Summary
وصف الأسلوب هنا يستخدم الحقن المباشر للبكتيريا الممرضة للحشرات في hemocoel من
Abstract
ويعتبر ماندوكا سيكستا، المعروف باسم hornworm التبغ، آفة كبيرة الزراعية، وتغذية النباتات على باذنجاني بما في ذلك التبغ والطماطم. قابلية M. سيكستا اليرقات إلى مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية الممرضة للحشرات 1-5، فضلا عن ثروة من المعلومات المتاحة عن نظام الحشرة المناعة 6-8، وتسلسل الجينوم انتظار 9 جعله كائن نموذج جيد للاستخدام في دراسة المضيف ميكروب التفاعلات خلال المرضية. وبالإضافة إلى ذلك، M. سيكستا يرقات كبيرة نسبيا وسهلة للتلاعب والحفاظ على النسبية في المختبر لأنواع أخرى عرضة للحشرات. حجمها كبير كما يسهل كفاءة الأنسجة / الدملمف استخراج لتحليل استجابة العائل للإصابة.
الأسلوب المعروضة هنا يصف الحقن المباشر للبكتيريا في hemocoel (تجويف الدم) من M. سيكستا اليرقات. هذا النهجيمكن استخدامها لتحليل ومقارنة خصائص الفوعة الأنواع البكتيرية المختلفة، سلالات، أو ببساطة من خلال مراقبة طفرات الوقت حتى الموت الحشرات بعد الحقن. وقد تم تطوير هذه الطريقة لدراسة تسببها Xenorhabdus والأنواع Photorhabdus، والتي عادة ما تربط مع ناقلات الديدان الخيطية كوسيلة للدخول في الحشرات. النيماتودا الممرضة للحشرات تصيب اليرقات عادة عن طريق الجهاز الهضمي أو فتحات الجهاز التنفسي الطبيعية، والافراج عن محتوياتها البكتيرية التكافلية في الدملمف الحشرات (الدم) بعد فترة وجيزة 10. طريقة الحقن الموصوفة هنا يتجاوز الحاجة إلى ناقلات الديدان الخيطية، وبالتالي uncoupling آثار البكتيريا والديدان الخيطية على الحشرات. هذا الأسلوب يسمح للتعداد دقيق للمواد المعدية (الخلايا أو البروتين) في اللقاح، وهو أمر غير ممكن باستخدام طرق أخرى موجودة لتحليل entomopathogenesis، بما في ذلك الخدش 11 و فحوصات السمية عن طريق الفم 12 الأداة المساعدة لطريقة الحقن المباشر كما هو موضح هنا هو تحليل المرضية البكتيرية من خلال رصد وفيات الحشرات. ومع ذلك، يمكن بسهولة هذه الطريقة يتم توسيع لاستخدامها في دراسة آثار العدوى على M. سيكستا الجهاز المناعي. الحشرة يستجيب للإصابة عن طريق كل من الاستجابات الخلطية والخلوية. الاستجابة الخلطية يتضمن الاعتراف البكتيرية المرتبطة أنماط الإنتاج واللاحقة من الببتيدات المضادة للميكروبات المختلفة 7؛ يمكن رصدها في التعبير عن الجينات ترميز هذه الببتيدات لاحقة للإصابة المباشرة عبر استخراج الحمض النووي الريبي والكمية PCR 13. الاستجابة الخلوية للإصابة ينطوي تكوين العقد الجذرية، التغليف، والبلعمة من العوامل المعدية عن طريق hemocytes 6 13 و 14.
Protocol
1. الحشرات تعقيم البيض وتربية
- إعداد النظام الغذائي من جانب أول مجموعة ال 15 للأجار التعقيم المنصوص عليها في 900-1،000 مل O. 2 H مباشرة بعد التعقيم، مع مزيج القمح 166 جم النظام الغذائي والجرثومية الخليط جيدا في الخلاط المختبر. تصب في طبق (أو الأطباق) لتبرد، ثم نقل إلى النظام الغذائي رقائق الألومنيوم، والتفاف بإحكام، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- لدى وصوله، تعقيم M. البيض سيكستا مع 250 مل من محلول التبييض 0.6٪ لمدة 2-3 دقيقة في حامل الزجاج فراغ جهاز تصفية وقارورة مع ورقة مرشح 90 مم، واحيانا اثارة.
- بدوره على الفراغ لاستنزاف حل التبييض وغسل البيض 3-4 مرات مع 250 مل العقيمة O 2 H المقطر في الغسيل.
- نقل البيض إلى ورقة جديدة مم 90 مرشح وضعت في غطاء لوحة بيتري والسماح لهم لتجف حتى أنها لم تعد عصا معا (حوالي 20-30 دقيقة).
