Summary
Avanços na espectrometria de massa permitiu a análise de alto rendimento de expressão da proteína e da modificação de uma série de tecidos. Combinada com fraccionamento subcelular e modelos de doença, a massa espectrometria quantitativa e bioinformática pode revelar novas propriedades nos sistemas biológicos. O método aqui descrito analisa cromatina proteínas associadas na definição de doença cardíaca e é prontamente aplicável a outras
Abstract
No núcleo residem os proteomas cujas funções são mais intimamente ligada com a regulação dos genes. Núcleos de cardiomiócitos de mamíferos adultos são únicos, devido à alta porcentagem de células binucleadas, um estado predominantemente heterocromático do DNA, ea natureza não-divisão da cardiomiócitos que torna núcleos de adultos em um permanente estado de interfase. Regulação transcricional 2 durante o desenvolvimento e doença têm sido bem estudado neste órgão, 3-5 mas que continua a ser relativamente pouco explorado o papel desempenhado pelas proteínas nucleares responsáveis pela embalagem de ADN e de expressão, e como estas proteínas controlar alterações em programas de transcrição que ocorrem durante a doença. 6 No desenvolvido mundo, a doença cardíaca é a causa número um de morte para homens e mulheres. 7 dicas sobre como proteínas nucleares cooperar para regular a progressão da doença é fundamental para o avanço do atual tratamento oPÇÕES.
Espectrometria de massa é a ferramenta ideal para abordar estas questões, pois permite uma anotação imparcial da quantificação nuclear proteoma e relativo como a abundância destas proteínas mudanças com a doença. Embora tenha havido vários estudos proteômicos para mamíferos complexos proteicos nucleares, 8-13, até recentemente, 14, tem havido apenas um estudo examinando o proteoma nuclear cardíaco, e é considerado todo o núcleo, em vez de explorar o proteoma ao nível dos sub compartimentos nucleares . 15 Em grande parte, esta falta de trabalho é devido à dificuldade de isolar núcleos cardíaca. Núcleos cardíaco ocorrem dentro de uma superfície rígida e densa aparelho actina-miosina ao qual estão ligados através de várias extensões do retículo endoplasmático, na medida em que se altera a contração do miócito sua forma geral. 16 Além disso, os cardiomiócitos são de 40%, em volume, 17 mitocôndrias que necessitates enriquecimento do núcleo além dos outros organelos. Aqui nós descrevemos um protocolo de enriquecimento nuclear cardíaca e fraccionamento em compartimentos biologicamente relevantes. Além disso, os métodos detalhados para a etiqueta livre de dissecção de massa espectrométrica quantitativa destas fracções-técnicas passíveis de experimentação in vivo em vários modelos animais e sistemas de órgãos, onde marcação metabólica não é viável.
Protocol
O fluxo de trabalho experimental contém sete etapas principais (Figura 1). Para qualquer trabalho envolvendo amostras que serão executados no espectrômetro de massa, o pesquisador deve vestir um jaleco, luvas e rede de cabelo e tomar cuidado para evitar a contaminação de poeira e derramamento pessoal de queratina.
1. Homogeneização coração e Isolamento Nuclear
Corações de rato são homogeneizados e um núcleo intacto pellet é isolado (Figura 2).
- Sacrificar rato adulto, extirpar o coração, lavar em PBS gelado, e homogeneizar em gelo em Dounce de vidro (nós preferimos o triturador de tecidos Wheaton de Fisher, # 08-414-13A, mas outros métodos podem funcionar igualmente bem), contendo 2 ml de tampão de lise (uma solução hipotónica qual diferencialmente lisa a membrana celular ao longo dos organelos, incluindo o núcleo) (10 mM Tris pH 7,5, 15 mM NaCl, e 0,15% v / v Nonidet P-40 [NP-40] em água desionizada mais protease e fosfatase imistura nhibitor: 10 mM de butirato de sódio, 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo [PMSF], 0,2 mM Na 3 VO 4, 0,1 mM NaF e uma protease Roche pellet/10 ml - tampão de lise pode ser armazenado durante até uma semana à temperatura de -20 ° C ). (Nota: Nós não achar necessário para perfundir o coração com PBS, como os nossos dados de espectrometria de massa e GO análise identificar as proteínas como predominantemente cardiomiócitos [valor-p 3.8E-22] de origem ao invés de contaminação sanguínea [valor p 5,0 E-2).]
- Despeje lisado a 100 ^ m e recolher o filtro de fluxo através de tubo de centrífuga de 1,5 ml. Neste ponto, a menos que especificado, a amostra deverá ser mantida em gelo.
