Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

रोग में Chromatin Proteomes के मात्रात्मक विश्लेषण

Published: December 28, 2012 doi: 10.3791/4294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,4
1Department of Anesthesiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Department of Physiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Internal Medicine, Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah

Summary

मास स्पेक्ट्रोमेट्री अग्रिम में प्रोटीन अभिव्यक्ति और ऊतकों की एक मेजबान में संशोधन के उच्च throughput विश्लेषण की अनुमति दी है. Subcellular fractionation और रोग मॉडल, मात्रात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री और जैव सूचना विज्ञान जैविक प्रणालियों में नए गुण प्रकट कर सकते हैं के साथ संयुक्त है. यहाँ वर्णित विधि हृदय रोग की सेटिंग में chromatin जुड़े प्रोटीन का विश्लेषण करता है और आसानी से दूसरे के लिए लागू है

Protocol

प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह सात प्रमुख कदम (1 चित्रा) शामिल हैं. किसी भी नमूने है कि मास स्पेक्ट्रोमीटर पर चला जाएगा जुड़े काम के लिए एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और बाल शुद्ध experimenter पहनते हैं और धूल और केरातिन की व्यक्तिगत बहा से संक्रमण से बचने के लिए देखभाल करने के लिए करना चाहिए.

1. हार्ट Homogenization और परमाणु अलगाव

माउस दिल homogenized और एक अक्षुण्ण नाभिक गोली (2 चित्रा) अलग है.

  1. वयस्क माउस, दिल आबकारी बलिदान, पीबीएस में ठंडा कुल्ला, और कांच dounce में बर्फ पर homogenize (हम Wheaton ऊतक फिशर से चक्की, 08-414-13A # पसंद करते हैं, लेकिन अन्य विधियों के समान रूप से अच्छी तरह से काम कर सकते हैं) 2 मिलीलीटर युक्त lysis बफर (एक hypotonic समाधान है जो विभिन्न प्रकार से नाभिक सहित organelles में कोशिका झिल्ली lyses) (10 मिमी Tris 7.5 पीएच, 15 मिमी NaCl, और 0.15% v / v Nonidet P-40 [एनपी-40] विआयनीकृत पानी प्लस मैं protease और फॉस्फेटलिए nhibitor मिश्रण: 10 मिमी सोडियम butyrate, 0.1 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड [PMSF], 0.2 मिमी ना 3 4 VO, 0.1 मिमी NAF और 1 Roche protease pellet/10 मिलीलीटर lysis बफर संग्रहित किया जा सकता है -20 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए ). (नोट: हम यह आवश्यक पीबीएस के साथ दिल छिड़कना नहीं मिल रहा है, हमारे मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा के रूप में और जाने विश्लेषण predominately cardiomyocyte में मूल [3.8E-22-p मूल्य] रूप में रक्त संदूषण विरोध [पी मूल्य 5.0 के रूप में प्रोटीन की पहचान E-2]).
  2. 100 सुक्ष्ममापी झरनी के माध्यम से lysate डालो और 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा. इस बिंदु पर, जब तक निर्दिष्ट, नमूना बर्फ पर रखा जाना चाहिए.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 4000 rpm पर अपकेंद्रित्र
  4. तैरनेवाला निकालें. (यह cytosol है, और -80 पर रखा जाना चाहिए ° सी. यह lysed mitochondria शामिल हैं.) द्वारा triturating 200 μl lysis बफर में Resuspend गोली. (यह कच्चे परमाणु गोली है.)
  5. Sucrose शौकीन के 1 मिलीलीटर के साथ 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब भरेंएर (24% sucrose वजन / मात्रा, 10 मिमी Tris 7.5 पीएच, और 15 मिमी NaCl / protease फॉस्फेट अवरोध करनेवाला मिश्रण के साथ विआयनीकृत पानी में sucrose बफर उपयोग के दिन पर नए सिरे से बनाया जाना चाहिए). Sucrose पैड और अपकेंद्रित्र के शीर्ष पर धीरे resuspended गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 5000 rpm पर परत
  6. शीर्ष पर पतली फिल्म sucrose पैड (जो झिल्ली होते हैं) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से निकालें. शेष 200 μl ठंडा पीबीएस / EDTA (1 मिमी EDTA के साथ 1x पीबीएस) के साथ गोली कुल्ला. (यह नाभिक गोली है और या solubilized पश्चिमी सोख्ता या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में उपयोग के लिए तय किया जा सकता है [चरणों का 4.1 और 4.2 देखें] संवर्धन मात्रा ठहराना.)

2. Nucleoplasm और डिटर्जेंट निकाले Chromatin Fractionation

कच्चे तेल नाभिक गोली एक nucleoplasm और डिटर्जेंट निकाले chromatin अंश में विभाजित है, प्रोटीन युक्त शिथिल डीएनए के साथ जुड़ा हुआ है.

