Summary
Fremskritt innen massespektrometri har tillatt høy gjennomstrømning analyse av protein uttrykk og modifikasjon på en rekke vev. Kombinert med subcellulære fraksjonering og sykdom modeller, kvantitative massespektrometri og bioinformatikk kan avsløre nye egenskaper i biologiske systemer. Metoden er beskrevet her analyserer kromatin-assosierte proteiner i innstillingen av hjertesykdom og er lett anvendelig til andre
Abstract
I kjernen bor de proteomes hvis funksjoner er mest nært knyttet genregulering. Voksen pattedyr cardiomyocyte kjerner er unik på grunn av den høye prosentandel av binucleated celler, 1 har den overveiende heterochromatic tilstanden av DNA, og den ikke-delende natur cardiomyocyte som gjengir voksen atomkjerner i en permanent tilstand av interfase. 2 transkripsjonsregulering under utvikling og sykdom har blitt godt undersøkt i dette organet, 3-5, men det er fortsatt relativt uutforsket er den rollen de kjernefysiske proteiner ansvarlig for DNA emballasje og uttrykk, og hvordan disse proteinene styrer endringene i transcriptional programmer som oppstår under sykdom. 6 I den utviklede verden, er hjertesykdom nummer én årsak til dødelighet for både menn og kvinner. 7 innsikt i hvordan kjernefysiske proteiner samarbeide for å regulere utviklingen av denne sykdommen er avgjørende for å fremme den aktuelle behandlingen options.
Massespektrometri er det ideelle verktøy for å håndtere disse spørsmålene som gjør det mulig for en objektiv annotering av den kjernefysiske proteomet og relativ kvantifisering for hvordan overflod av disse proteinene endringer med sykdom. Mens det har vært flere proteomikk studier for pattedyr kjernefysiske protein komplekser, 8-13 inntil nylig 14 har det vært bare en studie som undersøker hjertets kjernefysiske proteomet, og det anses hele kjernen, snarere enn å utforske proteomet på nivået av kjernefysiske sub avdelinger . 15 I stor grad er dette mangel på arbeid på grunn av vanskeligheter med å isolere hjerte kjerner. Cardiac atomkjerner forekommer innenfor en stiv og tett aktin-myosin apparat som de er forbundet via flere forlengelser fra det endoplasmatiske retikulum, i den grad at myocyte sammentrekning endrer deres samlede form. 16 Dessuten cardiomyocytes er 40% mitokondrier volum 17 som Necessitates anrikning av kjernen bortsett fra de andre organeller. Her beskriver vi en protokoll for hjerte kjernefysisk berikelse og videre fraksjonering i biologisk relevante avdelinger. Videre har vi detaljerte metoder for label-fri kvantitativ massespektrometrisk disseksjon av disse fraksjoner-teknikker mottagelig for in vivo eksperimenter i ulike dyremodeller og organsystemer der metabolske merking er ikke gjennomførbart.
Protocol
Den eksperimentelle arbeidsflyt inneholder sju store trinn (figur 1). For noe arbeid som involverer prøver som skal kjøres på massespektrometer, bør eksperimentator bære en frakk, hansker og hårnett og ta vare å unngå forurensning fra støv og personlig Shedding av keratin.
1. Hjerte Homogenisering og Nuclear Isolation
Muse hjerter er homogenisert og en intakt kjerner pellet er isolert (figur 2).
- Ofre voksen mus, avgiftsdirektoratet hjertet, skyll i iskald PBS og homogenisere på is i glass dounce (vi foretrekker Wheaton Tissue Grinder fra Fisher, # 08-414-13A, men andre metoder kan fungere like godt) inneholdende 2 ml av lyseringsbuffer (en hypoton løsning som differensielt lyserer cellemembranen over organeller inkludert kjernen) (10 mM Tris pH 7,5, 15 mM NaCl, og 0,15% v / v Nonidet P-40 [NP-40] i deionisert vann pluss protease og fosfatase inhibitor blanding: 10 mM natrium butyrat, 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid [PMSF], 0,2 mM Na 3 4 VO, 0,1 mM NaF og 1 Roche protease pellet/10 ml - lyseringsbuffer kan lagres i opp til en uke ved -20 ° C ). (Merk: Det er ikke funnet det nødvendig å perfuse hjertene med PBS, som våre massespektrometri data og GO analyse identifisere proteiner som hovedsakelig cardiomyocyte [p-verdi 3.8E-22] opprinnelse i motsetning til blodsmitte [p-verdi 5,0 E-2].)