- Centrifugar a 4000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante. (Este é o citosol, e deve ser armazenado a -80 ° C. Contém as mitocôndrias lisada.) Ressuspender o sedimento em 200 ul de tampão de lise de trituração. (Esta é a nuclear rudimentar pelota.)
- Encher 1,5 ml tubo de centrifugação com 1 ml de sacarose lustreer (peso de 24% de sacarose / volume, Tris 10 mM, pH 7,5, e 15 mM de NaCl em água desionizada com protease / inibidor da fosfatase mistura - tampão de sacarose deve ser feita no próprio dia da utilização). Suavemente a camada de sedimento ressuspenso no topo da almofada de sacarose e centrifugar a 5000 rpm durante 10 min a 4 ° C.
- Remover a película fina no topo, bem como a almofada de sacarose (que contêm membrana). Enxaguar o sedimento restante com 200 ul de PBS gelado / EDTA (1x PBS com EDTA 1 mM). (Este é o núcleo da pelota e podem ser solubilizados ou fixado para uso em microscopia de western blotting ou de electrões [Ver as etapas 4.1 e 4.2] para quantificar o enriquecimento.)
2. Nucleoplasma e extraiu-Detergent Fractionation Cromatina
O sedimento bruto núcleos é separado em um nucleoplasma e detergente-extraída fracção de cromatina, contendo proteínas fracamente associados com o DNA.
- Triturar pellet a partir do passo 1.6 em 200 ul de tampão detergente de extracção (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM MgCl 2. 0,2 mM EDTA, 30 mM de NaCl, 1 M de ureia, 1% de NP-40 em água desionizada com protease / inibidor da fosfatase mistura - de tampão de extracção de detergente pode ser armazenado durante até uma semana à temperatura de -20 ° C).
- Vortex amostra de 2 vezes, 10 segundos cada um. Colocar em gelo 10 min.
- Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante. (Este é o nucleoplasma e deve ser armazenado a -80 ° C). Enxaguar pellet com PBS gelado / EDTA. (Este é o sedimento de cromatina.)
- Tritura-se o granulado em 300 ul de Tris, SDS, tampão de EDTA (50 mM Tris pH 7,4, EDTA 10 mM, SDS a 1% em água desionizada, com protease / inibidor da fosfatase mistura - Tris, SDS, tampão de EDTA pode ser mantido durante até uma semana à -20 ° C).
- Sonicate 3-6 vezes por 10 segundos cada para quebrar o DNA. Mantenha amostra em gelo entre sonicações.
- Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min a 4 ° C. Manter o sobrenadante. (O sobrenadante é o detergente-proteína extraída cromatina fraccionamenton e deve ser mantido a -80 ° C). O sedimento remanescente deve ser pequeno e pode ser eliminada.
- Se usar miócitos isolados, em vez de todo o coração: Isolar miócitos ventriculares de ratos neonatos de crias de rato um dia após o nascimento utilizando digestão enzimática, seguido por cultura em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de insulina -transferrina-selenite de sódio (STI), e 1% de penicilina. Após 24 horas, a transferência para meio isento de soro (o mesmo que acima, mas sem FBS). Células colheita em tampão de lise (listados no 1.1), e começar fracionamento nuclear no passo 1.3.
3. Ácido-extracção Fractionation - DNA-bound Enriquecimento Protein
A separadas enriquece fraccionamento de proteínas de ligação forte com o DNA, incluindo as histonas.
- Repita os passos 1,1-2,4.
- Tritura-se o sedimento em 400 ul de cromatina de 0,4 N de ácido sulfúrico. Vortex para remover aglomerados.
- Incubar a 4 ° C durante 30 min ou overnight durante a rotação.
- Centrifugar a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C para remover os restos nucleares.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo.
- Adicionar 132 ul de ácido tricloroacético a gota a gota, ao sobrenadante. Inverter várias vezes. Incubar em gelo durante 30 min.
- Centrifugar a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Elimine o sobrenadante. Lave pellet com acetona gelada. (Este é o pellet de histona.)
- Centrifugar a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Repita lavagem, as etapas de 3,8-3,9.
- Ar seco pellet.
- Ressuspender o sedimento em 100 ul de Tris, SDS, EDTA. Definir a pH 8 pela adição de 1 M de Tris. (Use um 1 M Tris estoque que não é pH ajustado).
- Sonicar em banho-maria durante 15 min. Evitar o superaquecimento, adicionando gelo para banho-maria. (Isto é a fracção extraídas com ácido e deve ser armazenado a -80 ° C.)