- نقل البيض إلى أسفل الحاويات البلاستيكية التي تحتوي على نظام غذائي الحشرات، ووضع ما يقرب من 40 بيضة في كل حاوية(الشكل 1A). يتم فصل البيض من النظام الغذائي لمنع الرطوبة التي يسببها التلوث الفطرية. الحفاظ على البيض حتى 26 ° C مع ضوء HR 16: 8 ساعة الضوئية الظلام. سوف يخفف البيض إلى اللون الأصفر والأبيض قبل الفقس.
- عندما الفقس اكتمال نقل ما يقرب من 25 يرقات بعناية كل لحاويات جديدة مع النظام الغذائي على الجزء السفلي (1B الشكل). من المهم أن تلتقط كل يرقة من القرن الأفريقي الأسود الطويل باستخدام ملقط لتجنب إلحاق الأذى بهم خلال مراحلها التنموية الهشة في وقت مبكر. احتضان لمدة 2 يوم على النحو الوارد أعلاه. بينما الموت اليرقات غير المعتاد في هذه المرحلة، يمكن ملاحظة بعض القتلى أو، على الأرجح، يرقات توقف تنمويا. ينبغي استبعاد مثل هذه الحشرات من مزيد من الدراسة وضحت من قبل التجميد.
- لتجنب السلوكيات أكل لحوم البشر، نقل اليرقات إلى حاويات فردية مع قطع صغيرة من الطعام (الشكل 1C) واحتضان على النحو الوارد أعلاه. رصد نمو الحشرات، البراز استبدال الطعام وتنظيف أووطن من الحاويات كل يوم حتى الخضوع لتساقط اليرقات الثالثة (عادة 6-9 يوم بعد الفقس). هذا هو ال 4 المرحلة الرابعة الطور اليرقي، وتتميز بظهور الكروشيهات الذي يشبه الخطاف الأسود على كل بروز proleg وزيادة المشارب على طول الجسم الحشرات (1D الشكل). قد تختلف اختلافا كبيرا في يرقات الحجم، ولكن عادة تزن 0،15-0،4 ز عند دخول مرحلة الطور ال 4. وينبغي اختيار اليرقات مشابهة من حيث الحجم للحقن.
2. إعداد البكتيريا للحقن
- تنمو سلالة بكتيرية (ق) لفحصها وفقا للإجراءات القياسية لمرحلة النمو التي ترغب في اختبار.
- لفحصها بيليه 500 ميكرولتر من كل سلالة بكتيرية من خلال الدوران لمدة 2 دقيقة في ميكروسنتريفوج في 13000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- خلايا مخزنة resuspend في 1 مل الفوسفات المالحة عقيمة 1X (PBS) وبيليه مرة أخرى على النحو الوارد أعلاه.
- إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X 0.5 مل العقيمة والشرق الأوسط وأفريقياتأكد من أن الكثافة الضوئية (OD) من التعليق. تمييع كل تعليق إلى OD نفسه، إذا لزم الأمر. ويمكن أيضا وسائل الإعلام نمو معقمة يمكن استخدامها لإعادة تعليق خلية والتخفيف بدلا من 1X PBS، إذا رغبت في ذلك.
3. حقن من 4 ال يرقات الطور
- إعداد المسلسل أضعاف التخفيفات 10-سلالة بكتيرية الأولى في 6 آبار من لوحة عيار مكروي 96-1X PBS جيدا في معقمة، وذلك باستخدام معلومات سرية ماصة جديدة لكل التخفيف (الشكل 2A). ينبغي أن الحجم النهائي للتعليق خلية في كل بئر يتجاوز حجم المطلوب للحقن (10 ميكرولتر لكل الحشرات) بالإضافة إلى 20 ميكرولتر لوحة واللقاح (انظر الخطوات 3.2 و 3.7).
- 10 ميكرولتر كل بقعة لمدة 5 التخفيفات (10 -2 من خلال 10 -6) على طول الجزء العلوي من لوحة تحتوي على بيتري المتوسطة النمو المناسبة. إمالة لوحة بحيث تنتشر البقع إلى مركز (الشكل 2B).
- إزالة النظام الغذائي الحشرات والبراز والحشرات مكان في حاويات على الجليد للحوالي 5 دقائق.
- تعقيم الإبرة حقنة وذلك بدهن كل 3 مرات في 2 أنابيب من الإيثانول 70-100٪، تليها أنبوب واحد من العقيمة O 2 H (الشكل 2C). يجب أن يكون حجم السائل كافية لغمر الإبرة.
- Quantitate على تعليق خلية المخففة تحت المجهر باستخدام عدادة الكريات. اعتمادا على اللقاح المطلوب، ووضع 10 ميكرولتر من عيار مكروي المناسبة أيضا (الشكل 2D).