- Pour lysatet gjennom 100 um sil og samle strømmen gjennom i 1,5 ml sentrifugerør. På dette punktet, hvis angitt, bør prøven holdes på is.
- Sentrifuger ved 4000 rpm i 5 min ved 4 ° C.
- Fjern supernatant. (Dette er i cytosol, og bør lagres ved -80 ° C. Den inneholder lyserte mitokondriene.) Gjensuspender pellet i 200 pl lysebuffer ved triturating. (Dette er det urene kjernefysiske pelleten.)
- Fyll 1,5 ml sentrifugerør med 1 ml sukrose buffER (24% sakkarose vekt / volum, 10 mM Tris pH 7,5, og 15 mM NaCl i deionisert vann med protease / fosfatase inhibitor blanding - sukrose buffer bør gjort frisk på dagen av bruk). Forsiktig lag den resuspenderte pellet oppå sukrose pad og sentrifuger ved 5000 rpm i 10 min ved 4 ° C.
- Fjerne den tynne filmen på toppen samt sukrose pad (som inneholder membran). Skyll resterende pellet med 200 pl iskald PBS / EDTA (1x PBS med 1 mM EDTA). (Dette er kjernene pellet og kan bli oppløst eller fast for bruk i Western blotting eller elektronmikroskopi [Se trinn 4,1 og 4,2] for å kvantifisere berikelse.)
2. Nucleoplasm og vaskemiddel-ekstrahert Chromatin Fraksjonering
Det urene atomkjerner pelleten blir separert til en nucleoplasm og vaskemiddel-ekstrahert kromatin fraksjon, inneholdende proteiner løst forbundet med DNA.
- Triturate pellet fra trinn 1,6 i 200 pl vaskemiddel ekstraksjon-buffer (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM MgCl 2. 0,2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M urea, 1% NP-40 i deionisert vann med protease / fosfatase inhibitor blanding - vaskemiddel utvinning buffer kan lagres i opp til en uke ved -20 ° C).
- Vortex prøven 2 ganger, 10 sek hver. Sted på is 10 min.
- Sentrifuger ved 13.000 rpm i 5 min ved 4 ° C.
- Fjern supernatant. (Dette er nucleoplasm og bør lagres ved -80 ° C). Skyll pellet med iskald PBS / EDTA. (Dette er den kromatin pelleten.)
- Triturate pellet i 300 pl Tris, SDS, EDTA-buffer (50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1% SDS i deionisert vann med protease / fosfatase inhibitor blanding - Tris, SDS, EDTA buffer kan holdes i opptil en uke på -20 ° C).
- Sonicate 3-6 ganger i 10 sek hver å bryte opp DNA. Hold prøven på isen mellom sonications.
- Sentrifuger ved 13.000 rpm i 5 min ved 4 ° C. Hold supernatant. (Supernatant er vaskemiddel ekstrahert kromatin protein fraction og bør holdes ved -80 ° C). Den gjenværende pellet bør være liten og kan kastes.
- Hvis bruker isolerte myocytter i stedet for hele hjerte: Isoler neonatal rotte ventrikulære myocytter fra rotteunger en dag etter fødselen med enzymatisk fordøyelse, etterfulgt av kultur i Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% insulin -transferrin-natriumselenitt (ITS), og 1% penicillin. Etter 24 timer, overføre til serum-frie medier (samme som ovenfor, men mangler FBS). Høste celler i lyseringsbuffer (oppført i 1,1), og begynne kjernefysisk fraksjonering ved trinn 1.3.
3. Acid-utvinning Fraksjonering - DNA-bundet Protein Enrichment
En separat fraksjonering beriker for proteiner tett bundet til DNA, inkludert histoner.
- Gjenta trinn 01.01 til 02.04.
- Triturate kromatin pelleten i 400 pl av 0,4 N svovelsyre. Vortex å fjerne klumper.
- Inkuber ved 4 ° C i 30 min eller overnight mens den roterer.
- Sentrifuge ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C for å fjerne kjernefysisk avfall.
- Overfør supernatanten til et nytt rør.
- Legg 132 pl trikloreddiksyre dråpevis til supernatanten. Invertere flere ganger. Inkuber på is i 30 min.
- Sentrifuger ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Kast supernatant. Forsiktig skylle pellet med iskald aceton. (Dette er den histone pelleten.)
- Sentrifuger ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Gjenta vask, trinn 3.8 til 3.9.
- Lufttørke pellet.
- Resuspender pelleten i 100 pl Tris, SDS, EDTA-buffer. Still pH til 8 ved tilsetning av 1 M Tris. (Bruk en 1 M Tris lager som ikke er pH-justert.)