  1. 1.6 कदम से 200 μl डिटर्जेंट निष्कर्षण बफर (2 में गोली महीन चुर्ण बनाना0 मिमी HEPES पीएच 7.6, 7.5 मिमी MgCl 2. 0.2 मिमी EDTA, 30 मिमी NaCl, 1 एम यूरिया, 1% NP-40 / protease फॉस्फेट अवरोध करनेवाला मिश्रण के साथ विआयनीकृत पानी में डिटर्जेंट निष्कर्षण बफर के लिए भंडारित किया जा सकता है -20 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए).
  2. भंवर नमूना 2 बार, प्रत्येक 10 सेकंड. 10 मिनट बर्फ पर रखें.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 13,000 rpm पर अपकेंद्रित्र
  4. तैरनेवाला निकालें. (यह nucleoplasm है और -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए). ठंडा PBS / EDTA के साथ गोली कुल्ला. (यह chromatin गोली है.)
  5. Tris, एसडीएस, EDTA बफर के लिए रखा जा सकता है ऊपर से कम एक सप्ताह के लिए - 300 μl Tris, एसडीएस, EDTA बफर (50 मिमी Tris 7.4 पीएच, 10 मिमी EDTA, / protease फॉस्फेट अवरोध करनेवाला मिश्रण के साथ विआयनीकृत पानी में 1% एसडीएस में गोली महीन चुर्ण बनाना ° सी -20).
  6. प्रत्येक 10 डीएनए तोड़ सेकंड के लिए 3-6 बार Sonicate. Sonications के बीच बर्फ पर नमूना रखें.
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 13,000 rpm पर अपकेंद्रित्र तैरनेवाला रखें. (तैरनेवाला डिटर्जेंट निकाले chromatin प्रोटीन fraction और -80 डिग्री सेल्सियस) में रखा जाना चाहिए. शेष गोली छोटे हो और त्याग किया जा सकता है चाहिए.
  8. पूरे दिल की बजाय पृथक myocytes का उपयोग: चूहे पिल्ले एक दिन से enzymatic पाचन, बाद में संस्कृति Dulbecco 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ संशोधित ईगल (DMEM) मध्यम, 1% इंसुलिन का उपयोग कर जन्म के बाद नवजात चूहे वेंट्रिकुलर myocytes अलग transferrin सोडियम (आईटीएस), Selenite, और 1% पेनिसिलिन. 24 घंटे के बाद, सीरम मुक्त मीडिया (ऊपर के रूप में ही है, लेकिन FBS कमी) के लिए स्थानांतरण. Lysis बफर में हार्वेस्ट कोशिकाओं (1.1 में सूचीबद्ध), और 1.3 कदम पर परमाणु fractionation शुरू करते हैं.

3. Fractionation एसिड निष्कर्षण - डीएनए बाध्य प्रोटीन संवर्धन

प्रोटीन के लिए एक अलग fractionation enriches कसकर डीएनए के लिए बाध्य histones सहित.

  1. 1.1-2.4 चरणों को दोहराएँ.
  2. 0.4 एन सल्फ्यूरिक एसिड के 400 μl में chromatin गोली महीन चुर्ण बनाना. भंवर के लिए clumps हटाने.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट या overn के लिए सेतेight जबकि घूर्णन.
  4. 4 बजे 10 मिनट के लिए 16,000 XG अपकेंद्रित्र ° C परमाणु मलबे को हटा दें.
  5. एक ताजा ट्यूब तैरनेवाला स्थानांतरण.
  6. Trichloroacetic एसिड की 132 μl तैरनेवाला ड्रॉप - वार जोड़ें. कई बार उलटें. 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र
  8. तैरनेवाला त्यागें. धीरे ठंडा एसीटोन के साथ गोली कुल्ला. (यह histone गोली है.)
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र
  10. धोने दोहराएँ, 3.8-3.9 कदम.
  11. एयर सूखी गोली.
  12. Tris, एसडीएस, EDTA बफर के 100 μl में गोली Resuspend. 8 1 एम Tris जोड़कर पीएच सेट. (1 एम Tris स्टॉक है कि पीएच समायोजित नहीं है का उपयोग करें.)
  13. 15 मिनट के लिए पानी में स्नान Sonicate. पानी स्नान करने के लिए बर्फ जोड़कर overheating रोकें. (यह अंश एसिड निकाले और -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए)

4. पवित्रता जाँचें

पश्चिमी blots और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपीनाभिक और अन्य organelles की कमी के सफल संवर्धन की पुष्टि. निम्न गुणवत्ता नियंत्रण assays के सभी के लिए ठेठ परिणाम देखने के लिए, देखने के लिए कृपया हमारे पिछले प्रकाशन 18.

  1. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रदर्शन. जांच histone H2A या nucleoporin p62 (परमाणु संवर्धन को सत्यापित करने के लिए मार्कर के रूप में), और adenine nucleotide ट्रांसपोर्टर, बीप और ट्यूबिलिन (एक mitochondrial मार्कर, endoplasmic जालिका मार्कर, और cytoskeletal क्रमशः शुद्धता को सत्यापित करने के लिए मार्कर के रूप) के लिए प्रत्येक अंश युक्त झिल्ली. Histone H3 fibrillarin या (डिटर्जेंट और एसिड निकाले chromatin बरकरार नाभिक) और SNRP70 या E2F (nucleoplasm) के लिए नाभिक, जांच, के सफल subfractionation सत्यापित. Retinoblastoma या hypoxia inducible कारक 1 (एसिड निकाले अंश पर डिटर्जेंट निकाले chromatin में समृद्ध) के लिए जांच. HeLa कोशिका lysate और पूरे दिल lysate के अतिरिक्त नियंत्रण के नमूनों को भी इसी जेल में चलाने के लिए किया जा सकता है: Tris, एसडीएस, प्रवर्तन निदेशालय जोड़कर HeLa सेल lysate नियंत्रण तैयारटीए संस्कृति डिश और एक सेल खुरचनी का उपयोग करने के लिए नमूना लेने के लिए बफर. 2.6-2.7 चरणों में के रूप में नमूना Sonicate और अपकेंद्रित्र. 2 मिलीलीटर बफर (20 मिमी Tris पीएच 7.4, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी EGTA, 1% Triton एक्स 100-2.5 मिमी सोडियम पाइरोफॉस्फेट, विआयनीकृत पानी में 1 मिमी glycerophosphate दिल homogenizing पूरे दिल lysate नियंत्रण तैयार protease और फॉस्फेट अवरोध करनेवाला मिश्रण के साथ). 2.6-2.7 चरणों में Sonicate और अपकेंद्रित्र. एसडीएस पृष्ठ के लिए प्रोटीन के नमूने की तैयारी के लिए 5 कदम देखें.
  2. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी: lysis बफर में कदम 2% gluteraldehyde में 1.6 से नाभिक गोली Resuspend और 4 में नमूना तय ° सी. Osmic एसिड में नमूने कुल्ला, निर्जलीकरण, और epoxy राल में एम्बेड. 70 एनएम एक रीचर्ट Ultracut ultramicrotome का उपयोग कर के स्लाइस काटें. Uranyl एसीटेट और फिर नेतृत्व और छवि एक JEOL 100CX ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग में नमूने दाग. Imaged सामग्री के कुल क्षेत्र बनाम बरकरार नाभिक के क्षेत्र को मापने के द्वारा संवर्धन यों हम करने के नाभिक की 60-80% पाते हैं.बरकरार है 14.