- مسحة السطح الحشرات مع الايثانول 95٪، وحقن الخلية 10 مل التعليق في الحشرات في زاوية (أقل من 45 درجة) وراء واحدة من prolegs البطن. والحرص على عدم ثقب الأمعاء وحقن محتويات فقط تحت طبقة البشرة (2E الشكل). في حين أن بعض الخسائر في الدملمف (واضحة، الأخضر والأزرق السائل) أمر طبيعي، والجسيمات الناشئة سائل أصفر من موقع الحقن تدل على ثقب الأمعاء. إذا حدث هذا، التضحية الحشرات والحصول على يرقة جديدة لإعادةوضعه.
- كرر الخطوة 3.6 للكل الحشرات الباقية في المجموعة الحقن الأولى. إبرة التعقيم ليس من الضروري بين كل الحشرات حقن نفسه مع التخفيف وسلالة من البكتيريا ما لم يحدث التلوث. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام موزع لتكرار قدر أكبر من الاتساق في حجم الحقن بين العينات.
- بعد حقن كل الحشرات مع سلالة الأولى من البكتيريا، كرر الخطوة 3.2، هذه المرة اكتشاف تعليق خلية في منتصف لوحة والسماح لهم تدفق نحو الأسفل (الشكل 2F). احتضان لوحات في درجة حرارة مناسبة والاعتماد المستعمرات تعداد اللقاح. يتم استخدام هذه الخطوة الثانية لطلاء تحقق من لم تلوث عينات أثناء عملية الحقن، حيث أن هذا من شأنه أن يؤدي بأعداد متباينة بين مستعمرة التصفيح الأولى والثانية.
- كرر الخطوات من 3.1 خلال 3.8 لكل سلالة من البكتيريا في التجربة. وأخيرا، وضخ 3-5 الحشرات العقيمة مع 1X PBS باستخدام ster يسودإيل إبرة كمجموعة مراقبة سلبية. احتضان الحشرات في C ° 26 مع ضوء HR 16: 8 ساعة الضوئية الظلام.
- رصد الحشرات البقاء على قيد الحياة على مر الزمن بعد الحقن. ويتميز فاة الحشرات وعدم وجود حركة الطوعية على التحفيز. غالبا ما تظهر الحشرات فقدان الشهية، والإسهال (المائي، والبراز أصفر)، و / أو فقدان المياه ("التعرق") خلال العدوى قبل وفاته، وهذه الخصائص قد تكون الجدير بالذكر أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويصور A سبيل المثال ممثل لفحص الحشرات وفيات في الشكل 3. في هذه التجربة، تم حقن الحشرات مع وحدات مستعمرة تشكيل ما يقرب من 50 (CFU) من أي نوع البرية (ATCC19061) أو سلالة متحولة الموهن (الدوريات طويلة المدى 13) من nematophila Xenorhabdus نمت لمنتصف المرحلة سجل (ن = 6 الحشرات في سلالة). وقد لوحظت الحشرات لحوالي 72 ساعة، وسجلت في المئة من الحشرات حقن لا يزال حيا في كل timepoint. في هذه الحالة، عرضت سلالة موهنة تأخير واضح في قتل الحشرات، والبرية من نوع السلالة قتل جميع اليرقات في غضون 30 ساعة 6 حقن آخر، وذلك قبل وفاة أي يرقة متحولة المصابين.
الشكل 1. تربية الحشرات في التحضير للحقن. A) يتم وضع البيض حوالي 40 ارض تعقيمها في أسفل كوب 5 مع أوقيةالنظام الغذائي العقيمة الحشرات يستريح على سدادة مطاطية. B) يتم نقل عشرون الحشرات حديثة الفقس لأكواب أوقية 5 من النظام الغذائي الحشرة العقيمة في القاع وحضنت لمدة 2 ايام. C) يتم نقل المقبلة الحشرات بشكل فردي ل1OZ أكواب مع النظام الغذائي العقيمة على الجزء السفلي وحضنت حتى تنضج. D) الطور الرابع M. سيكستا اليرقات مع خطوط بارزة على طول الجسم (أعلى) والكروشيهات سوداء على prolegs البطن (أسفل).
الشكل 2. حقن من 4 ال الطور M. سيكستا اليرقات. A) وتخفيفه بشكل متسلسل البكتيريا في لوحة 96-أيضا. B) ومطلي عشرة من التخفيفات microliters متعددة لتعداد اللقاح. C) ويتم تعقيم المحاقن مع 3 يشطف في الإيثانول (2X) والماء المعقم. D) يتم رسمها عشرة microliters من التخفيف المناسبة في المحقنة. E) يتم حقن الخلايا في التعليق ° 45زاوية وراء proleg البطن الأول. F) ومطلي مرة أخرى التخفيفات لتوفير قدر الثاني من اللقاح.