- Sonicate i vannbad i 15 min. Forhindre overoppheting ved å legge is til vannbad. (Dette er den syre-ekstraherte fraksjon og bør lagres ved -80 ° C.)
4. Purity Sjekk
Western blot og elektronmikroskopibekreft vellykket anrikning av kjerner og uttømming av andre organeller. Å se typiske resultater for alle de følgende kvalitetskontroll analyser, vennligst se vår forrige publisering. 18
- Utføre Western flekkanalyse. Probe membran som inneholder hver fraksjon for histone H2A eller nucleoporin p62 (som kjernefysiske markører for å bekrefte berikelse), og for adenin nukleotid transporter, BIP og tubulin (som en mitokondrie markør, endoplasmatisk retikulum markør, og cytoskeletal markør henholdsvis å bekrefte renhet). For å bekrefte vellykket subfraksjonering av kjernene, probe for histone H3 eller fibrillarin (vaskemiddel og syreekstraherte kromatin og intakt kjerner) og SNRP70 eller E2F (nucleoplasm). Probe for retinoblastom eller hypoksi induserbar faktor-1 (anriket på vaskemiddel-ekstrahert kromatin løpet syreekstraherte fraksjon). Ytterligere kontrollprøver av HeLa cellelysat og hele hjertet lysate kan også kjøres i samme gel: Forbered HeLa cellelysat kontroll ved å legge Tris, SDS, EDTA buffer til kultur parabol og bruke en celle skrape å samle prøven. Sonicate og sentrifuger prøven som i trinn 2.6 til 2.7. Forbered hele hjertet lysat kontroll ved homogenisering hjertet i 2 ml buffer (20 mM tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM glycerofosfat i deionisert vann med protease og fosfatase inhibitor blanding). Sonicate og sentrifuger som i trinn 2.6 til 2.7. Se trinn 5 for fremstilling proteinprøver for SDS-PAGE.
- Elektronmikroskopi: Resuspender nuclei pellet fra trinn 1,6 i lyseringsbuffer inneholdende 2% gluteraldehyd og fikse prøven ved 4 ° C. Skyll prøver i osmic syre, tørke, og legge i epoxy. Skjær 70 nm skiver ved hjelp av en Reichert ULTRACUT ultramicrotome. Stain prøver i uranyl acetat og deretter bly og bilde ved hjelp av en JEOL 100CX transmisjonselektronmikroskop. Kvantifisere berikelse ved å måle arealet av intakt kjerner versus totalt areal på materiale avbildes. Vi finner 60-80% av kjerner tilvære intakt. 14
Viktige hensyn for berikende versus rensende cellekjerner. Denne protokollen ble utviklet for å muliggjøre proteomikk analyser av kardial kromatin i den hensikt å studere globale genregulering prosessene under sykdom. En viktig del av utformingen av hele proteom massespektrometri eksperimenter er spørsmålet om dynamisk område og være i stand til å identifisere og karakterisere lav overflod proteiner. I tillegg til den primære mål om å gi informasjon om kjernekraft og kromatin-spesifikke biologi, berikende for kjernefysisk proteomet, øker sannsynligheten for å oppdage disse lav-overflod proteiner, som gjør ytterligere subfraksjonering av kjernene. Imidlertid, som diskutert, har voksen cardiomyocyte en tett cytoskeletal komponent koblet til kjernefysiske membran. Vi tror ikke at vi har helt renset kjerner fra disse andre cellulære komponenter. Men ved berikende bare for atomkjerner, har vi fåed en akseptabel terskel å aktivere typer analyser beskrevet.
Spesifikt har vi brukt EM å vurdere renheten av vår råolje kjerner pellet og syntes 60-80% av fraksjonen til å være intakt atomkjerner, omtrent 10% mitokondrier, og resten rusk. I tillegg vet vi fra vår forrige undersøkelse på intakt kjerner befolkningen, at mens mange myofilaments ikke er beriket av denne protokollen (inkludert tubulin og aktin målt ved Western) visse proteiner (calsarcin-1) er beriket, tyder på en sann biologisk populasjon av disse proteiner i den kardiale kjerner. 19
Tillegg, sammenlignet vi proteinene vi funnet å være til stede i syreekstraherte kromatin fraksjon, til de forutsagte rollene disse proteinene etter genet ontologi. Viktigere, ikke dette genet ontologi analysen ikke tar hensyn til den relative overflod av ulike proteiner (som gjør våre vestlige blot data), men heller teller alle proteiner identifisert (berikeed eller ikke) som likeverdige når identifisere felles trasé og cellene. Analyse av disse banene og cellene kan finnes i våre tidligere publikasjoner. 18,20 Viktigst, suksessen av berikelse i syreekstraherte kromatin brøkdel tillatt oss å identifisere tilstedeværelsen av 54 histone varianter i voksen mus myocyte, 18 hvorav mange avhengige én unik peptid for identifikasjon, og dermed ville sannsynligvis ikke er stemt detekterbar uten denne anrikning protokollen gitt enorme kompleksitet totale cardiomyocyte proteom. Av de 1048 proteiner vi identifisert fra den kardiologiske atomkjerner, var 56 av dem (5,3%) kommentert av GO analyse å være en del av den nukleosom (en komponent av kjernen av interesse). Annen studie ser på hele hjertet, identifisert 6180 proteiner, hvorav bare 11 proteiner (0,18%) var annotert å være en del av den 21 nukleosom. Dette ytterligere illustrerer styrken i protokollen vår til meaningfully berike for kjernefysiske proteiner.