समृद्ध बनाने के बनाम नाभिक सफ़ाई के लिए महत्वपूर्ण विचार. यह प्रोटोकॉल का बीमारी के दौरान वैश्विक जीन विनियमन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के उद्देश्य के लिए हृदय chromatin की प्रोटिओमिक विश्लेषण को सक्षम करने के लिए विकसित किया गया था. पूरे proteome मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों को डिजाइन करने का एक प्रमुख घटक गतिशील रेंज और कम बहुतायत प्रोटीन की पहचान करने और सक्षम विशेषताएँ होने का मुद्दा है. परमाणु और chromatin विशिष्ट जीव विज्ञान पर जानकारी प्रदान करने, परमाणु proteome के लिए समृद्ध बनाने के प्राथमिक लक्ष्य के अलावा, इन कम बहुतायत प्रोटीन का पता लगाने के likeliness बढ़ जाती है, के रूप में के नाभिक आगे subfractionation करता. हालांकि, के रूप में चर्चा की, वयस्क cardiomyocyte एक घने cytoskeletal परमाणु झिल्ली से जुड़े घटक है. हम विश्वास नहीं करते कि हम पूरी तरह से इन अन्य सेलुलर घटकों से नाभिक शुद्ध है. हालांकि, नाभिक के लिए केवल समृद्ध, हम प्राप्त हैएड विश्लेषण के प्रकार को सक्षम करने के लिए एक स्वीकार्य सीमा में वर्णित है.

विशेष रूप से, हम उन्हें इस्तेमाल किया है करने के लिए हमारे कच्चे नाभिक गोली की शुद्धता का आकलन और अंश के 60-80% अक्षुण्ण नाभिक, लगभग 10% mitochondria, और बाकी मलबे हो पाया. इसके अतिरिक्त, हम हमारे बरकरार नाभिक जनसंख्या पर पिछले अध्ययन से पता है कि जब कई myofilaments इस प्रोटोकॉल कुछ (calsarcin-1) प्रोटीन समृद्ध (ट्यूबिलिन और actin के रूप में पश्चिमी द्वारा मापा सहित), एक सच्चे जैविक जनसंख्या का सुझाव नहीं समृद्ध कर रहे हैं हृदय नाभिक में इन प्रोटीन 19.

इसके अतिरिक्त, हम हम chromatin एसिड निकाले अंश में जीन सत्तामीमांसा द्वारा भविष्यवाणी इन प्रोटीनों की भूमिका के लिए वर्तमान में, हो पाया प्रोटीन की तुलना में. महत्वपूर्ण बात है, इस जीन आंटलजी विश्लेषण विभिन्न प्रोटीन के रिश्तेदार बहुतायत (हमारे पश्चिमी धब्बा डेटा के रूप में करता है) के खाते में नहीं ले करता है, लेकिन बल्कि सभी पहचान प्रोटीन (को समृद्ध मायनेएड या नहीं) बराबर के रूप में जब आम रास्ते और सेलुलर डिब्बों की पहचान. हमारे पिछले प्रकाशनों में इन रास्ते और सेलुलर डिब्बों के विश्लेषण में पाया जा सकता है 18,20 सबसे महत्वपूर्ण बात, chromatin एसिड निकाले अंश में संवर्धन की सफलता हमें वयस्क माउस myocyte में 54 histone वेरिएंट की उपस्थिति, 18 की पहचान करने की अनुमति दी जिनमें से कई की पहचान के लिए एक अद्वितीय पेप्टाइड पर भरोसा है, और इस तरह की संभावना के बिना इस संवर्धन प्रोटोकॉल कुल cardiomyocyte proteome के भारी जटिलता दिया नहीं गया detectable है. 1048 प्रोटीन हम हृदय नाभिक से पहचान की है, उनमें से 56 (5.3%) विश्लेषण nucleosome (ब्याज के नाभिक का एक घटक) का हिस्सा हो जाओ द्वारा एनोटेट थे. एक और पूरे दिल को देख अध्ययन, 6180 प्रोटीन की पहचान की है, जिनमें से केवल 11 (0.18%) प्रोटीन nucleosome 21 का हिस्सा होने के लिए एनोटेट थे. इस पर आगे meaningfu हमारे प्रोटोकॉल की ताकत दिखाता हैlly परमाणु प्रोटीन के लिए समृद्ध.

5. प्रोटीन जेल और Enzymatic प्रोटीन को पचाने

प्रोटीन एक आयामी एसडीएस पृष्ठ और trypsin मास स्पेक्ट्रोमीटर पर चलाए जा पचा अलग हो रहे हैं.

  1. पिघलना के बर्फ पर नमूने और प्रत्येक bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख का उपयोग नमूना के लिए प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण.
  2. एक ज्ञात एकाग्रता और -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट की दुकान के लिए एक आयामी एसडीएस पृष्ठ के लिए 5x Laemmli बफर, फोड़ा का उपयोग करने के लिए नमूने पतला. एक ज्ञात एकाग्रता -20 डिग्री सेल्सियस पर दो आयामी जैल के लिए यूरिया निष्कर्षण बफर और दुकान का उपयोग करने के लिए नमूने पतला.
  3. प्रत्येक गली में प्रोटीन के बराबर राशि लोड भागो पसंद की जेल. प्रोटीन एक nitrocellulose पश्चिमी सोख्ता (4.1 चरण में नियंत्रण के साथ) या बैंड मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए काटा जा सकता है के लिए इस्तेमाल किया जा झिल्ली को हस्तांतरित किया जा सकता है, निम्नलिखित चरण देखें.
  4. विआयनीकृत पानी का उपयोग करने के लिए यह एक साफ कंटेनर हस्तांतरण तंत्र से जेल निकालें.ओरियल में जेल दाग, लपेटो और एल्यूमीनियम के प्रकाश ब्लॉक पन्नी में कंटेनर कवर. जेल कम से कम 90 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर सेते हैं करने की अनुमति दें.
  5. छवि ओरियल दाग (3 चित्रा) जेल यूवी प्रकाश, और जहां बैंड छवि पर कटौती की जाएगी निशान का उपयोग कर हम 25 कुल proteome मापने के अध्ययन के लिए लगभग 2 मिमी बैंड में प्रत्येक लेन में कटौती.
  6. एक साफ सतह पर जेल रखें. केवल सामग्री है कि सील रखा गया है या इथेनॉल के साथ छिड़काव केरातिन प्रदूषण को रोकने का उपयोग करें. प्रत्येक बैंड कट, और फिर आगे 3 बराबर टुकड़ों में टुकड़ा. अपने खुद के लेबल 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक बैंड के सभी तीन टुकड़े को एक साथ रखें. कई महीनों के लिए जेल टुकड़े -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  7. Enzymatic पाचन के लिए जेल प्लग तैयार. डाइजेस्ट जेल टुकड़े 37 ° रातोंरात सी trypsin का उपयोग कर. विस्तृत जेल नमूना प्रोटोकॉल के लिए हमारे पिछले प्रकाशन 22 आप trypsin के एवज में काइमोट्रिप्सिन के साथ कम आणविक भार बैंड पचा सकते हैं,trypsin histone पूंछ के व्यापक दरार को समाप्त करने के लिए.