4. Verifique Pureza
Western blot e microscopia eletrônicaconfirmar enriquecimento sucesso dos núcleos e do esgotamento de outros organelos. Para ver os resultados típicos para todos os ensaios de controle de qualidade a seguir, consulte a nossa publicação anterior. 18
- Realizar a análise de Western blot. Membrana sonda contendo cada fracção por H2A histona ou p62 nucleoporin (como marcadores nucleares para verificar enriquecimento), e para transportador de nucleótido de adenina, BiP e tubulina (como um marcador mitocondrial, marcador retículo endoplasmático, e marcador do citoesqueleto, respectivamente, para verificar a pureza). Para verificar subfractionation sucesso dos núcleos de sonda, para a histona H3 ou fibrilarina (detergente e extraídas com ácido núcleos cromatina e intacta) e SNRP70 ou E2F (nucleoplasma). Sonda para retinoblastoma ou induzível hipóxia factor-1 (enriquecido em detergente extraído da cromatina ao longo extraídas com ácido e fracção). Amostras adicionais de controle de HeLa lisado celular e lisado de todo o coração também pode ser executado no mesmo gel: Prepare HeLa controle lisado celular adicionando Tris, SDS, EDTA tampão a placa de cultura e utilizar um raspador de células para recolher amostra. Sonicar e centrifugar amostra, tal como nos passos 2,6-2,7. Prepare controle lisado todo coração por homogeneização do coração em 2 ml de tampão (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% de triton X-100, 2,5 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de glicerofosfato em água desionizada com protease e mistura inibidor de fosfatase). Sonicar e centrifugar tal como nos passos 2,6-2,7. Ver passo 5 para a preparação de amostras de proteína por SDS-PAGE.
- Microscopia Electrónica: Ressuspender o pellet núcleos de 1,6 passo em tampão de lise contendo glutaraldeído a 2% e corrigir amostra a 4 ° C. Enxágüe amostras em ácido ósmico, desidratar e incorporar em resina epóxi. Corte 70 fatias nm usando uma Reichert Ultracut ultramicrótomo. Mancha amostras em acetato de uranila e chumbo e imagem usando um Microscópio Eletrônico de Transmissão JEOL 100CX. Quantificar o enriquecimento através da medição da área de núcleos intactos versus área total do material de imagens. Encontramos 60-80% de núcleos deestar intacto. 14
Considerações importantes para enriquecer contra purificar núcleos. Este protocolo foi desenvolvido para permitir análises proteômicas de cromatina cardíaca com o objetivo de estudar os processos de regulação gênica global durante a doença. Um componente importante da concepção de todo o proteoma experimentos de espectrometria de massa é a questão da faixa dinâmica e ser capaz de identificar e caracterizar baixa abundância proteínas. Para além do objectivo principal de fornecer informação sobre a biologia e a cromatina nuclear específica, enriquecendo para o proteoma nuclear, aumenta a probabilidade de detecção destas proteínas de baixa abundância, tal como subfractionation adicional do núcleo. No entanto, como discutido, o cardiomiócito adulto tem uma componente do citoesqueleto denso ligado à membrana nuclear. Nós não acreditamos que temos completamente purificados os núcleos desses outros componentes celulares. No entanto, através do enriquecimento apenas para os núcleos, temos obtered um limite aceitável para permitir que os tipos de análise descrito.
Especificamente, utilizou-EM para avaliar a pureza do nosso bruto núcleos pellet e encontrou 60-80% da fracção a ser os núcleos intactos, cerca de 10% a mitocôndria, e o restante de detritos. Além disso, sabemos do nosso estudo anterior sobre a população núcleos intacta, enquanto que miofilamentos muitos não são enriquecidas por este protocolo (incluindo tubulina e actina medida pelo ocidental) de certas proteínas (calsarcin-1) são enriquecidos, sugerindo uma população verdade biológica estas proteínas nos núcleos cardíaca 19.
