Summary
Den här beskrivna metoden utnyttjar direktinsprutning av entomopatogena bakterier i hemocoel av
Abstract
Manduca sexta, allmänt känd som tobak hornworm, anses vara en betydande jordbruk skadedjur, äter Solanaceae växter som tobak och tomat. Känsligheten av M. sexta larver till en mängd olika entomopatogena bakteriearter 1-5, samt mängd information som finns tillgänglig om insekten immunförsvar 6-8, och i avvaktan på arvsmassa 9 gör det till en bra modell organism för användning i studier värd-mikrob interaktioner under patogenes. Dessutom, M. sexta larver är relativt stora och lätta att manipulera och underhålla i laboratoriet i förhållande till andra mottagliga insektsarter. Sin storlek underlättar också effektiv vävnad / hemolymfa utvinning för analys av värdens svar på infektion.
Den metod som presenteras här beskriver direkt injektion av bakterier i hemocoel (blod hålighet) av M. sexta larver. Detta tillvägagångssättkan användas för att analysera och jämföra virulensen hos olika bakteriella arter, stammar eller mutanter genom att helt enkelt övervaka tiden till död insekt efter injektion. Denna metod har utvecklats för att studera sjukdomsalstrande Xenorhabdus och Photorhabdus arter, som normalt förknippar med nematod vektorer som ett sätt att få tillträde till insekten. Entomopatogena nematoder infektera normalt larver genom naturlig matsmältningssystemet eller respiratoriska öppningar, och släppa sina symbiotiska bakterier innehåll i insekten hemolymfa (blod) kort därefter 10. Injektionen här beskrivna metoden kringgår behovet av en nematod vektor, vilket frikoppling effekterna av bakterier och nematod på insekten. Denna metod tillåter en exakt räkning av infektiöst material (celler eller protein) i inokulatet, vilket inte är möjligt med andra befintliga metoder för analys entomopathogenesis inklusive nicking 11 och muntliga analyser toxicitet 12 Användbarheten av direkt insprutning metoden som beskrivs här är att analysera bakteriell patogenes genom övervakning insekt dödlighet. Emellertid kan denna metod lätt utvidgas för användning vid studier av effekterna av infektion på M. sexta immunsystem. Insekten svarar på infektion via både humorala och cellulära svar. Det humorala svaret innefattar erkännande av bakteriell-associerade mönster och efterföljande produktion av olika antimikrobiella peptider 7, uttrycket av gener som kodar för dessa peptider kan övervakas efter direkt infektion via RNA-extraktion och kvantitativ PCR 13. Det cellulära svar på infektion innebär nodulation, inkapsling och fagocytos av smittämnen som hemocyter 6 13, 14.
Protocol
1. Insect ägg Sterilisering och Uppfödning
- Förbered kost genom att först autoklavering 15 g av den medföljande agar i 900-1,000 ml H 2 O. Omedelbart efter autoklavering, blanda med 166 g vetegroddar kost och blanda väl i en laboratorieblandare. Häll i en skål (eller rätter) svalna, sedan överföra kost till aluminiumfolie, linda hårt, och förvara vid 4 ° C.
- Vid ankomsten, sterilisera M. sexta ägg med 250 ml 0,6% blekmedel lösning för 2-3 minuter i ett glas filterhållare och termos apparater med 90 mm filterpapper under omrörning.
- Slå på vakuum för att dränera blekningslösning och tvätta ägg 3-4 gånger med 250 ml sterilt destillerat H 2 O per tvätt.
- Överför ägg till färska 90 mm filterpapper placerat i en Petri-platta lock och låta dem torka tills de inte längre håller ihop (ca 20-30 min).
- Överför ägg till botten av plastbehållare med insekt kost, placera cirka 40 ägg i varje behållare(Figur 1A). Ägg separeras från kosten för att förhindra fukt-inducerad svampkontaminering. Upprätthålla ägg på 26 ° C med en 16 h ljus: 8 tim mörk fotoperiod. Ägg kommer ljusare till en gul-vit färg före kläckning.
- När kläckning är klar töm ca 25 larver vardera till nya behållare med diet på botten (Figur 1B). Det är viktigt att plocka upp varje larv av den långa svarta hornet med pincett för att undvika att skada dem under deras bräckliga tidiga utvecklingsstadier. Inkubera i 2 dagar som ovan. Även larver död är ovanligt i detta skede kan vissa döda eller, mer troligt, utvecklingsmässigt hämmad larver observeras. Sådana insekter bör undantas från vidare studier och avlivades genom frysning.