5. Protein Gel og Enzymatisk Protein Digest
Proteiner er atskilt med en dimensjonal SDS-PAGE og trypsin digestert kjøres på massespektrometer.
- Tine prøvene på is og bestemme protein konsentrasjon for hver prøve ved hjelp av bicinchoninic syre (BCA) protein analysen.
- Fortynn prøver til en kjent konsentrasjon hjelp 5x Laemmli buffer, kok i 10 min og oppbevar ved -20 ° C i en-dimensjonal SDS-PAGE. Fortynn prøver til en kjent konsentrasjon hjelp urea utvinning buffer og oppbevar ved -20 ° C i to-dimensjonale geler.
- Kjør gel av valget lasting like mye protein i hvert kjørefelt. Protein kan overføres til en nitrocellulosemembran som skal brukes for Western blotting (som med kontroller i trinn 4.1) eller bånd kan bli kuttet for massespektrometri analyse, se følgende trinn.
- Fjern gel fra anordning bruker avionisert vann for å overføre det til en ren beholder.Dekke gel i Oriole flekken, og vikle container i aluminiumsfolie for å blokkere lys. Tillat gel å inkubere ved romtemperatur på en ristemaskin i minst 90 min.
- Bilde Oriole-farget gel (figur 3) med UV-lys, og mark hvor band vil bli kuttet på bildet. Vi kuttet hvert kjørefelt i ca 25 2-mm band for studier som måler den totale proteom.
- Plasser gel på en ren overflate. Bare bruker materialer som har blitt holdt forseglet eller er sprayet med etanol for å hindre keratin kontaminering. Klipp ut hvert band, og deretter videre skjære den i 3 like store emner. Plasser alle tre stykker av hvert band sammen til sin egen merket 1,5 ml tube. Gel brikker kan bli lagret ved -20 ° C i flere måneder.
- Forbered gel plugger for enzymatisk fordøyelse. Digest gel stykker ved hjelp av trypsin ved 37 ° C over natten. For detaljert gel prøve protokollen se vår forrige publisering. 22. Du kan fordøye lav molekylvekt band med chymotrypsin i stedet for trypsin,å eliminere trypsin omfattende spalting av histone haler.
6. Massespektrometri og dataanalyse
Prøver er adskilt på en LC og analysert ved MS / MS. Spektrene søkes mot et protein database for protein identifikasjon.
- Run 10 ul av hver prøve gjennom LC / MS / MS. Vi bruker en nano-flow Eskigent LC med en 75 mikrometer reversfasekolonne. Bruk en LC kjøre optimalisert for en rekke proteiner og peptider. Ansett en lineær gradient fra mobil fase A (0,1% maursyre, 2% acetonitril [ACN] i vann) til mobil fase B (0,1% maursyre, 20% vann i ACN): 60 min fra 5% mobilfase B til 50 % B, deretter 15 min fra 50% B til 95% B, og til slutt 10 minutter ved konstant 95% B. Bruk en strømningshastighet på 200 nl / min. Tilegne massespektrometri data i en data-avhengige modus. Vi bruker en Thermo Orbitrap som fragmenterer de beste 6 mest tallrike foreldre ioner.
- Gjenta løper i minst tre biologiske og to teknisk replikater. (Recommended)
- Bruke programvare (kommersielt tilgjengelige alternativene inkluderer BioWorks og Xcalibur;! Offentlig tilgjengelige alternativene inkluderer luske, X Tandem, SpectraST) for å søke spektra mot Uniprot database med valg via et søk algoritme (for eksempel Sequest eller MASCOT).
- Vurdere å endre søkeparametere for å tillate cystein carbamidomethylation og metionin oksidasjon, to vanlige modifikasjoner opprettet under utvalgets behandling.