Adicionalmente, compararam-se as proteínas que se verificou estar presente na fracção de cromatina extraídas com ácido e, para as funções destas proteínas preditas por ontologia gene. É importante notar que esta análise ontologia gene não leva em conta a abundância relativa das diferentes proteínas (tal como os dados de Western blot), mas antes conta com todas as proteínas identificadas (enriquecered ou não) como igual ao identificar vias comuns e compartimentos celulares. A análise destas vias e compartimentos celulares podem ser encontrados nas nossas publicações anteriores. 18,20 Mais importante ainda, o sucesso do enriquecimento da fracção cromatina extraídas com ácido e permitiu identificar a presença de 54 variantes de histonas no miócito rato adulto, 18 muitos dos que se baseava em um peptídeo único para a identificação e, assim, provavelmente não foram detectáveis sem este protocolo enriquecimento dada a enorme complexidade do proteoma cardiomiócitos total. Dos 1.048 proteínas que identificamos dos núcleos cardíaca, 56 deles (5,3%) foram anotados por análise IR para ser parte do nucleossoma (um componente do núcleo de interesse). Outro estudo que olha o coração todo, identificado 6,180 proteínas, das quais apenas 11 proteínas (0,18%) foram anotados para fazer parte do 21 nucleossoma. Isto ilustra a força do nosso protocolo para meaningfully enriquecer para as proteínas nucleares.
5. Gel de proteína enzimática e Protein Digest
Proteínas são separadas por um dimensional SDS-PAGE e tripsina digerido para ser executado no espectrômetro de massa.
- Descongelar as amostras em gelo e determinar a concentração de proteína de cada amostra utilizando o ácido bicinconínico (BCA) de ensaio de proteínas.
- Diluir as amostras para uma concentração conhecida utilizando tampão de Laemmli 5x, fervendo durante 10 min e armazenar a -20 ° C para uma dimensão de SDS-PAGE. Diluir as amostras para uma concentração conhecida usando tampão de extracção de ureia e armazenar a -20 ° C para os géis bidimensionais.
- Executar gel de escolha carga igual quantidade de proteína em cada pista. A proteína pode ser transferida para uma membrana de nitrocelulose, a ser utilizado para transferência de Western (tal como com os controlos no passo 4.1) ou as bandas podem ser cortados para a análise de espectrometria de massa; ver etapas seguintes.
- Remover gel de aparelho utilizando água desionizada para transferi-lo para um recipiente limpo.Cubra gel em Oriole mancha, e recipiente embrulhe em uma folha de alumínio para bloquear a luz. Permitir que o gel a incubar à temperatura ambiente num agitador durante pelo menos 90 min.
- Imagem de gel Oriole-coradas (Figura 3) usando a luz UV, e marca onde bandas será cortado na imagem. Cortamos cada pista em cerca de 25 bandas de 2 mm para estudos de medição do proteoma total.
- Coloque gel sobre uma superfície limpa. Utilizar apenas materiais que foram mantidos fechados ou são pulverizados com etanol para evitar a contaminação de queratina. Corte cada banda, e posteriormente cortá-la em três partes iguais. Coloque todos os três peças de cada banda juntos em seu tubo ml próprio rotulado 1.5. Pedaços de gel pode ser armazenada à temperatura de -20 ° C durante vários meses.
- Preparar tampões de gel para a digestão enzimática. Digest pedaços de gel utilizando tripsina a 37 ° C durante a noite. Para o protocolo detalhado gel amostra ver nossa publicação anterior 22. Você pode digerir baixas bandas de peso molecular com quimotripsina em vez de tripsina,para eliminar a clivagem extensa tripsina de caudas de histona.
6. Espectrometria de Massa de Análise de Dados e
As amostras são separadas em um LC e analisadas por MS / MS. Os espectros são comparados com uma base de dados de proteínas para a identificação de proteínas.
- Executar 10 ul de cada amostra através de LC / MS / MS. Usamos uma nano-flow Eskigent LC com uma coluna de fase 75 uM inversa. Use uma corrida LC optimizado para uma gama de proteínas e peptídeos. Empregam um gradiente linear de fase móvel A (acetonitrilo 0,1% de ácido fórmico a 2% [ACN] em água) a fase móvel B (0,1% de ácido fórmico, 20% de água em ACN): 60 min a partir da fase B móvel de 5% a 50 B%, em seguida 15 min a partir de 50% de B para B a 95% e finalmente 10 minutos em 95% constante B. Use uma taxa de fluxo de 200 nl / min. Aquisição de dados de espectrometria de massa em um modo de dados-dependente. Usamos uma Orbitrap Thermo que fragmenta os 6 melhores pais íons mais abundantes.
- Repetir corre para pelo menos três biológica e dois técnicos repetições. (Recommended)
- Use um software (opções disponíveis no mercado incluem BioWorks e Xcalibur;! Opções publicamente disponíveis incluem PROWL, X Tandem, SpectraST) para pesquisar no banco de dados espectros UniProt de escolha através de um algoritmo de busca (como Sequest ou mascote).
- Considere modificar os parâmetros de pesquisa para permitir carbamidomethylation cisteína e oxidação da metionina, duas modificações comuns criados durante o processamento da amostra.