6. मास स्पेक्ट्रोमेट्री और डेटा विश्लेषण

नमूने एक नियंत्रण रेखा पर अलग हो रहे हैं और एमएस / एमएस द्वारा विश्लेषण किया. स्पेक्ट्रा प्रोटीन की पहचान के लिए एक प्रोटीन डेटाबेस के खिलाफ खोज रहे हैं.

  1. नियंत्रण रेखा / एमएस / एमएस के माध्यम से प्रत्येक नमूने के 10 μl चलाएँ. हम एक 75 सुक्ष्ममापी रिवर्स चरण स्तंभ के साथ एक नैनो प्रवाह Eskigent नियंत्रण रेखा का उपयोग करें. एक नियंत्रण रेखा प्रोटीन और पेप्टाइड्स की एक श्रृंखला के लिए अनुकूलित रन का प्रयोग करें. मोबाइल चरण से एक रेखीय ढाल रोजगार (0.1% फार्मिक एसिड, 2% acetonitrile पानी में [] ACN) मोबाइल चरण (0.1% फार्मिक एसिड, ACN में 20% पानी) बी: 5% मोबाइल चरण बी से 60 करने के लिए 50 मिनट % बी, तो 15 मिनट और 50% बी से 95% बी अंत में लगातार 95% बी में 10 मिनट 200 nl / मिनट की एक प्रवाह दर का प्रयोग करें. डेटा पर निर्भर एक विधा में जन स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा मोल हम एक थर्मो Orbitrap है कि शीर्ष 6 सबसे प्रचुर मात्रा में माता पिता के आयनों टुकड़े का उपयोग करें.
  2. दोहराएँ कम से कम तीन जैविक के लिए चलाता है और दो तकनीकी replicates. (नि.ecommended)
  3. सॉफ्टवेयर का प्रयोग (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विकल्पों BioWorks और Xcalibur! Publically उपलब्ध विकल्पों में शामिल हैं छिपकर, एक्स अग्रानुक्रम, SpectraST) पसंद की Uniprot डेटाबेस के खिलाफ एक खोज एल्गोरिथ्म (जैसे SEQUEST या शुभंकर के रूप में) के माध्यम से स्पेक्ट्रा खोज.
  4. खोज मापदंडों को संशोधित सिस्टीन carbamidomethylation और methionine ऑक्सीकरण, दो आम नमूना प्रसंस्करण के दौरान बनाया संशोधनों के लिए अनुमति देने पर विचार करें.
  5. एक झूठी सकारात्मक रिवर्स डेटाबेस खोज का उपयोग कर की दर की गणना.
  6. प्रोटीन पहचान फ़िल्टर केवल एक सीमा विश्वास के मैचों को स्वीकार करने के लिए. हम निम्नलिखित मानकों के साथ शुरू करने की सलाह देते हैं: 3> xcorr (+2),> 4 (3),> 5 (4), deltaCN> 0.1, आम सहमति स्कोर ≥ 20, जन मूल आयन के लिए बड़े पैमाने पर सहिष्णुता 2 दा, सहिष्णुता उत्पाद आयन के लिए 0.5 दा, प्रोटीन के प्रति कम से कम 2 अद्वितीय पेप्टाइड्स और कोई और अधिक से अधिक 3 चोली याद किया.

7. लेबल मुक्त Quantitation

Deteलेबल से मुक्त quantitation (चित्रा 4) का उपयोग करने वाले प्रोटीन के रिश्तेदार बहुतायत rmine.

  1. जनगणना (प्रो Yates समूह), 23 (माइक्रोसॉफ्ट) व्याख्याता, 24 चलनी (थर्मो वैज्ञानिक), 25 पाड़ (Proteome सॉफ्टवेयर) सहित मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा के लेबल से मुक्त quantitation के लिए सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के एक नंबर publically या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं 26. इन कार्यक्रमों के लिए बरकरार पेप्टाइड्स या दो या अधिक राज्यों के बीच रिश्तेदार मात्रा के साथ प्रोटीन पेप्टाइड अनुक्रमण घटनाओं की संख्या के बड़े पैमाने पर spectrometric संकेत सहसंबंधी उद्देश्य.
  2. जबकि प्रत्येक कार्यक्रम एक समान विश्लेषण पाइपलाइन को शामिल किया गया है, कुछ कार्यक्रमों विशिष्ट विश्लेषण के प्रकार है कि डेटा पर प्रदर्शन किया जा सकता है के लिए सीमित कर रहे हैं. प्रारंभ में, विभिन्न रन से डेटा गठबंधन किया है, संकेत तीव्रता सामान्यीकृत और पेप्टाइड चोटियों विश्लेषण के लिए चयन कर रहे हैं.
  3. दो सबसे आम तरीकों वर्णक्रमीय गिनती या LC-एमएस शिखर क्षेत्र के आधार पर मात्रा का ठहराव कर रहे हैं. प्रचुरताअनुपात के विभिन्न समूहों के बीच पेप्टाइड बहुतायत में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए गणना कर रहे हैं.
  4. इन कार्यक्रमों में प्रोटिओमिक खोज एल्गोरिदम (शुभंकर, Sequest, एक्स अग्रानुक्रम!) के साथ interfaced होने के लिए प्रोटीन की पहचान करने के लिए मात्रा का ठहराव जानकारी सहसंबंधी कर सकते हैं.
  5. और डेटा की सटीकता reproducibility सुनिश्चित करें कि यह दोनों जैविक (विभिन्न प्रयोगात्मक नमूने) और तकनीकी (मास स्पेक्ट्रोमीटर पर कई बार एक ही नमूना चल रहा है) को शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है बड़े पैमाने पर कल्पना डेटा के replicates.
  6. और प्रयोगात्मक परिस्थितियों के बीच पेप्टाइड बहुतायत के रूपांतर एनोवा द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है और पीसीए (5 चित्रा) के माध्यम से साजिश रची.