- För att undvika kannibalistiska beteenden, överföra larver till individuella behållare med små bitar av livsmedel (figur 1C) och inkubera enligt ovan. Övervaka insekt utveckling, ersätter mat och rengöring avföring out av containrar varannan dag tills de genomgår den tredje larver Molt (vanligtvis 6-9 dagar efter kläckning). Detta är den 4: e instar larvstadiet, kännetecknad av förekomsten av svarta hakliknande virknålar på varje proleg och ökad framträdande av ränder längs insekten kroppen (figur 1D). Larverna kan variera avsevärt i storlek, men vanligtvis väger från 0,15 till 0,4 g vid inträdet den 4: e instar skede. Larver av liknande storlek bör väljas för injektion.
2. Framställning av bakterier för injektion
- Odla bakteriestam (er) som skall testas enligt standardprocedurer till tillväxtfasen du vill testa.
- Pellet 500 pl av varje bakteriell stam som skall testas genom centrifugering under 2 min i en mikrocentrifug vid 13.000 rpm vid rumstemperatur.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml sterilt 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och pelleten igen som ovan.
- Återsuspendera cellerna i 0,5 ml steril 1x PBS och åtgäratt den optiska densiteten (OD) av suspensionen. Späd alla suspensioner i samma ytterdiameter, om nödvändigt. Sterila odlingsmedier kan också användas för cell återsuspension och utspädning i stället för 1 x PBS, om så önskas.
3. Injektion av 4: e instar-larver
- Bered seriella 10-faldiga utspädningar av den första bakteriestammen i 6 brunnar i en 96-brunnars mikrotiterplatta i steril 1 x PBS, med användning av en färsk pipettspets för varje utspädning (figur 2A). Den slutliga volymen av cellsuspension i varje brunn bör överstiga den volym som krävs för injektion (10 pl per insekt) plus 20 pl till tallrik inokulatet (se steg 3,2 och 3,7).
- Spot 10 pl vardera för 5 utspädningar (10 -2 till 10 -6) längs toppen av en Petri-platta innehållande ett lämpligt tillväxtmedium. Luta plattan så att fläckarna sprids till centrum (Figur 2B).
- Ta insekt kost och avföring och insekter placera i behållare på is förcirka 5 minuter.
- Sterilisera sprutnålen genom sköljning 3 gånger vardera i 2 rör med 70-100% etanol, följt av ett rör av sterilt H 2 O (figur 2C). Volymen av vätskan måste vara tillräcklig för att dränka nålen.
- Kvantifiera de utspädda cellsuspensionerna under ett mikroskop med användning av en hemocytometer. Beroende på den önskade inokulatet, drar 10 pl från lämplig mikrotiterbrunnen (figur 2D).
- Pinnen insekten ytan med 95% etanol, och injicera 10 ml cellsuspension i insekten i en vinkel (mindre än 45 °) bakom en av de abdominala prolegs. Se till att inte punktera tarmen och injicera innehållet precis under epidermal lagret (figur 2E). Även viss förlust av hemolymfa (klar, grön-blå vätska) är normalt, partiklar och gul vätska som kommer ut från injektionsstället indikerar tarmen punktering. Om detta inträffar, offra insekten och få en ny larv att återplacera den.
- Upprepa steg 3,6 för varje återstående insekt i den första injektionen gruppen. Nål sterilisering är inte nödvändigt mellan varje insekt injiceras med samma utspädning och stam av bakterier inte förekommer förorening. Alternativt kan ett upprepande dispenser användas för större konsekvens i injektionsvolym bland proverna.
- Efter injektion varje insekt med den första stammen av bakterier, upprepa steg 3,2, denna gång spotting cellsuspensioner i mitten av plattan och låta dem strömma mot botten (figur 2F). Inkubera plattorna vid lämplig temperatur och räkna kolonier för att räkna inokulatet. Detta andra pläteringssteget används för att verifiera att proverna inte kontamineras under injektionen processen, eftersom detta skulle resultera i skilda kolonier nummer mellan den första och andra ytbehandlingar.
- Upprepa steg 3,1 till 3,8 för varje bakteriestam i experimentet. Slutligen, injicera 3-5 insekter med steril 1 x PBS med användning av en sterile nål som en negativ kontrollgrupp. Inkubera insekter vid 26 ° C med en 16 h ljus: 8 tim mörk fotoperiod.
- Övervaka insekt överlevnaden över tiden efter injektion. Insekt döden kännetecknas som en brist på frivilliga rörelser vid stimulering. Insekter uppvisar ofta aptitlöshet, diarré (vattnig, gul avföring), och / eller vatten förlust ("svettning") under infektion före döden, dessa egenskaper kan vara värt att notera också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett representativt exempel på en insekt dödlighet analys avbildas i figur 3. I detta experiment, var insekter injicerades med ca 50 kolonibildande enheter (CFU) av antingen vildtyp (ATCC19061) eller en försvagad mutant stam (LRP 13) i Xenorhabdus nematophila odlades till mitten av log-fasen (n = 6 insekter per stam). Insekter observerades under ca 72 timmar, och procent av injicerade insekter lever vid varje tidpunkt registreras. I detta fall, uppvisade den försvagade stammen en tydlig fördröjning i insekt dödande, den vildtypstammen dödade alla 6 larver inom 30 timmar efter injektion, före döden av varje mutant-infekterad larv.