- Calcular uma taxa de falsos positivos usando banco de dados de pesquisa inversa.
- Filtrar identificações de proteínas para aceitar apenas partidas de uma confiança limiar. Recomendamos os seguintes parâmetros para começar com: Xcorr> 3 (2),> 4 (3),> 5 (4); deltaCN tolerância> 0,1, a pontuação de consenso ≥ 20, a massa de tolerância de 2 Da para íon pai de massa, de 0,5 Da para o ião do produto, pelo menos, dois péptidos únicos por proteína e não mais de três clivagens perdidas.
7. Etiqueta livre de quantificação
Determine da abundância relativa de proteínas utilizando rótulo isento de quantificação (Figura 4).
- Uma série de programas de software são publicamente ou comercialmente disponível para a etiqueta livre de quantificação de dados de espectrometria de massa, incluindo Censos (grupo do Prof Yates), Elucidator 23 (Microsoft), 24 PENEIRA (Thermo Scientific), 25 de Andaime (Software Proteome). 26 Estes programas visam correlacionar o sinal de espectrometria de massa de peptídeos intactos ou o número de eventos de sequenciamento de peptídeos com quantidades de proteínas relativas entre dois ou mais estados.
- Embora cada programa incorpora um oleoduto análise semelhante, alguns programas são limitadas aos tipos de análise específicos que podem ser realizadas sobre os dados. Inicialmente, os dados dos ensaios diferentes está alinhada, a intensidade de sinal é normalizada e os picos de péptidos foram seleccionados para análise.
- Os dois métodos mais comuns são a quantificação baseada na contagem espectral ou LC-MS da área dos picos. Abundânciaíndices são calculados para determinar mudanças na abundância peptídica entre os diferentes grupos.
- Estes programas podem ser interligados com algoritmos de pesquisa de proteômica (Mascote, Sequest, X Tandem!) Para correlacionar informações de quantificação para identificação de proteínas.
- Para garantir a precisão e reprodutibilidade dos dados é fundamental para incorporar tanto biológicas (diferentes amostras experimentais) e técnicos (executando a mesma amostra no espectrômetro de massa várias vezes) repetições de dados Esp.
- Variação do péptido em abundância e entre as condições experimentais podem ser avaliadas por ANOVA e plotados via APC (Figura 5).
Considerações importantes para etiqueta livre de quantificação. Ao realizar etiqueta livre de quantificação, uma atenção específica deve ser dada para garantir a preparação da amostra consistente, tempo de digestão e condições LC-MS/MS como cada amostra devem ser processados e analisados separadamente. Em contraste com a metabordagens de rotulagem abolic, comparações em etiqueta sem experimentos são feitos em dados de espectrometria de massa, corre (por causa da falta de rotulagem elimina a possibilidade de executá-los juntos), implicando alta reprodutibilidade em todos os aspectos da análise da amostra (ou seja, de preparação de amostras, LC e as etapas de MS) e uso de alta massa espectrômetros de massa de precisão.
Para ter em conta ligeiras alterações na preparação da amostra e análise de um padrão conhecido pode ser adicionado a cada amostra para auxiliar na normalização dos dados. Além disso, a maioria dos programas de software permitem que a normalização das intensidades de sinais (por exemplo, ajustando ao ruído de fundo ou de uma substância conhecida abundante), após a aquisição de dados para levar em conta as diferenças de ionização de injeção, e fragmentação. Algoritmos de alinhamento existem na maioria dos programas de software acima mencionados que ajudam a corrigir as diferenças de perfis de eluição de péptidos. O uso de réplicas biológicas e técnicas é essencial, neste tipo de estudo, uma vez que permite a análise estatística para confirmar a reprodutibilidade e consistência das alterações observadas na abundância de proteínas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 4 evidencia a utilidade desta forma de quantificação relativa. Mostrado no painel da esquerda são os picos de peptídeos individuais monoisotópico (sobreposta de camundongos diferentes), que tenham sido designadas como pertencentes ao HMGB1 proteína (identificados através de pesquisa de banco de dados). Cada pico, essencialmente, um cromatógrafo de iões extraídos para o dado péptido, vem de um rato diferente. Os grupos representam três diferentes estados fisiológicos: hipertrofia, basal cardíaca e insuficiência cardíaca, com três repetições para cada grupo biológico. Através da integração da área sob a curva, a abundância relativa pode ser calculada. No painel do meio a média destas abundâncias é mostrado. É evidente a partir deste tipo de análise que a abundância da proteína HMGB1 está a mudar durante o curso da doença. Em contraste, os painéis inferiores mostram o exemplo da histona H4, que não se altera com a doença. Em ambos os casos, os péptidos provenientes de animais da mesma phenotestado ypic mostram os perfis de eluição semelhantes e abundância relativa, demonstrando a reprodutibilidade da preparação da amostra e LC / MS / MS.