- Beregn en falsk positiv rate ved hjelp av omvendt database søking.
- Filtrere protein identifikasjoner å bare akseptere kamper av en terskel tillit. Vi anbefaler følgende for å kunne starte med: Xcorr> 3 (2),> 4 (3),> 5 (4), deltaCN> 0,1, konsensus score ≥ 20, masse toleranse 2 Da for foreldre ion, masse toleranse på 0,5 DA for produktet ion, minst 2 unike peptider per protein og ikke mer enn 3 savnet cleavages.
7. Label-fri Kvantitering
Determine den relative overflod av proteiner ved hjelp label-fri kvantifisering (figur 4).
- En rekke programmer er offentlig eller kommersielt tilgjengelig for label-fri kvantifisering av massespektrometri data inkludert Census (Prof. Yates 'gruppe), 23 Elucidator (Microsoft), 24 SIEVE (Thermo Scientific), 25 Scaffold (Proteome Software). 26 Disse programmene har som formål å korrelere massespektrometrisk signal av intakte peptider eller antall peptid sekvensering hendelser med relative protein mengder mellom to eller flere stater.
- Mens hvert program har en lignende analyse rørledning, er noen programmer er begrenset til de typer spesifikke analyser som kan utføres på dataene. I utgangspunktet er data fra ulike løyper justert, er signal intensitet normalisert og peptid topper er valgt for analyse.
- De to vanligste metodene er kvantifisering basert på spektral telling eller LC-MS peak området. OverflodNøkkeltall beregnes for å bestemme endringer i peptid overflod mellom ulike grupper.
- Disse programmene kan tilkobles med proteomikk søkealgoritmer (Mascot, Sequest, X! Tandem) å korrelere kvantifisering informasjon til protein identifikasjon.
- For å sikre nøyaktighet og reproduserbarhet av dataene er det avgjørende å innlemme både biologiske (ulike eksperimentelle prøver) og tekniske (kjører samme prøven på massespektrometer flere ganger) gjentak av masse spec data.
- Variasjon av peptid overflod i og mellom eksperimentelle betingelser kan vurderes ved ANOVA og plottet via PCA (figur 5).
Viktige hensyn for label-fri kvantifisering. Når du utfører label-fri kvantifisering, må spesiell oppmerksomhet gis for å sikre konsekvent prøveopparbeidelse, fordøyelse tid og LC-MS/MS forhold som hver prøve skal behandles og analyseres separat. I motsetning til Metabolic merking tilnærminger, sammenligninger i etikett-frie eksperimenter er gjort på data fra distinkte massespektrometri kjører (fordi mangelen på merking unngår muligheten for å kjøre dem sammen), og dermed nødvendiggjør høy reproduserbarhet i alle aspekter av prøven analyse (dvs. av prøven prep, LC og MS trinn) og bruk av høye masse nøyaktighet massespektrometre.
Å ta hensyn til små endringer i prøvepreparering og analyse en kjent standard kan tilsettes til hver prøve for å bistå i normalisering av data. I tillegg er de fleste programmer lar normalisering av signal intensitet (f.eks ved å tilpasse seg bakgrunnsstøy eller en kjent rikelig analytt) etter datainnsamling å ta hensyn til forskjeller i injeksjon, ionisering og fragmentering. Justeringsalgoritmer eksisterer i de fleste av de ovenfor refererte programmer som bistår i å korrigere forskjeller i peptid elueringsmiddel profiler. Bruken av biologiske og tekniske replikatene er essenrende i denne typen studier, som gjør det mulig statistiske analyser for å bekrefte reproduserbarheten og konsistensen av eventuelle observerte endringer i protein overflod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 viser nytten av denne formen for relativ kvantifisering. Som vises i venstre panel er de enkelte monoisotopic peptid toppene (kledde fra ulike mus), som har blitt utpekt som tilhører protein HMGB1 (identifisert via databasen søk). Hver topp, i hovedsak en ekstrahert ion kromatograf for den gitte peptid, kommer fra en annen mus. Gruppene representerer tre ulike fysiologiske tilstander: basal, kardial hypertrofi og hjertesvikt, med tre biologiske replikater for hver gruppe. Ved å integrere arealet under kurven, kan en relativ overflod beregnes. I det midtre panelet gjennomsnittet av disse abundances vises. Det er klart fra denne type analyse som den overflod av HMGB1 protein er i endring i løpet av sykdommen. I kontrast, de nederste panelene viser eksempel på histone H4 som ikke endres med sykdom. I begge tilfeller, peptider som kommer fra dyr av samme phenotypic staten viser lignende eluering profiler og relativ overflod, demonstrere reproduserbarheten av prøveopparbeidelse og LC / MS / MS.