लेबल से मुक्त quantitation के लिए महत्वपूर्ण विचार जब लेबल से मुक्त quantitation प्रदर्शन, विशेष ध्यान करने के लिए लगातार नमूना तैयार करने, पाचन समय और LC-MS/MS शर्तों को सुनिश्चित करने के रूप में प्रत्येक नमूना संसाधित किया जाना चाहिए और अलग से विश्लेषण करने के लिए दिया जाना चाहिए. मुलाकात के विपरीतabolic लेबलिंग दृष्टिकोण, लेबल मुक्त प्रयोगों में तुलना अलग मास स्पेक्ट्रोमेट्री रन से डेटा पर बना रहे हैं (क्योंकि लेबलिंग की कमी उन्हें एक साथ चलाने की संभावना obviates), जिससे नमूना विश्लेषण के सभी पहलुओं में उच्च reproducibility necessitating (यानी नमूना प्रस्तुत करने के, नियंत्रण रेखा और एमएस कदम) और उच्च जन सटीकता मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करें.

नमूना तैयार करने और एक ज्ञात मानक विश्लेषण में मामूली परिवर्तन के लिए खाते में प्रत्येक नमूने में जोड़ा जा सकता है डेटा को सामान्य बनाने में सहायता. इसके अतिरिक्त, सबसे सॉफ्टवेयर प्रोग्राम डेटा इंजेक्शन, ionization और विखंडन में अंतर के लिए खाते में अधिग्रहण के बाद संकेत की तीव्रता के मानकीकरण (पृष्ठभूमि शोर या एक ज्ञात प्रचुर मात्रा analyte समायोजन करके उदा) की अनुमति देते हैं. संरेखण एल्गोरिदम ऊपर संदर्भित सॉफ्टवेयर प्रोग्राम कि पेप्टाइड क्षालन प्रोफाइल में अंतर को सही करने में सहायता की अधिकांश में मौजूद हैं. जैविक और तकनीकी replicates उपयोग एस्सेन हैअध्ययन के इस प्रकार में tial, के रूप में यह सांख्यिकीय विश्लेषण और प्रोटीन बहुतायत में किसी भी मनाया परिवर्तन के reproducibility और स्थिरता की पुष्टि करने के लिए अनुमति देता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 4 रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के लिए इस प्रपत्र की उपयोगिता पर प्रकाश डाला गया. बाएं पैनल में दिखाया गया व्यक्ति monoisotopic पेप्टाइड अलग चूहों से मढ़ा चोटियों, है जो प्रोटीन HMGB1 डेटाबेस खोज के माध्यम से पहचान करने के लिए संबंधित के रूप में नामित किया गया है. हर शिखर, दी पेप्टाइड के लिए अनिवार्य रूप से एक निकाले आयन chromatograph, एक अलग माउस से आता है. बेसल, कार्डियक hypertrophy, और दिल की विफलता के साथ तीन प्रत्येक समूह के लिए जैविक replicates समूहों तीन अलग अलग शारीरिक राज्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं. वक्र के अंतर्गत क्षेत्र को एकीकृत करके, एक रिश्तेदार बहुतायत गणना की जा सकती है. इन abundances का औसत मध्यम पैनल में दिखाया गया है. यह विश्लेषण के इस प्रकार कि HMGB1 प्रोटीन की बहुतायत बीमारी के दौरान बदल रहा है से स्पष्ट है. इसके विपरीत, नीचे पैनलों histone H4 का उदाहरण है कि इस बीमारी के साथ बदल नहीं दिखा. दोनों ही मामलों में, पेप्टाइड्स एक ही phenot के जानवरों से आypic राज्य समान क्षालन प्रोफाइल और रिश्तेदार बहुतायत दिखाने के लिए, नमूना तैयार करने और नियंत्रण रेखा / एमएस / एमएस के reproducibility का प्रदर्शन है.

इस तकनीक का reproducibility और प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) का उपयोग करने की पुष्टि की है. एनोवा के विश्लेषण प्रत्येक जानवर की कुल proteome परिणाम के लिए आवेदन के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है, हृदय phenotype (जैविक replicates) द्वारा तकनीकी के बीच यानी संघ (विभिन्न जन कल्पना ही नमूना रन) replicates के साथ ही पशु से अलग क्लस्टरिंग का पता चलता है . यह विश्वास है कि बहुतायत ब्याज की व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए मनाया परिवर्तन वास्तव में कर रहे हैं शारीरिक राज्य में अंतर करने के लिए कारण प्रदान करता है.

और परिणाम की मात्रा का ठहराव reproducibility के रूप में समान महत्व का परमाणु परमाणु subfractionation सक्षम proteome के वृद्धि कवरेज 6 चित्रा है कि विश्लेषण दिखाता है पूरे अकेले नाभिक भी परमाणु प्रोटीन जब अलग डिब्बों (1048 अद्वितीय fractions भर में कुल 428 बरकरार नाभिक से पहचान बनाम पहचान प्रोटीन) से अलग - अलग विश्लेषण के संयोजन की पहचान का एक बहुमत को उजागर करने में विफल रहता है. इसके अलावा, विभिन्न fractions के बीच मध्यम ओवरलैप इन डिब्बों परमाणु समारोह और जीन विनियमन में जोड़ा अंतर्दृष्टि के लिए व्यक्तिगत विचार के जैविक प्रासंगिकता को दर्शाता है. अंत में, की क्षमता के लिए विशेष रूप से fractionate एसिड निकाले या कुंजी histones रूप में chromatin संरचनात्मक प्रोटीन, के लिए chromatin enriches डिटर्जेंट निकाला है, जिससे प्रोटीन के एक समूह पर अधिक ध्यान केंद्रित बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण (जैसे कि लक्ष्य के बाद translational संशोधनों के रूप में) सक्षम बिना प्रत्येक संस्करण और isoform के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है.

94fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/4294/4294fig1.jpg / ">
चित्रा 1. हृदय परमाणु उप डिब्बों में प्रोटीन के लक्षण वर्णन के लिए फ्लो चार्ट homogenized पूरे माउस दिलों. और lysate नाभिक के लिए समृद्ध है. नाभिक nucleoplasm, chromatin डिटर्जेंट निकाले, और एसिड निकाले chromatin fractions में fractionated हैं. प्रत्येक से प्रोटीन अलग कर रहे हैं और एक आयामी एसडीएस पृष्ठ से अलग, और बैंड trypsin पचा और नियंत्रण रेखा / एमएस / एमएस द्वारा चलाए. डेटाबेस खोज के बाद, लेबल मुक्त मात्रा का ठहराव के विभिन्न भागों में प्रोटीन के लिए बहुतायत प्रवृत्तियों की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. परमाणु fractionation योजनाबद्ध नाभिक पूरे दिल homogenate से एक sucrose ढाल के माध्यम से समृद्ध है. प्रत्येक नाभिक नमूना या तो nucleoplasm और डिटर्जेंट निकाले fractions में या एक एसी में विभाजित किया जा सकता हैआईडी - निकाले अंश कि histones के लिए समृद्ध है.

चित्रा 3
चित्रा 3. विभिन्न fractions का एक आयामी जेल पूरे दिल lysate के 20 ग्राम (WHL), अक्षत नाभिक (Nuc), nucleoplasm (Nup), माउस दिल से (डी), chromatin, और एसिड निकाले chromatin अंश (एई) डिटर्जेंट निकाली गई. एसिड HELA कोशिकाओं से निकाले chromatin अंश के साथ साथ एक आयामी एसडीएस पृष्ठ जेल (12% acrylamide) पर चलाने के लिए और ओरियल के साथ दाग. विभिन्न आणविक भार में कुल प्रोटीन की बहुतायत के विभिन्न patterning डिटर्जेंट निकाले chromatin में कम आणविक वजन histones है जो आगे एसिड निकाले भागों में समृद्ध कर रहे हैं के लिए संवर्धन सहित विभिन्न उप डिब्बों, लिए अद्वितीय proteomes के अस्तित्व प्रदर्शित . नोट के अलावा HeLa सेल से AE अंश के काफी कम जटिल प्रकृति हैएस के रूप में दिल से की तुलना में.

चित्रा 4
चित्रा 4. रिश्तेदार बहुतायत मात्रा का ठहराव तीन अलग अलग हृदय राज्यों से चूहे: बेसल (नीला) (लाल) hypertrophy और विफलता (हरा) तीन प्रतियों में एकत्र किए गए थे और उनके प्रोटीन के नमूने दो तकनीकी नियंत्रण रेखा / एमएस / एमएस द्वारा replicates में दौड़ा. एक विशिष्ट पेप्टाइड (स्पेक्ट्रा जिसका सही पर दिखाया गया है) के लिए monoisotopic चोटियों बाईं पर दिखाए जाते हैं. रिश्तेदार बहुतायत एकीकरण द्वारा गणना की गई और प्रत्येक प्ररूपी (मध्यम पैनल) राज्य के लिए दिल की विफलता के विभिन्न राज्यों में पेप्टाइड के रिश्तेदार बहुतायत (और प्रोटीन है, जहां से यह आया) की तुलना की replicates के बीच औसत. शीर्ष पैनल HMGB1, जिसका बहुतायत रोग में बदल से एक पेप्टाइड से पता चलता है, जबकि नीचे पैनल (histone H4) परिवर्तन नहीं करता हैबड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रधानाचार्य घटक विश्लेषण reproducibility प्रत्येक माउस के लिए एनोवा विश्लेषण (जैविक 3 / हृदय राज्य x 2 तकनीकी replicates replicates) पेप्टाइड तीव्रता (axes) के लिए प्लॉट किए जाते हैं पता चलता है. रोग राज्य द्वारा क्लस्टरिंग से पता चलता है (बेसल नीले रंग में लाल रंग में अतिवृद्धि, हरे रंग में विफलता), जो बड़े पैमाने पर कल्पना डेटा और विभिन्न रोग राज्यों के बीच महत्वपूर्ण शारीरिक मतभेदों के सफल reproducibility इंगित करता है.

चित्रा 6
6 चित्रा. ग्लोबल अलग परमाणु उप डिब्बों के लक्षण वर्णन हम सभी 4 fr भर +१,०४८ कुल अद्वितीय प्रोटीन की पहचानकार्रवाई. 146 प्रोटीन सभी 4 भागों से साझा किया गया 749 nucleoplasm में पहचान प्रोटीन, 380 chromatin डिटर्जेंट निकाले अंश में, chromatin एसिड निकाले अंश में, 426 और 428 बरकरार नाभिक में की तुलना में,. वेन आरेख fractions के बीच पहचान प्रोटीन में उदारवादी ओवरलैप दर्शाया गया है, vivo और इस fractionation की क्षमता के लिए उन्हें अलग अलग क्षेत्रों के अस्तित्व पर प्रकाश डाला. इसके अतिरिक्त, कुल परमाणु केवल unfractionated नाभिक (नारंगी) का विश्लेषण करके प्राप्त proteome के स्पष्ट रूप से अधूरा लक्षण वर्णन आगे fractionation को सही ठहराते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पहले परमाणु अलगाव के लिए दो मुख्य तरीकों की समीक्षा की गई है: एक 27 Behrens एक गैर जलीय विलायक में lyophilized ऊतक homogenizing की तकनीक और दूसरा, एक संशोधन जिनमें से हम यहाँ का उपयोग एक जलीय sucrose / नमक के घोल में ऊतक homogenizing की है अंतर या घनत्व ढाल centrifugation द्वारा.