A reprodutibilidade desta técnica é confirmado através da análise de componentes principais (PCA). Como mostrado na Figura 5, a aplicação de ANOVA para os resultados totais proteoma de cada animal analisado revela um agrupamento diferente do fenótipo cardíaco (biológica repetições), com a associação entre a técnica mais apertado repetições (espectro de massa diferente é executado da mesma amostra) a partir do mesmo animal . Isto proporciona confiança em que as alterações observadas abundância de proteínas individuais de interesse são, de facto atribuíveis à diferença no estado fisiológico.
De igual importância como a quantificação e reprodutibilidade dos resultados é o aumento da cobertura do proteoma nuclear activado por subfractionation nuclear. Figura 6 mostra que a análise de o núcleo inteiro sozinho não consegue descobrir mesmo a maioria das proteínas nucleares identificadas quando combinando análises individuais dos compartimentos separados (1048 proteínas específicas identificadas no total entre as fracções contra 428 identificados a partir de núcleos intactos). Além disso, a sobreposição moderadas entre as diferentes frações demonstra a relevância biológica de se considerar estes compartimentos individuais para a introspecção adicionados em função nuclear e regulação dos genes. Finalmente, a capacidade de fraccionar especificamente ácido extraído ou detergente-extraída enriquece cromatina para os principais cromatina proteínas estruturais, tais como histonas, permitindo assim que as análises espectrométricas de massa mais focadas (tais como aquelas que têm como alvo modificações pós-tradução), em um grupo de proteínas sem necessitando de anticorpos específicos para cada variante e isoforma.
94fig1highres.jpg "src =" files/ftp_upload/4294/4294fig1.jpg / "/>
Figura 1. Fluxograma para caracterização de proteínas em cardíacos nucleares subtalhões. Coração de rato inteiras são homogeneizadas eo ligado enriquecido para núcleos. Os núcleos são fracionadas em cromatina nucleoplasma, detergente extraído, e frações de ácido extraídos de cromatina. Proteínas a partir de cada um são isolados e separados por uma dimensão de SDS-PAGE, e as bandas digeridas com tripsina e executado por LC / MS / MS. Após a pesquisa de banco de dados, o rótulo isento de quantificação é utilizado para identificar as tendências abundância de proteínas em diferentes fracções.
Figura 2. Esquemática fracionamento nuclear. Núcleos são enriquecidos de homogeneizado de todo o coração através de um gradiente de sacarose. Cada amostra de núcleos pode ser separado em nucleoplasma e detergente extraídos fracções, ou numa forma de corrente alternadaID-extraído fração que enriquece de histonas.
Figura 3. Unidimensional em gel das fracções diferentes. 20 ^ g de lisado de todo o coração (WHL), núcleos intactos (Nuc), nucleoplasma (NUP), extraiu-detergente cromatina (DE), e extraídas com ácido e cromatina fracção (AE) de coração de rato foram executados em um unidimensional em gel de SDS-PAGE (acrilamida 12%) juntamente com o ácido extraído cromatina fracção de células HeLa e coradas com Oriole. O padrão diferente de abundância de proteína total nas diferentes pesos moleculares demonstrar a existência de proteomas únicas para os diferentes compartimentos, incluindo sub enriquecimento para as histonas menor peso molecular do detergente cromatina extraídas por meio de que são ainda mais enriquecidas nas fracções de ácido extraídos . Também digno de nota é a natureza substancialmente menos complexa da fração de células HeLa AEs quando comparada com a do coração.
Figura 4. Quantificação relativa abundância Ratos de três diferentes estados cardíaca:. Hipertrofia (azul) basal (vermelho) e falha (verde) foram coletados em triplicado e as suas amostras de proteína correu em duas técnicas repetições por LC / MS / MS. Mostrada à esquerda são os picos monoisotópico para um péptido específico (cujos espectros é mostrada no lado direito). Abundância relativa foi calculada por integração e a média entre os replicados de cada estado fenotípico (painel do meio) para comparar a abundância relativa de péptido (e da proteína a partir da qual veio), em diferentes estados de insuficiência cardíaca. O painel superior mostra um péptido a partir de HMGB1, cuja abundância é alterada em doença, enquanto que o painel inferior (histona H4) não muda. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 5. Análise de componentes principais revela reprodutibilidade. Análise ANOVA para cada rato (3 biológica repetições / cardíaca estado x 2 técnica repetições) plotados para a intensidade peptídeo (eixos) mostra o agrupamento por estado de doença (basal em azul hipertrofia, em vermelho, a falha em verde), o que indica reprodutibilidade sucesso dos dados de especificação de massa e significativas diferenças fisiológicas entre os diferentes estados de doença.
