het eindresultaat van dit protocol is een wereldbol of bolvormige structuur van weefsel gemanipuleerde muizen darm met een lumen, mucosa, submucosa, muscularis en omliggende. Figuur 2A toont een typische bol in vergelijking met een uitgangspolymeer scaffold. Figuur 2B geeft hetzelfde construct tweekleppig sterk zijn lumen onthullen. Figuur 3 toont een hematoxyline / eosine gekleurde paraffine gemonteerde dwarsdoorsnede van een typisch succesvol construct na 4 weken incubatie. In Ref. 4, konden we weefselmanipulatieproducten darm succes 89% van de te produceren (39 van de 44 implantaten).
Een mislukte een construct waarin geen mucosa vormen. Het is onmogelijk om te beoordelen op basis van bruto optreden bij het oogsten of de wereldbol zal mucosa over de definitieve histologische analyse. Dus als biochemische assays performed op de verse weefsel construct moet helft van elke bol vast en paraffine gemonteerd histologische analyse om te bevestigen dat mucosa is in elk monster. Een mislukte construct zal demonstreren alleen stroma en fibrose op hematoxyline / eosine kleuring.
Figuur 1. Schema voor de productie van tissue-engineered darm in de muis. In het kort wordt donorweefsel geoogst en tot organoid eenheden. De organoid units worden geladen op een poreuze polyglycolzuur scaffold, dat vervolgens wordt geïmplanteerd in een gastheer en men liet incuberen gedurende 4 weken. De kunstmatige construct wordt vervolgens opgehaald en kan gekarakteriseerd worden via histologie of biochemische assays.
Figuur 2. Voorbeeld van tissue-engineered darm construct geoogst na 4 weken. A: Construct in bedrijvenRison te uitgangspolymeer scaffold. B: Hetzelfde construct, tweekleppig zijn lumen onthullen.
Figuur 3. Met een laag vermogen hematoxyline / eosine microfoto van een typische succesvolle tissue-engineered darm construct. De labels en pijlen geven het lumen met darmslijmvlies, en aanhanger gastheer alvleesklier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een protocol voor het produceren van tissue-engineered darm in de muis met behulp van een organoid eenheden-op-steiger aanpak. De belangrijkste stappen zijn die van de organoid eenheden preparaat. Zorg moet worden genomen om adequaat te reinigen en mechanisch verwerken van het weefsel, maar evenveel zorg moeten worden genomen om geen overdigest of overtriturate de organoid eenheden na de spijsvertering wordt uitgevoerd (stap 1.11). Als dit gebeurt, de organoid eenheden worden gereduceerd tot enkele cellen, die verloren in de supernatant van stap 1,12 en waarschijnlijk overleven weefselmanipulatieproducten darmen produceren, daar de intestinale stamcellen niche niet in het onderhavige geval.
De geringe omvang van de muis maakt het een uitdaging om de tissue-engineered constructie direct anastomose aan darm van de gastheer dier om zijn functie te testen in vivo. U kunt ook de rat is een groter model voor TESI groei die faciliteert in vivo anastomose enreeds uitgevoerd om deze reden 1. Niettemin de grootte van de muis niet onoverkomelijk obstakel, zoals al kunnen kleine darm resectie en anastomose, 6 of anorectale chirurgie, 7 uit te voeren in deze dieren. Om deze problemen, experimenten richten tot de functie van onze tissue-engineered intestinale constructies in een kenmerkend in vitro mode zijn aan de gang. Bijkomende beperkingen deze techniek zijn een 89% slagingspercentage in het genereren van TESI 4. Dat wil zeggen dat 89% van OU loaded scaffolds succesvol genereren TESI. De toepassing van deze techniek door anderen te verfijnen en te verbeteren techniek waardoor de totale opbrengst aan 100%. Bovendien kan deze techniek worden verbeterd als de totale hoeveelheid voortgebrachte weefselmassa kan worden verhoogd. Momenteel is flowcytometrie aangetoond dat het totale aantal cellen in de geoogste TESI construct is 3 maal groter dan het aantal aanwezige implantatie(3,07 x 10 6 ± 0,5 x 10 6) 4. Het verbeteren van het volume van de TESI productie is een belangrijke stap in de richting van vertaling naar therapie.
We merken ook op dat de muis darm, zeer dunwandige en van klein kaliber, is bijzonder gemakkelijk te verwerken in vergelijking met die van andere species, zoals varkens of de rat. In mensen, verwachten wij dat sommige details van de organoid eenheden bereidingsstappen moet worden aangepast zowel voldoende verteren het weefsel en voorkomen overdigestion om enkele cellen, met name de concentraties van dispase en collagenase in de digestieoplossing en het tijdstip van digestie bij 37 ° C.
Het uiteindelijke doel van deze techniek is de overgang naar humane therapie. Tissue engineering van menselijke darm van eigen weefsel van de patiënt kan mogelijk een duurzame, langdurige geneesmiddel voor korte-darmsyndroom (SBS) en geen van de nadelen van de bestaande therapieën. Korte darm syndrome een ziektetoestand veroorzaakt door resectie van een significante fractie van de totale lengte van de dunne darm, gewoonlijk meer dan 50 tot 75 procent, zodat het absorptievermogen sterk verminderd en de patiënt voldoende voeding niet verkrijgen van enterale voeding. 2 kinderen, de meest voorkomende oorzaken van SBS zijn enorme dunne darm resectie secundair aan necrotiserende enterocolitis of malrotatie met middendarm volvulus. 8,9 ook, hoewel minder vaak voor, SBS kan optreden bij volwassenen als gevolg van meerdere resecties in de setting van de ziekte van Crohn, of met mesenteriale ischemie secundair aan vasculaire ziekte. 10,11 Omdat SBS patiënten niet kan voldoende voeding met enterale inname te waarborgen, mogen zij nodig hebben op lange termijn totale parenterale voeding, die zelf kan worden gecompliceerd bij kinderen door leverfalen en cirrose. 12 SBS patiënten dan ook belangrijke verdragen kosten voor de gezondheidszorg, heeft onlangs geschat in de orde van $ 1,6 miljoen per patiëntover 5 jaar. 13 De huidige standaard van zorg voor darmfalen secundair aan SBS is intestinale, lever / darm, of andere multi-orgaan transplantatie, maar dit geeft slechts een 60% 5-jaars overleving en een zending van de patiënt om een levenslange loop van de immunosuppressieve therapie 14. Verder beperkt donororgaan beschikbaar resulteert in een onvermijdelijke gebrek in vraag en aanbod en lange wachttijden. 15 Daarom, zou tissue engineering van autoloog weefsel van de patiënt een aantrekkelijk alternatief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel, en Frederic G. Sala worden ondersteund door het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (CIRM), subsidie nummers RN2-00946-1 (TCG) en TG2-01168 (ERB, FGS). Allison L. Speer is een Vereniging van de Universiteit Chirurgen Ethicon geleerde. Yashuhiro Torashima wordt gefinancierd door een Children's Hospital Los Angeles Saban Instituut Onderzoek Career Development Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM High Glucose 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Heat inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Poly-L-lactic acid | Durect | B6002-1 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Type I Collagen, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Ketoprofen 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 rodent chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
References
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
- Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).
- Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures. J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse. Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).
- Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation. J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).
- Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection. Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).
- Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease. J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).
- Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).
- Shew, S. B. Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus. Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).
- Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).
- Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia. Surgery. , 121-239 (1997).
- Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome. J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).
- Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care. Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).
- Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. Intestinal and multivisceral transplantation in children. Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).
- Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. Current status of intestinal transplantation in children. J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).