ऊतकों के नमूनों पर एसिड निष्कर्षण द्वारा नाभिक के Subfractionation chromatin जो मूल histones का विश्लेषण किया जा रहा लक्ष्य के साथ 1960, 28 के बाद से इस्तेमाल किया गया है के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है. एसिड निष्कर्षण प्रोटोकॉल कोर nucleosomal histones घटकों सफ़ाई के इस लक्ष्य के लिए विकसित किए गए 29 इन पिछले अध्ययनों की एक सीमा गैर histone का गठन करने, और संशोधित करने, chromatin प्रोटीन पर जानकारी का अभाव है, हम वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ इस चुनौती को संबोधित किया है. नाभिक और chromatin के विशिष्ट जैविक subfractions निस्र्पक के लिए.यह दृष्टिकोण, जो समानांतर में डिटर्जेंट निष्कर्षण या chromatin की एसिड निष्कर्षण का उपयोग करता है chromatin विनियामक अणुओं की विविधता का पता चलता है और अंतर्जात विनियमन के स्तरों के बीच अलग है, जिससे परिकल्पना पीढ़ी के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण के रूप में कार्यरत हैं.

वयस्क myocyte स्थापित एसिड निष्कर्षण पद्धति लागू घने cytoskeleton और बड़े mitochondrial जनसंख्या सहित कुछ बाधाएं बन गया है. जबकि एसिड निष्कर्षण के संस्करणों पूरे दिल 30 ऊतक पर इस्तेमाल किया गया है प्रयोगों एक लक्षित तरीके से अध्ययन करने के लिए जाना जाता है प्रोटीन में आयोजित किया गया, वर्तमान प्रोटोकॉल तैयार की है और निष्पक्ष proteome विश्लेषण सक्रिय करने के लिए मार डाला गया है. इसके अतिरिक्त, हम यह डिटर्जेंट और निकाले एसिड निकाले chromatin अलग (केवल 37% ओवरलैप इन दो भागों proteomes के बीच मनाया गया) बेहतर गतिशीलता समझने के लिए जांच के लिए फायदेमंद पाया गया है जिसके माध्यम से chromatin प्रोटीन int इन आबादियोंडीएनए के साथ eract. अन्य यूरिया आधारित buffers का उपयोग कर प्रोटोकॉल भी वर्णित किया गया है, 31,32 है, जो एसिड की निकासी के लिए पहले प्रदर्शन किया, कम कसकर जीनोम के लिए बाध्य प्रोटीन को समृद्ध. Chromatin भिन्न करने के अलावा, दूसरों subfractionated नाभिक nucleolus को अलग करने के लिए, 33 लेकिन दौरे पूरे दिल से अलग नाभिक के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए subfractionation है की सूचना नहीं किया गया है.

शॉटगन पर प्रोटिओमिक अध्ययन नाभिक बरकरार है कि, unfractionated organelles दौरे ऊतक एक mudpit दृष्टिकोण का उपयोग करने पर किए गए हैं. 15 इस अध्ययन में 1044 परमाणु कार्डियक प्रोटीन की पहचान की है, एक ही पैमाने पर हमारे प्रोटोकॉल के रूप में, लेकिन वे के एक औसत के प्रयोग पर भरोसा 8.5 प्रत्येक रन के साथ 20 घंटा स्थायी कम बहुतायत प्रोटीन का पता लगाने के replicates,. इसके विपरीत, हम subfractionation कार्यरत हैं, जबकि importa (लंबा क्रोमैटोग्राफी हमारे नियंत्रण रेखा रन 85 मिनट की जरूरत के बिना) दोनों वृद्धि से पहचाने जाने योग्य प्रोटीन की संख्याntly भी उप परमाणु स्थानीयकरण और प्रोटीन के रिश्तेदार बहुतायत पर अतिरिक्त जैविक जानकारी की पेशकश की.

एक पूरी माउस दिल (लगभग 0.14 छ) हम बरकरार नाभिक में प्रोटीन का लगभग 1.2 मिलीग्राम (कुल का 0.85%) ठीक से. बरकरार नाभिक से हम प्रत्येक subfractions के लिए निम्न वसूली को प्राप्त करने (नोट: कुल मूल्य 100% से अधिक के रूप में एसिड निष्कर्षण और डिटर्जेंट निष्कर्षण अलग दिल, श्रृंखला में नहीं किया जाता है): Nucleoplasm (15%), डिटर्जेंट (85%), chromatin, और एसिड निकाले chromatin (54%) निकाली गई. तुलना करके, थर्मो वैज्ञानिक एक (परमाणु और cytoplasmic अभिकर्मकों पूर्वोत्तर प्रतिशत) किट जो उनके डाटा शीट माउस दिल के 40 मिलीग्राम से एक साथ 10% पार संदूषण के बीच पैदावार 1.6mg साइटोसोलिक प्रोटीन और 0.6 मिलीग्राम परमाणु प्रोटीन (1.5%) का कहना है दो भागों. सिग्मा एक किट (NXTRACT, CellLytic परमाणु निष्कर्षण किट), जो वे खरगोश पेशी पर परीक्षण किया है, लेकिन दिल नहीं है, और 100 मिलीग्राम 0.4 ऊतकों से बरामदपरमाणु प्रोटीन की क्या वे एक cytoplasmic संदूषण का कुछ प्रतिशत के साथ अपने "कच्चे परमाणु गोली" अवधि में 6 मिलीग्राम (0.46%). Epigentek रूप में अन्य कंपनियों, किट भी प्रदान करते हैं, लेकिन हम संवर्धन और तुलना के लिए अपनी वेबसाइटों पर शुद्धता पर विशिष्ट विवरण को खोजने में असमर्थ थे.