Reproduserbarheten av denne teknikken blir ytterligere bekreftet ved hjelp av rektor komponentanalyse (PCA). Som vist i figur 5, avslører anvendelse av ANOVA med totalkostnaden proteom resultatene av hvert dyr analysert en distinkt clustering ved hjertepunktur fenotype (biologisk replikater) med strammeste foreningen mellom teknisk replikater (forskjellig Masse Spek går av samme prøve) fra samme dyr . Dette gir tillit til at overflod observerte endringene for individuelle proteiner av interesse er faktisk skyldes forskjellen i den fysiologiske tilstand.
Av like stor betydning som kvantifisering og reproduserbarheten av resultatene er økt dekning av kjernefysiske proteomet aktivert som kjernefysisk subfraksjonering. Figur 6 illustrerer at analyse av hele kjernen alene ikke klarer å avdekke enda et flertall av de kjernefysiske proteiner identifisert ved kombinasjon individuelle analyser fra de separate rom (1048 unike proteiner identifisert i helheten på tvers av fraksjonene versus 428 identifisert fra intakt kjerner). Videre viser de moderate overlapping mellom de ulike fraksjonene den biologiske relevansen av å vurdere disse avdelingene individuelt for bedre innsikt i kjernefysisk funksjon og genregulering. Endelig, evnen til spesifikt fraksjonerer syre-ekstrahert eller vaskemiddel-ekstrahert kromatin beriker for sentrale kromatin strukturelle proteiner, slik som histoner, og dermed muliggjør mer fokusert massespektrometrisk analyser (for eksempel de som er rettet mot posttranslasjonelle modifikasjoner) på en gruppe av proteiner uten krever spesifikke antistoffer for hver variant og isoform.
94fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/4294/4294fig1.jpg "/>
Figur 1. Flytskjema for karakterisering av proteiner i hjerte atomubåt avdelinger. Hele mus hjerter er homogenisert og lysatet beriket for kjerner. Kjerner er fraksjonert i nucleoplasm, vaskemiddel ekstrahert kromatin, og syreekstraherte kromatin fraksjoner. Proteiner fra hver er isolert og atskilt med endimensjonale SDS-PAGE, og bandene trypsin fordøyd og drives av LC / MS / MS. Etter database søking, er label-fri kvantifisering brukes til å identifisere overflod trender for proteiner i ulike fraksjoner.
Figur 2. Kjernefysisk fraksjonering skjematisk. Nuclei er beriket fra hele hjertet homogenat via en sukrosegradient. Hver kjerner prøve kan enten deles inn nucleoplasm og vaskemiddel-utdraget fraksjoner eller i en acid ekstrahert fraksjon som beriker for histoner.
Figur 3. Endimensjonale gel av de forskjellige fraksjoner. 20fig hele hjertet lysat (WHL), intakt atomkjerner (NUC), nucleoplasm (nup), vaskemiddel-ekstrahert kromatin (DE), og syre-ekstraherte kromatin (AE) fraksjon fra mus hjerte ble kjørt på en en-dimensjonal SDS-PAGE gel (12% akrylamid) sammen med syreekstraherte kromatin fraksjon fra HeLa-celler og farget med Oriole. De ulike mønster av overflod av totalt protein ved de forskjellige molekylvekter demonstrere eksistensen av unike proteomes for de ulike sub avdelinger, herunder berikelse for de lavere-molekylvekt histoner i vaskemiddel ekstrahert kromatin som er ytterligere anriket på syre-ekstraherte fraksjoner . Også av notatet er vesentlig mindre kompleks natur AE fraksjon fra HeLa celles som i forhold til at fra hjertet.
Figur 4. Relative overflod kvantifisering Mus fra tre forskjellige cardiac sier:. Basal (blå) hypertrofi (rød) og fiasko (grønt) ble samlet inn i tre eksemplarer og deres protein prøver løp i to teknisk replikater av LC / MS / MS. Vist til venstre, er monoisotopic toppene for et bestemt peptid (hvis spektra er vist på høyre side). Relative overflod ble beregnet ved integrering og gjennomsnitt mellom replikater av hver fenotypisk tilstand (midtre panel) for å sammenligne den relative overflod av peptidet (og proteinet hvorfra det kom) i de forskjellige tilstander av hjertesvikt. Topplaten viser en peptid fra HMGB1, hvis overflod er forandret på sykdom, mens den nederste panel (Histone H4) ikke endres. Klikk her for å se større figur .