Figura 6. Caracterização global de distintas nucleares subtalhões. Identificamos 1.048 proteínas totais exclusivo em todos os fr 4ações. 146 proteínas foram partilhados por todas as quatro fracções, em comparação com 749 proteínas identificadas no nucleoplasma, 380 na fracção de cromatina detergente-extraído, 426 na fracção de cromatina extraídas com ácido, e 428 nos núcleos intactos. O diagrama de Venn mostra a sobreposição moderadas em proteínas identificadas entre as fracções, destacando a existência de regiões distintas in vivo e a capacidade deste fraccionamento para isolá-los. Além disso, a caracterização marcadamente incompleta do proteoma nuclear total alcançável apenas por análise de núcleos não fracionada (laranja) justifica fraccionamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dois principais métodos para o isolamento nuclear foram revistas anteriormente: 27 um é a técnica de homogeneização Behrens tecido liofilizado num solvente não-aquoso e a segunda, uma modificação do que se usar aqui, de homogeneização de tecidos em uma solução aquosa de sacarose / solução salina seguido pelo diferencial ou gradiente de densidade de centrifugação.
Subfractionation dos núcleos por extracção em meio ácido, em amostras de tecidos é uma ferramenta importante para o estudo da cromatina que tem sido utilizada desde 1960, 28, com o objectivo de analisar original sendo histonas. Ácido extração de protocolos foram desenvolvidos para este objetivo de purificar componentes principais nucleosomal histonas 29 Uma limitação desses estudos anteriores é a ausência de informações sobre as proteínas não-histonas constituem, e modificando, cromatina;. Abordamos esse desafio com o protocolo atual para caracterizar diferentes subfrações biológicas do núcleo e da cromatina.Esta abordagem, que utiliza extracção com detergente ou extracção ácida de cromatina em paralelo, revela a diversidade das moléculas reguladoras de cromatina e distingue entre os níveis de regulação endógeno, servindo assim como uma abordagem robusta para a geração de hipóteses.
Aplicando a metodologia estabelecida para a extracção do ácido do miócito adulto coloca certos obstáculos, incluindo o citoesqueleto e densa população mitocondrial grande. Enquanto as versões de ácido extração de ter sido usada em tecido cardíaco todo 30 os experimentos foram realizados de forma direcionada para estudar proteínas conhecidas, o protocolo atual é projetado e foi executado para permitir a análise do proteoma imparcial. Além disso, descobrimos que é benéfico para examinar o detergente extraído e extraídas com ácido e cromatina separadamente (apenas 37% de sobreposição foi observada entre os proteomas destas duas frações) para entender melhor a dinâmica através da qual essas populações de proteínas cromatina interact com DNA. Outros protocolos que utilizam ureia baseados tampões também foram descritos, 31,32 que, realizada antes da extracção com ácido, enriquecer proteínas menos fortemente ligadas ao genoma. Além de fracções de cromatina, outros têm o núcleo subfractionated para isolar os nucléolos, 33 mas subfractionation para análise de espectrometria de massa dos núcleos do miocárdio isolada a partir de corações inteiros não foi relatada.
Estudos de espingarda proteómicos sobre núcleos intactos, isto é, não fraccionada organelos-foram realizados em tecido do miocárdio utilizando uma abordagem MudPIT. 15 Este estudo identificou 1,044 nucleares proteínas cardíacas, na mesma escala que o nosso protocolo, no entanto eles invocada utilizando uma média de 8,5 repetições, com cada corrida com duração de 20 horas para detectar baixa abundância proteínas. Em contraste, foram empregados subfractionation, tanto para aumentar o número de proteínas identificáveis (sem a necessidade de longos cromatografia LC-nossos ensaios são de 85 min), enquanto importaçãontly também oferecer informação biológica adicional sobre a localização sub-nuclear e abundância relativa das proteínas.