Figur 1. Insekt uppfödning inför injektion. A) Om 40 ytsteriliseras ägg placeras på botten av en 5 oz bägare medsteril insekt kost vilar på en gummipropp. B) Tjugo nykläckta insekter överförs till 5 oz koppar med steril insekt kost på botten och inkuberades under 2 dagar. C) Insekter är nästa överförs individuellt till 1oz koppar med steril kost på botten och inkuberas tills de mognar. D) Fjärde stadiet M. sexta larver med framstående ränder längs kroppen (överst) och svarta virknålar på buken prolegs (nederst).
Figur 2. Injektion av 4: e stadiet M. sexta larver. A) Bakterier serieutspäddes i en 96-brunnars platta. B) Tio mikroliter flera spädningar är pläterade för att räkna inokulatet. C) Sprutan steriliseras med 3 sköljningar i etanol (2x) och sterilt vatten. D) Tio mikroliter från lämplig utspädning dras in i sprutan. E) Cellsuspensionen injiceras vid en 45 °vinkel bakom den första buken proleg. F) Utspädningar åter pläteras för att åstadkomma en andra åtgärd av inokulatet.
Figur 3. Representativa resultat av M. sexta injektion analys. Ca 50 kolonibildande enheter (CFU) av Xenorhabdus nematophila celler i stationär fas (10 | il från 10 -4 utspädning) injicerades i sex 4: e stadiet M. sexta-larver per stam. Både vildtyp och en mutant stam (LRP) med en etablerad virulens defekt injicerades och insekterna kontrolleras med avseende på mortalitet under tiden. Resultat rapporteras som procent överlevande insekter över tid (i timmar). Dessa kurvor är statistiskt distinkt, med ett p-värde på 0.000458 via log-rank-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den direkta injektionen av M. sexta larver med entomopatogena bakterier, som beskrivs här, fungerar som ett enkelt och effektivt sätt att analysera bakteriell virulens. Metoden är också mycket anpassningsbar för att passa olika försökspersoner och / eller förhållanden. Bakterier kan framställas på olika sätt före injektion. I fallet X. nematophila, vildtyp celler odlade i näringsrikt Luria-Bertani (LB)-medium till mitten av log-fasen är vanligtvis den mest virulenta, dödar de flesta eller alla insekter inom 30 h efter injektion. Celler i stationär fas tar ofta 5-10 timmar längre för att döda larverna. Även tillväxtfasen påverkar virulens, visas det totala antalet injicerade celler att vara mindre viktiga 16, med typiska inokula som sträcker sig från 20 till 20.000 CFU. I själva verket, när det gäller Xenorhabdus och Photorhabdus arter, så få som 5 CFU är tillräckliga för att döda insekten värden 17. För att bedöma virulens properties av bakteriearter som är resistenta mot etanol sterilisering (t.ex. Bacillus-arter), kan engångskanyler användas för att injicera varje unik stam i stället för etanol sterilisering (steg 3,4).
Ytterligare anpassningar av denna metod kan innebära förändringar i uppfödning och / eller manipulation av M. sexta. Exempelvis kan insekter födas på tomat eller tobaksblad som en mer naturlig födokälla. Alternativt olika utvecklingsstadier av M. sexta larver kan analyseras genom detta förfarande. Fjärde stadiets larver valdes baserat på deras relativt stora storlek, men mindre larver kan också injiceras med denna metod. Femte stadiets larver kan injiceras, men förändringarna i immunsystemet under detta skede av utvecklingen gör sena 5: e instar larver mer mottagliga än början 5: e instar larver 18, eventuellt komplicerar dataanalys.
Slutligen, direkt injektionmetoden kan anpassas för användning med andra insektsarter. M. sexta används som modell värd för högpatogena arter eftersom det är mindre mottagliga för infektion än andra (mer mottagliga) modellorganismer såsom Galleria mellonella. G. mellonella kan injiceras genom den metod som beskrivs i detta arbete 19, dock, och kan vara användbar för att analysera bakteriearter mindre virulenta än Xenorhabdus och Photorhabdus arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka tidigare medlemmar av Goodrich-Blair lab: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard och Youngjin Park för deras bidrag till utvecklingen av detta protokoll. Detta arbete har finansierats av National Science Foundation IOS-0950873 och National Institutes of Health NRSA gemenskap FAI084441Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375" length, point style 2 |
References
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Tobacco Hornworm Genome Project [Internet]. , Baylor College of Medicine. Houston, TX. Available from: http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project (2012).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