Figur 5. Prinsipal komponent analyse avslører reproduserbarhet. ANOVA analyse for hver mus (3 biologisk replikater / hjerte tilstand x 2 teknisk replikater) plottet for peptid intensitet (akser) viser clustering av sykdomstilstand (basal i blått, hypertrofi i rødt, svikt i grønt), som indikerer vellykket reproduserbarhet av Masse Spek data og betydelige fysiologiske forskjeller mellom de forskjellige sykdomstilstander.
Figur 6. Generell beskrivelse av forskjellige atomubåt avdelinger. Vi identifiserte 1048 totalt unike proteiner på tvers av alle fire frhandlinger. 146 proteiner ble delt av alle fire fraksjoner, mot 749 proteiner identifisert i nucleoplasm, 380 i vaskemiddel ekstrahert kromatin brøkdel, 426 i syreekstraherte kromatin brøkdel, og 428 i den intakte kjerner. Venn-diagram viser de moderate overlapping i identifiserte proteiner mellom fraksjoner, fremhever eksistensen av forskjellige regioner i vivo og evne til denne fraksjonering å isolere dem. I tillegg rettferdiggjør markert ufullstendig karakterisering av den totale kjernefysiske proteomet oppnås ved bare å analysere ufraksjonert kjerner (oransje) ytterligere fraksjonering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
To viktigste metodene for kjernefysisk isolasjon er gjennomgått tidligere: 27 en er Behrens teknikken homogenisere lyofilisert vev i en ikke-vandig løsningsmiddel og andre, er en modifikasjon som vi bruke her, av homogenisering vev i en vandig sukrose / saltoppløsning fulgt av differensial eller tetthet-gradient sentrifugering.
Subfraksjonering av kjernene ved syreekstraksjon på vevsprøver er et viktig verktøy for å studere kromatin som har vært brukt siden 1960, 28 med det opprinnelige målet er å analysere histoner. Acid-utvinning protokollene ble utviklet for dette målet for å rense kjernen nucleosomal histoner komponenter 29 A begrensning av disse tidligere studiene er et fravær av informasjon på de ikke-histonproteiner utgjør, og endre, kromatin;. Vi har adressert denne utfordringen med den gjeldende protokollen for å karakterisere forskjellige biologiske underfraksjonene av kjernen og kromatin.Denne tilnærmingen, som bruker vaskemiddel utvinning eller syre utvinning av kromatin parallelt, avslører mangfoldet av kromatin regulatoriske molekyler og skiller mellom nivåer av endogen regulering, og dermed tjene som en robust metode for hypotese generasjon.
Anvende den etablerte syre-utvinning metodikk til voksen myocyte utgjør visse hindringer, inkludert den tette cytoskjelettet og store mitokondrie befolkningen. Mens versjoner av syre-utvinning har blitt brukt på hele hjertet vev 30 forsøkene ble utført i et målrettet måte å studere kjente proteiner, den gjeldende protokollen er utformet og er utført for å muliggjøre objektiv proteom analyse. I tillegg fant vi det fordelaktig å undersøke vaskemiddel-ekstrahert og syreekstraherte kromatin separat (bare 37% overlapp ble observert mellom proteomes av disse to fraksjoner) for bedre å forstå dynamikken gjennom disse bestandene av kromatin proteiner interact med DNA. Andre protokoller bruker urea-baserte buffere har også blitt beskrevet, 31,32 som, utført før syreekstraksjon, berike proteiner mindre tett bundet til genomet. I tillegg til kromatin fraksjoner, andre har subfractionated kjernen å isolere kjerne, 33 men subfraksjonering for massespektrometri analyse av myokardisk kjerner isolert fra hele hjerter har ikke blitt rapportert.
Hagle proteomikk studier på intakt kjerner, det vil si ufraksjonert organeller-er utført på hjerteinfarkt vev ved hjelp av en MudPIT tilnærming. 15 Denne studien identifiserte 1044 kjernefysiske kardiale proteiner, på samme skala som protokoll vår, men de stolte på med en gjennomsnittlig 8,5 gjentak, med hvert løp som varer 20 timer for å oppdage lav overflod proteiner. I kontrast, benyttet vi subfraksjonering, å både øke antallet identifiserbare proteiner (uten langvarig kromatografi-våre LC løper er 85 min) mens importantly også tilby ytterligere biologisk informasjon på sub-kjernefysiske lokalisering og relative overflod av proteiner.