A partir de um coração de rato inteiro (aproximadamente 0,14 g) que se recuperar cerca de 1,2 mg (0,85% do total) de proteína nos núcleos intactos. Dos núcleos intactos que conseguir a recuperação a seguir para cada um dos subfrações (Nota: os valores totais excedem 100% como ácido de extracção e detergente-extracção são feitos em corações separados, não em série): Nucleoplasma (15%), detergente- Extraiu cromatina (85%) e extraídas com ácido e cromatina (54%). Por comparação, Thermo Scientific tem um kit (NE-PER Reagentes nuclear e citoplasmática), que a sua folha de dados, diz rendimentos de proteína citosólica 1,6 mg e 0,6 mg de proteína nuclear (1,5%) a partir de 40 mg de coração de rato com um entre 10% a contaminação cruzada as duas fracções. Sigma tem um kit (NXTRACT, Extraction Kit CellLytic nuclear) que tenham testado em músculo de coelho, mas não o coração, e recuperado a partir de 100 mg de tecido 0,46 mg de proteína nuclear (0,46%) no que eles chamam de sua "nuclear rudimentar pelota" com uma "pequena percentagem" de contaminação citoplasmática. Outras empresas, como Epigentek também oferecem kits, no entanto, não foram capazes de encontrar informações específicas sobre o enriquecimento e pureza em seus sites de comparação.
Nós descrevemos uma nova técnica para abordar a necessidade atual para o enriquecimento de sucesso de núcleos cardíaca para estudos de proteômica. Iremos descrever metodologia de fraccionamento do compartimento secundário, que tanto aumenta a capacidade de detectar as proteínas menos abundante, bem como permite a resolução mais elevada, a quantificação ea determinação da localização da proteína. Para este fim, o protocolo para a análise de espectrometria de massa oferece orientações recomendadas, porém caso a caso considerações provavelmente será necessário. Por exemplo, verificou-se que um grande número de variantes de histonas cardíacas isoformas com sequência de inspecção manual exigido similaridade dos espectros para atribuir mapicos Jor e confirmam massa de íons pai antes de ser capaz de atribuir a confiança espectros. 14 parâmetros de pesquisa também podem ser personalizadas para modificações pós-translacionais (PTM) identificação e excelentes críticas existem métodos detalhando e preocupações com a interpretação dos dados para análise da PTM (incluindo o enriquecimento PTM , 34 software para PTMs, 35 análise de PTMs combinatórias, 36 estratégias alternativas de fragmentação 37 e digestão alternativo e processamento 38,39).
O enriquecimento e de fraccionamento descrito é de todo o coração (o que é cardiomiócitos 50-70% em massa). Embora estes aspectos sacrifícios de especificidade das células que podem ser especialmente importantes para certas famílias de proteínas nucleares, que permite a uma suspensão muito mais rápida das proteínas em tampões adequados, o que não é possível com adultos protocolos de isolamento de células do miócito. Desta forma, esta metodologia permite uma melhor preservação da integridade of da amostra contra a degradação. No entanto, também descrito são instruções para aplicar este protocolo para miócitos ventriculares isolados de ratos neonatos, já que ambos os modelos organismo isolado de células e todo são ferramentas necessárias para o estudo de insuficiência cardíaca. Em princípio, este método também pode ser aplicado a miócitos adulto extraídas por digestão enzimática a partir de corações isolados-com a ressalva de que as alterações na ligação às proteínas que ocorrem durante o isolamento (que pode durar mais de uma hora) irão confundir a interpretação das observações proteômicas.
Desenvolvemos esta metodologia para compreender as alterações no proteoma nuclear e composição da cromatina que contribuem para a doença. 14 No entanto outras aplicações incluem o estudo de estímulo alterações específicas no proteoma composição na fisiologia normal. Além disso, o fraccionamento sub-oferece a capacidade para um novo nível de caracterização da forma como as proteínas de operar e localizar entre diferentes regiões funcionais do núcleo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O laboratório Vondriska é apoiado por subsídios do Instituto do Coração, Pulmão e Sangue Nacional do NIH e da Fundação Laubisch na UCLA. EM é destinatário da S. Jennifer Buchwald de Pós-Graduação Sociedade de Fisiologia na UCLA; HC é o destinatário de um American Heart Association Irmandade Pré-doutoramento; MP é o destinatário de um Kirschstein Ruth NIH bolsa de pós-doutorado, e SF é o destinatário de uma NIH K99 Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | ||
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | ||
| Oriole | BioRad | 161-0496 | |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 | |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
- Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
- Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
- Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
- Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
- Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
- Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
- Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
- Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
- Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
- Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
- Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
- Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
- Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
- Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
- Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
- Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
- Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
- Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
- Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
- Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
- Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
- Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
- Wu, C., et al. A protease for 'middle-down' proteomics. Nat. Methods. , (2012).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).