الشكل 3. نتيجة ممثل M. سيكستا حقن الفحص. تم حقن حوالي 50 مستعمرة تشكيل وحدات (CFU) من الخلايا nematophila Xenorhabdus في الطور الثابت (10 ميكرولتر من التخفيف 10 -4) إلى ستة ال 4 الطور M. سيكستا اليرقات في السلالة. تم حقن كل نوع البرية وسلالة متحولة (الدوريات طويلة المدى) مع عيب الفوعة وأنشئت لرصد الحشرات وفيات مع مرور الوقت. وذكرت نتائج كنسبة مئوية قيد الحياة الحشرات مع مرور الوقت (بالساعات). هذه المنحنيات تختلف إحصائيا، بقيمة 0.000458-P من خلال السجل رتبة التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والحقن المباشر للM. سيكستا اليرقات مع البكتيريا الممرضة للحشرات، كما هو موضح هنا، بمثابة وسيلة بسيطة وفعالة لتحليل الفوعة الجرثومية. الأسلوب هو أيضا قابلة للتكيف للغاية لتناسب مختلف المواضيع التجريبية و / أو شروط. يمكن تحضير البكتيريا بطرق مختلفة قبل الحقن. في حالة X. nematophila، وخلايا النوع البري المزروع في المواد الغذائية الغنية المتوسطة (LB) لوريا Bertani-إلى منتصف سجل المرحلة عادة ما تكون أكثر ضراوة، مما أسفر عن مقتل أكثر الحشرات أو في غضون 30 ساعة فقط بعد الحقن. الخلايا في الطور الثابت وعادة ما تستغرق وقتا أطول ل5-10 ساعة قتل اليرقات. على الرغم من مرحلة النمو يؤثر الفوعة، فإن العدد الإجمالي للخلايا حقن يبدو أن أقل أهمية 16، مع قائح نموذجية تتراوح بين 20 إلى 20،000 CFU. في الواقع، في حالة Xenorhabdus والأنواع Photorhabdus، وعدد قليل إلى 5 CFU كافية لقتل الحشرات المضيف 17. من أجل تقييم prope الفوعةrties من الأنواع البكتيرية التي تقاوم التعقيم الإيثانول (الأنواع العصوية على سبيل المثال)، يمكن استخدام الإبر المتاح لحقن كل سلالة فريدة من نوعها في مكان التعقيم الإيثانول (الخطوة 3.4).
تعديلات أخرى قد إلى هذا الأسلوب في تربية تنطوي على تغييرات و / أو التلاعب M. سيكستا، فعلى سبيل المثال، قد يكون تربى على الحشرات أوراق الطماطم أو التبغ كمصدر للغذاء أكثر طبيعية. بدلا من ذلك، مراحل النمو المختلفة للM. يمكن يعاير سيكستا اليرقات بواسطة هذه الطريقة. وقد تم اختيار الطور الرابع اليرقات يعتمد على حجمها الكبير نسبيا، ولكن يمكن أيضا أن حقن يرقات أصغر من هذا الأسلوب. ويمكن حقن الطور الخامس اليرقات، ولكن تغييرات على نظام المناعة خلال هذه المرحلة من التنمية تقديم أواخر 5 يرقات العمر عشر أكثر عرضة من بداية العمر اليرقي الموافق 5 18، تعقيد يحتمل تحليل البيانات.
وأخيرا، فإن الحقن المباشريمكن تكييفها للاستخدام مع أسلوب أنواع الحشرات الأخرى. M. يستخدم سيكستا كمضيف نموذج للأنواع الشديدة الإمراض لأنه أقل عرضة للإصابة من غيرها من الكائنات نموذج (أكثر عرضة)، مثل mellonella غاليريا. G. ويمكن حقن mellonella من الطريقة الموضحة في هذا العمل 19، ومع ذلك، وربما يكون من المفيد أن الأنواع البكتيرية أقل ضراوة مقايسة من Xenorhabdus والأنواع Photorhabdus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر أعضاء الماضية من مختبر غوودريتش وبلير: سامانثا بستان، كولز كيمبرلي، ايرين هربرت-تران، ريتشاردز جريج، ميغان مينار، وبارك Youngjin لما قدموه من مساهمات في تطوير هذا البروتوكول. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية منحة IOS-0950873 والمعاهد الوطنية للصحة الزمالة FAI084441Z NRSA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375" length, point style 2 |
References
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Tobacco Hornworm Genome Project [Internet]. , Baylor College of Medicine. Houston, TX. Available from: http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project (2012).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