Fra en hel mus hjerte (ca. 0,14 g) vi gjenopprette ca 1,2 mg (0,85% av total) av protein i intakt kjerner. Fra intakt kjerner vi oppnå følgende gjenoppretting for hver av de underfraksjonene (Merk: de totale verdiene overstiger 100% som syre-ekstraksjon og vaskemiddel-utvinning er gjort på separate hjerter, ikke i serie): Nucleoplasm (15%), vaskemiddel- ekstrahert kromatin (85%), og syre-ekstraherte kromatin (54%). Til sammenligning har Thermo Scientific et kit (NE-PER Kjerne-og Cytoplasmisk reagenser) som deres datablad sier utbytter 1.6mg cytosolprotein og 0,6 mg kjernefysisk protein (1,5%) fra 40 mg mus hjerte med en 10% kryssforurensning mellom de to fraksjoner. Sigma har sett (NXTRACT, CellLytic Nuclear Extraction Kit) som de har testet på kanin muskler, men ikke hjertet, og utvinnes fra 100 mg vev 0,46 mg av kjernefysisk protein (0,46%) i det de kalle deres "rå kjernefysisk pellet" med en "noen få prosent" av cytoplasmatisk forurensning. Andre selskaper, for eksempel Epigentek tilbyr også kits, men vi klarte ikke å finne spesifikke detaljer om berikelse og renhet på sine nettsider for sammenligning.
Vi har beskrevet en ny teknikk for å løser dagens behov for vellykket berikelse av hjerte kjerner for proteomikk studier. Vi videre beskrive metodikk for sub kupé fraksjonering, som både øker evnen til å oppdage mindre rikelig proteiner samt muliggjør høyere oppløsning, kvantifisering og bestemmelse av protein lokalisering. For dette formål, tilbyr protokollen for massespektrometri analyse anbefalte retningslinjer, men sak-til-sak hensyn vil mest sannsynlig være nødvendig. For eksempel fant vi at det store antallet hjerte histone variant isoformer med sekvenslikhet kreves manuell inspeksjon av spektrene å tildele maJor topper og bekrefte foreldre ion mass før å kunne trygt tildele spektrene. 14 Søk parametere kan også tilpasses for posttranslasjonelle modifikasjon (PTM) identifisering og gode vurderinger eksisterer detaljering metoder og bekymringer med tolking for PTM analyse (inkludert PTM berikelse , 34 programvare for PTMs, 35 analyse av kombinatoriske PTMs, 36 alternative fragmentering strategier 37 og alternativ fordøyelse og prosessering 38,39).
Berikelse og fraksjonering beskrives er fra hele hjertet (som er 50-70% cardiomyocyte av masse). Mens denne slaktoffer aspekter celle spesifisitet som kan være spesielt viktig for visse familier av kjernefysiske proteiner, gir det mulighet for en langt hurtigere suspensjon av proteinene ordentlige buffere, som ikke er mulig med voksen myocyte celleisolasjon protokoller. På denne måten, bevarer denne metodikken bedre integriteten of prøven mot nedbrytning. Men også beskrevet er instruksjoner for å bruke denne protokollen til isolerte neonatale rotter ventrikulære myocytes, siden begge isolert-celle og hele organismen modeller er nødvendige verktøy for å studere hjertesvikt. I prinsippet denne metoden kan også brukes til voksne myocytes utvunnet av enzymet fordøyelsen fra isolerte hjerter-med det forbeholdet at endringer i proteinbinding som oppstår under isolasjon (som kan vare over en time) vil forvirre tolkning av proteomikk observasjoner.
Vi utviklet denne metoden for å forstå endringene i det kjernefysiske proteomet og kromatin makeup som bidrar til sykdom. 14 Men andre bruksområder er å studere stimulus-spesifikke endringer i proteomet sammensetning i normal fysiologi. I tillegg tilbyr sub-fraksjonering muligheten for et nytt nivå av karakterisering av hvordan proteinene operere og lokalisere tvers distinkte funksjonelle regioner av kjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Den Vondriska lab er støttet med tilskudd fra National Heart, Lung and Blood Institute of NIH og Laubisch Endowment ved UCLA. EM er mottaker av Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship i fysiologi ved UCLA, HC er mottaker av en American Heart Association Pre-doc, MP er mottaker av en NIH Ruth Kirschstein post-doc, og SF er mottaker av en NIH K99 Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | ||
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | ||
| Oriole | BioRad | 161-0496 | |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 | |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
- Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
- Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
- Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
- Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
- Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
- Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
- Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
- Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
- Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
- Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
- Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
- Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
- Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
- Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
- Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
- Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
- Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
- Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
- Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
- Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
- Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
- Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
- Wu, C., et al. A protease for 'middle-down' proteomics. Nat. Methods. , (2012).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).
