وصف الأسلوب هنا يستخدم الحقن المباشر للبكتيريا الممرضة للحشرات في hemocoel من ماندوكا سيكستا يرقات الحشرات. M. سيكستا هو حشرة المتاحة تجاريا ومدروسة. وبالتالي، هذا الأسلوب يمثل نهجا بسيطة لتحليل التفاعلات المضيفة للبكتيريا من منظور واحد أو الشركاء على حد سواء.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ويعتبر ماندوكا سيكستا، المعروف باسم hornworm التبغ، آفة كبيرة الزراعية، وتغذية النباتات على باذنجاني بما في ذلك التبغ والطماطم. قابلية M. سيكستا اليرقات إلى مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية الممرضة للحشرات 1-5، فضلا عن ثروة من المعلومات المتاحة عن نظام الحشرة المناعة 6-8، وتسلسل الجينوم انتظار 9 جعله كائن نموذج جيد للاستخدام في دراسة المضيف ميكروب التفاعلات خلال المرضية. وبالإضافة إلى ذلك، M. سيكستا يرقات كبيرة نسبيا وسهلة للتلاعب والحفاظ على النسبية في المختبر لأنواع أخرى عرضة للحشرات. حجمها كبير كما يسهل كفاءة الأنسجة / الدملمف استخراج لتحليل استجابة العائل للإصابة.
الأسلوب المعروضة هنا يصف الحقن المباشر للبكتيريا في hemocoel (تجويف الدم) من M. سيكستا اليرقات. هذا النهجيمكن استخدامها لتحليل ومقارنة خصائص الفوعة الأنواع البكتيرية المختلفة، سلالات، أو ببساطة من خلال مراقبة طفرات الوقت حتى الموت الحشرات بعد الحقن. وقد تم تطوير هذه الطريقة لدراسة تسببها Xenorhabdus والأنواع Photorhabdus، والتي عادة ما تربط مع ناقلات الديدان الخيطية كوسيلة للدخول في الحشرات. النيماتودا الممرضة للحشرات تصيب اليرقات عادة عن طريق الجهاز الهضمي أو فتحات الجهاز التنفسي الطبيعية، والافراج عن محتوياتها البكتيرية التكافلية في الدملمف الحشرات (الدم) بعد فترة وجيزة 10. طريقة الحقن الموصوفة هنا يتجاوز الحاجة إلى ناقلات الديدان الخيطية، وبالتالي uncoupling آثار البكتيريا والديدان الخيطية على الحشرات. هذا الأسلوب يسمح للتعداد دقيق للمواد المعدية (الخلايا أو البروتين) في اللقاح، وهو أمر غير ممكن باستخدام طرق أخرى موجودة لتحليل entomopathogenesis، بما في ذلك الخدش 11 و فحوصات السمية عن طريق الفم 12 الأداة المساعدة لطريقة الحقن المباشر كما هو موضح هنا هو تحليل المرضية البكتيرية من خلال رصد وفيات الحشرات. ومع ذلك، يمكن بسهولة هذه الطريقة يتم توسيع لاستخدامها في دراسة آثار العدوى على M. سيكستا الجهاز المناعي. الحشرة يستجيب للإصابة عن طريق كل من الاستجابات الخلطية والخلوية. الاستجابة الخلطية يتضمن الاعتراف البكتيرية المرتبطة أنماط الإنتاج واللاحقة من الببتيدات المضادة للميكروبات المختلفة 7؛ يمكن رصدها في التعبير عن الجينات ترميز هذه الببتيدات لاحقة للإصابة المباشرة عبر استخراج الحمض النووي الريبي والكمية PCR 13. الاستجابة الخلوية للإصابة ينطوي تكوين العقد الجذرية، التغليف، والبلعمة من العوامل المعدية عن طريق hemocytes 6 13 و 14.
البروتوكول
1. الحشرات تعقيم البيض وتربية
- إعداد النظام الغذائي من جانب أول مجموعة ال 15 للأجار التعقيم المنصوص عليها في 900-1،000 مل O. 2 H مباشرة بعد التعقيم، مع مزيج القمح 166 جم النظام الغذائي والجرثومية الخليط جيدا في الخلاط المختبر. تصب في طبق (أو الأطباق) لتبرد، ثم نقل إلى النظام الغذائي رقائق الألومنيوم، والتفاف بإحكام، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- لدى وصوله، تعقيم M. البيض سيكستا مع 250 مل من محلول التبييض 0.6٪ لمدة 2-3 دقيقة في حامل الزجاج فراغ جهاز تصفية وقارورة مع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويصور A سبيل المثال ممثل لفحص الحشرات وفيات في الشكل 3. في هذه التجربة، تم حقن الحشرات مع وحدات مستعمرة تشكيل ما يقرب من 50 (CFU) من أي نوع البرية (ATCC19061) أو سلالة متحولة الموهن (الدوريات طويلة المدى 13) من nematophila Xenorhabdus نمت لمنتصف المرحلة سجل (ن = 6 الحشرات في سلالة). وقد لوحظت الحشرات لحوالي 72 ساعة، وسجلت في المئة من الحشرات حقن لا يزال حيا في كل timepoint. في هذه الحالة، عرضت سلالة موهنة تأخير واضح في قتل الحشرات، وال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
والحقن المباشر للM. سيكستا اليرقات مع البكتيريا الممرضة للحشرات، كما هو موضح هنا، بمثابة وسيلة بسيطة وفعالة لتحليل الفوعة الجرثومية. الأسلوب هو أيضا قابلة للتكيف للغاية لتناسب مختلف المواضيع التجريبية و / أو شروط. يمكن تحضير البكتيريا بطرق مختلفة قبل الحقن. في حالة X. nematophila، وخلايا النوع البري المزروع في المواد الغذائية الغنية المتوسطة (LB) لوريا Bertani-إلى منتصف سجل المرحلة عادة ما تكون أكثر ضراوة، مما أسفر عن مقتل أكثر الحشرات أو في غضون 30 ساعة فقط بعد .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
الكتاب أود أن أشكر أعضاء الماضية من مختبر غوودريتش وبلير: سامانثا بستان، كولز كيمبرلي، ايرين هربرت-تران، ريتشاردز جريج، ميغان مينار، وبارك Youngjin لما قدموه من مساهمات في تطوير هذا البروتوكول. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية منحة IOS-0950873 والمعاهد الوطنية للصحة الزمالة FAI084441Z NRSA.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كاشف | شركة | كتالوج رقم | تعليقات |
| 90 مم رقة الترشيح | WHATMAN | 1001 090 | |
| مرشح الزجاج حامل | ميليبور | XX1004700 | |
| ماندوكا سيكستا البيض | كارولينا البيولوجي التموين | 143880 | |
| الغجر العثة حمية + أجار | النائب Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 أوقية. البلاستيك الحاويات وأغطية | كأس منفردا الشركة | URC55-0090-0090 PL4 | |
| 1 أوقية. البلاستيك الحاويات وأغطية | DART حاوية شركة | 100PC 100PCL25 | |
| 1X PBS | 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 8 مم نا 2 HPO 4، 1،46 ملم KH 2 PO 4، درجة الحموضة 7.4 | ||
| محقنة | هاميلتون | 80208 | 30 عداد، 0،375 "على غرار طول نقطة، 2 |
المراجع
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