हम एक उपन्यास तकनीक का वर्णन किया है प्रोटिओमिक अध्ययन के लिए हृदय नाभिक के सफल संवर्धन के लिए वर्तमान की जरूरत है पते. हम आगे उप डिब्बे fractionation, जो दोनों कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उच्च संकल्प मात्रा का ठहराव, और प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए दृढ़ संकल्प के लिए अनुमति देता है का पता लगाने की क्षमता बढ़ जाती है के लिए पद्धति का वर्णन. यह अंत करने के लिए, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल सिफारिश की दिशा निर्देशों, लेकिन मामले दर मामले के विचार सबसे अधिक संभावना आवश्यक हो जाएगा प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि हृदय अनुक्रम समानता आवश्यक स्पेक्ट्रा के मैनुअल निरीक्षण के साथ histone संस्करण isoforms की बड़ी संख्या मा आवंटित करने के लिएjor चोटियों और माता - पिता के लिए विश्वास स्पेक्ट्रा प्रदान करने में सक्षम होने से पहले आयन मास की पुष्टि 14 खोज मापदंडों का भी बाद translational संशोधन (PTM) पहचान और उत्कृष्ट समीक्षा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है PTM (PTM संवर्धन सहित विश्लेषण के लिए डेटा की व्याख्या के साथ और विधियों चिंताओं का ब्यौरा मौजूद , 34 PTMs के लिए सॉफ्टवेयर, मिश्रित PTMs, 36 वैकल्पिक विखंडन 37 रणनीतियों और वैकल्पिक पाचन और 38,39 प्रसंस्करण) के 35 विश्लेषण.

संवर्धन और fractionation वर्णित पूरे दिल से (जो जन द्वारा 50-70% cardiomyocyte है) है. जबकि सेल विशिष्टता के इस बलिदान पहलुओं जो परमाणु प्रोटीन के कुछ परिवारों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है, यह उचित buffers, है जो वयस्क myocyte सेल अलगाव प्रोटोकॉल के साथ संभव नहीं है में एक प्रोटीन का बहुत अधिक तेजी से निलंबन के लिए अनुमति देता है. इस तरह, इस पद्धति बेहतर संरक्षित अखंडता ओच ह्रास के खिलाफ नमूना. हालांकि, यह भी वर्णित पृथक नवजात चूहे वेंट्रिकुलर myocytes इस प्रोटोकॉल को लागू करने के बाद से दोनों अलग सेल और पूरे जीव मॉडल दिल की विफलता के अध्ययन के लिए आवश्यक उपकरण हैं करने के लिए निर्देश दिए गए हैं. सिद्धांत रूप में इस पद्धति का भी वयस्क चेतावनी के साथ अलग - दिल है कि प्रोटीन के बंधन में परिवर्तन है कि अलगाव (जो एक घंटे से अधिक समय पिछले कर सकते हैं) के दौरान होने प्रोटिओमिक टिप्पणियों की व्याख्या उलझाना से एंजाइम पाचन द्वारा निकाले myocytes के लिए लागू किया जा सकता है.

हम परमाणु proteome और chromatin श्रृंगार में परिवर्तन है कि रोग के लिए योगदान को समझने के लिए इस पद्धति विकसित करने के लिए हालांकि 14 अन्य अनुप्रयोगों प्रोत्साहन proteome संरचना में सामान्य शरीर विज्ञान में विशिष्ट परिवर्तन का अध्ययन शामिल है. इसके अतिरिक्त, उप fractionation कैसे प्रोटीन काम करते हैं और नाभिक के विशिष्ट कार्यात्मक क्षेत्रों भर में स्थानीयकरण का एक लक्षण के एक नए स्तर के लिए करने की क्षमता प्रदान करता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

प्रयोगशाला Vondriska NIH और UCLA में Laubisch बंदोबस्ती के राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित है. EM जेनिफर एस UCLA में फिजियोलॉजी में Buchwald ग्रेजुएट फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है, कोर्ट एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है, सांसद एक NIH रुथ Kirschstein पोस्ट डॉक्टरेट फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है, और एस एफ के प्राप्तकर्ता है एक NIH K99 पुरस्कार से सम्मानित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbeco Modified Eagle Medium Invitrogen 11965
Protease pellet Roche 04 693 159 001
100 μm strainer BD Falcon 352360
Ultracut ultramicrotome Reichert
100CX Transmission Electron
Microscope		 JEOL USA, Inc.
Oriole BioRad 161-0496
Histone H2A antibody Santa Cruz sc-8648
Nucleoporin p62 antibody BD Biosciences 610498
Adenine nucleotide transporter antibody Santa Cruz sc-9299
BiP antibody Santa Cruz sc-1050
Tubulin antibody Sigma T1568
Histone H3 antibody Abcam ab1791
Fibrillarin antibody Cell Signaling C12C3
SNRP70 antibody Abcam ab51266
E2F-1 antibody Thermo Fisher MS-879
Retinoblastoma antibody BD Biosciences 554136
Hypoxia inducible factor-1 antibody Novus Biologicals NB100-469
BCA protein assay Thermo Scientific 23227
Reverse phase column New Objective PFC7515-B14-10
BioWorks Browser Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
  2. Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
  3. Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
  4. Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
  5. Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
  6. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
  7. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
  8. Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
  9. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
  10. Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
  11. Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
  12. Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
  13. Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
  14. Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
  15. Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  16. Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
  17. Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
  18. Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
  19. Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
  20. Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
  21. Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
  22. Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
  23. Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
  24. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
  25. Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
  26. Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
  27. Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
  28. Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
  29. Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
  30. Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
  31. Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
  32. Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
  33. Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
  34. Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
  35. Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
  36. Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
  37. Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
  38. Wu, C., et al. A protease for 'middle-down' proteomics. Nat. Methods. , (2012).
  39. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).

Tags

चिकित्सा 70 अंक आण्विक जीव विज्ञान इम्यूनोलॉजी आनुवंशिकी जीनोमिक्स फिजियोलॉजी प्रोटीन डीएनए Chromatin हृदय रोग प्रोटिओमिक्स मास स्पेक्ट्रोमेट्री
रोग में Chromatin Proteomes के मात्रात्मक विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monte, E., Chen, H., Kolmakova, M.,… More

Monte, E., Chen, H., Kolmakova, M., Parvatiyar, M., Vondriska, T. M., Franklin, S. Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease. J. Vis. Exp. (70), e4294, doi:10.3791/4294 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter