Summary
우리는 extracellularly 기록하고 신경, 근육, 및 개인 식별 뉴런에서 자극 할 수있는 기술을 설명
Abstract
Multifunctionality, 여러, 독특한 행동 하나를 생성 한 주변 구조의 기능은 동물이 빠르게 환경을 변화하는 자신의 행동을 적응 할 수 있습니다. 해양 연체 동물 Aplysia californica는 multifunctionality 연구를위한 다루기 쉬운 시스템을 제공합니다. 수유하는 동안, Aplysia 같은 먹이 장치, 구강 대량를 사용하여 행동의 여러 독특한 종류를 생성합니다. 이러한 행동을 제어하는 신경절은 electrophysiological 연구 액세스 할 수 있습니다 대형 식별 뉴런의 번호가 포함되어 있습니다. 이러한 뉴런의 활동은 신경 활동에 음식 움켜 잡 기사의 친척을 종료하는 신경 활동의 타이밍에 따라 두 가지 종류, ingestive 및 egestive 프로그램으로 나눌 수 있습니다 모터 프로그램에 설명 된 해당 protracts 또는 retracts 움켜 잡 기사 2. 그러나, 절연 신경절에서 이러한 행동을 생산 것입니다 근육 운동은하는, 결석 아르더 생체, 신경과 근육 레코딩의 프로그램에게 2,3,4를 공급하는 해당 획득했습니다. 관찰 모터 프로그램은 실제 행동의 상관 관계 여부를 확신 할 수 있지만, 직접 5 개의 개별 뉴런에서 기록하는 것은 매우 어렵습니다 수 있습니다. 또한, 생체에 ingestive 프로그램은 더 물린 상처와 제비의 1,2, 대부분의 이전에 체외 준비에 설명에 할 어려운 차이로 나눌 수 있습니다.
정지 구강 대량 준비 (그림 1) 절연 신경절과 그대로 동물 사이의 간격을 다리. 이 준비에는 ingestive 행동 - 물고과 삼키는 모두 포함 - 개별 뉴런이에서 녹화 및 세포 전극에게 6을 사용하여 자극 할 수 있으므로 및 egestive 행동 (거부)가 동시에 elicited 수 있습니다. 서로 다른 행동과 관련된 먹이 움직임이 recor 할 수 있습니다ded, 정량화 및 모터 프로그램에 직접 관련된. 중지 된 구강 대량 준비의 모터 프로그램은 모터 프로그램이 분리 된 신경절에 elicited하는 것보다 생체에서 관찰 것과 더 유사하게 나타납니다. 따라서이 준비 모터 프로그램은보다 직접적으로 생체 행동에 관한 할 수 있습니다, 같은 시간에, 개별 뉴런은 그대로 동물에 비해 녹음 및 자극에 더 액세스 할 수 있습니다. 또한,로 분리 신경절과 그대로 동물 사이의 중간 단계, 정지 구강 대량의 연구 결과는 더 감소 등 그대로 두 설정에서 얻은 데이터의 해석에 도움이 수 있습니다. 정지 구강 대량 준비 Aplysia의 multifunctionality의 신경 제어를 특징위한 유용한 도구입니다.
Protocol
1. 솔루션의 준비
- 동물 유지되는 해수 (~ 1000 millosmolar)에 등장합니다 염화 마그네슘 솔루션을 준비하려면 원하는 볼륨 수준에 큰 용기를 표시합니다. 이 수준의 약 80 % 증류수로 용기를 작성하고, 최종 볼륨에서 333 MM 솔루션을 만들 마그네슘 염화물 hexahydrate의 적절한 금액을 무게. 통에 염화 마그네슘을 추가 뚜껑을 닫고 염화 마그네슘이 완전히 해소 될 때까지 힘차게 흔들어 다음 최종 볼륨에 도달 할 때까지 증류수를 추가합니다.
- Aplysia의 생리를 준비하기 위해 다시 원하는 볼륨 수준에 큰 용기를 표시하고,이 수준의 약 80 %에 증류수를 입력하십시오. 저어 접시에 용기를 놓고, 통에 저어 바을 배치하고, 저어 판을 설정합니다.
- 하나 하나는 이러한 죄수를 만들려면 다음 물질의 적절한 양을 무게 주전자에 추가최종 볼륨의 centrations : 460 MM 나트륨 염화물, 10 MM의 칼륨 염화물, 22 밀리미터 마그네슘 염화물 hexahydrate, 33 MM 마그네슘 황산의 heptahydrate, 10 밀리미터 염화칼슘 이수화, 10 MM 포도당, 10 MM를 처리한다.
- 용질이 완전히 용해되면 용액의 pH를 측정하기 위해 산도 측정기를 사용합니다. 천천히 7.5의 최종 값으로 pH를 높이 1 M의 수산화 나트륨을 추가합니다. 실수로 너무 많이 수산화 나트륨을 추가하는 경우, 당신은 pH를 낮추려면 1 M 염산 산을 추가 할 수 있습니다.
- 최종 볼륨에 도달 할 때까지 증류수를 추가합니다.
- 실험에 필요한 때까지 냉장고에 세균 성장, 저장 솔루션을 느리게합니다. 온도가 Aplysia 모터 프로그램에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 신중하게 온도를 모니터링하지 않지만 설치가 완료되면, 준비는 일반적으로 근처에 실내 온도입니다.
2. 녹화 요리의 작성
- 실험이 진행되는 동안 구강 질량에 솔루션에 일시 중지됩니다원형 100mm (직경) × 50mm (높이) Pyrex 요리. 이 요리는 구강 질량, 구강 신경절이 Sylgard에 고정되는 좁고 높은 중간 플랫폼, 대뇌 신경이 분리되어 별도의 고가 다시 챔버에 대한 프런트 챔버가 있어야합니다. Sylgard에있는 노치는 대뇌 신경 챔버에 구강 신경절 플랫폼을 연결해야합니다. 요리를 구성 할 때 지정된 키 크기를 참조, 그림 1을 참조하십시오.
- 이 요리를 만들려면, 원형 100 X 50mm Pyrex 요리와 함께 시작합니다. 제품과 함께 제공된 지침에 따라 Sylgard 준비합니다. 요리의 건설은 몇 가지가 Sylgard 설정하도록 허용해야하는 사이에 Sylgard의 따를 필요합니다.
- 첫 번째 뿌린는 요리에 Sylgard 최고 수준의, 구강 및 뇌성 챔버 (1 그림 참조) 사이에 벽을 만드는 것입니다. 다른 섹션에서 요리의 해당 부분을 차단합니다. 모델링 점토가 구축하는 데 사용할 수 있습니다섹션을 차단을위한 벽. 평면 벽의 경우, 골판지의 조각은 모델링 점토로 속을 채우지과 함께 사용할 수 있습니다. 곡선 벽 (이는 대뇌 신경을 포함하는 챔버의 크기를 감소)의 경우, 벽의 기반으로 만 모델링 점토를 사용합니다. 플라스틱 랩과 코트는 모든 벽들이 쉽게 제거 Sylgard 연락을드립니다.
- , 누설을 최소화 거의 최대 접시의 상단이 공간에 Sylgard를 뿌리고 가장자리에 꼭 밀봉을 보장 2.3에 설명 된대로 일단 구강과 뇌성 챔버 사이의 벽의 공간이 차단되었습니다. 밤 Sylgard 세트를하자, 그리고 완전히 계속하기 전에 설정되어 있는지 확인합니다. 따뜻한 곳에서 요리를주는 게 빠른 설정을 유도합니다.
- 다음으로 구강 신경절 플랫폼과 뇌성 신경절 챔버는 (다시 완성 된 접시에 이러한 신경절의 위치를 보여줍니다하는 1 그림 참조) 부어해야합니다. 이전 차단 벽을 제거하고 새 벽에게 디를 생성구강 신경절 플랫폼을 차단하는 중간 부분의 평면 Sylgard 벽에서 입장 0.5 cm입니다. 어떤 벽은 대뇌 신경을 개최합니다 다시 방을 만들 필요가 없습니다. 최상위 레벨 아래에 약 3 mm의 높이에 두 섹션에 Sylgard을 넣어. 뇌성 상공 회의소는 구강 신경절 플랫폼보다 약간 낮은해야합니다. 다시 말하지만, Sylgard은 하루 아침에 설정할 수 있습니다.
- 마지막으로, 전면 챔버 (즉, 구강 질량이 일시 중지되며있는 챔버)를 부어. 어떤 벽은 필요하지 않습니다. 그림 1에 지정된대로 적절한 높이에 넣어.
- 마지막 단계는 구강 신경절 플랫폼과 뇌성 챔버를 연결하는 노치를 잘라하는 것입니다. 노치의 깊이는 구강 신경절 플랫폼의 수준과 동일해야합니다. 메스 블레이드는 노치를 잘라하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1은 완성 된 요리를 보여줍니다.
3. 전극 준비
- 세포 전자를 당겨불타는 브라운 micropipette 풀러를 사용하여 단일 질주 모세관 유리에서 lectrodes. 전극 '내부 직경은 약 40 μm해야하고 저항은 MΩ 0.1에 대한 있어야합니다. 풀러에서 FT345B 필라멘트로, 우리의 전형적인 끌어 당기는 프로그램 설정은 열 480 끌어 오기 50, 벨 13 및 시간 20아르하지만, 설정이 다른 종류의 필라멘트에 대해 서로 다른 될 것입니다. 이 프로그램은 노 화재 연마 단계를 하나의 풀에 전극을 만듭니다. 실험 대체 Aplysia 생리와 세포 전극을 시작하기 전에.
- 개개인의 전극이 서로 감싸 할 필요가없는 경우를 제외하고 Cullins 및 Chiel 4에서 설명한 것과 유사한 프로토콜에 따라이 신경과 근육 기록에 대한 후크 전극을 만듭니다. 이 전극을 만들 수있는 단계는 3.3-3.13에 따르십시오.
- 약 60 cm의 길이에 에나멜 코팅, 0.001 인치 직경 스테인리스 스틸 와이어의 조각을 잘라 버릴거야. 모델링 점토의 공을 첨부와이어의 각 끝 부분에, 그 중간 지점에서 공중에 와이어를 보유하고 서로 주위에 전선을 정리하고 서로 주위에 점토의 두 볼을 스핀 (이 capacitative 과도을 감소).
- 한 공, 테이프 와이어를 일시 중지 할 수있는 와이어의 다른 쪽 끝으로 점토의 두 볼에 가입하여 함께 와이어의 두 끝을 잡아.
- 당신의 엄지 손가락에 접착제의 글로브를 걸기 와이어에 함께 엄지와 검지 손가락을 터치하고, 와이어를 통해이를 실행하여 코트 가정용 실리콘 접착제의 와이어의 전체 길이를. 접착제가 밤새 건조 보자.
- 접착제가 마른 후, 쌍안 해부 현미경으로 평평한 표면에 와이어를 배치합니다. 함께 삐 두 개의 전선의 결과로, 이전에 중간이었다 와이어의 끝을 자른다. 이 차동 전극입니다.
- 장소에 전극의 끝 부분 중 하나를 보유 할 테이프를 사용합니다. 접착제와 에나멜을 제거하기 위해서 집게를 사용하여 약 2cm O를 가지고 한쪽 끝에서 두 전선을 준비에나멜을 박탈 와이어의 약 1cm로 F 무료 와이어. 납땜으로 구분 유지하는 핀 주위에 와이어 각각에 금 커넥터 핀 및 장소 연구실 테이프.
- 전극의 다른 쪽 끝에서 와이어 무료 전선의 약 3mm가 준비합니다. 한 와이어의 마지막 약 1mm의 에나멜을 제거,이 와이어를 뒤로 아웃 방식의 구부린다. 이 참조 와이어입니다. 이 두 선이 서로를 만지고 나선이없는 것이 중요합니다.
- 다른 와이어에서 실리콘 접착제로 모든 길을 에나멜을 제거합니다. 후크에이 와이어를 열고 있으며 약 1 mm의 길이로 자르고. 이 후크는 신경이나 근육에 연결합니다. 짧은 훅을 사용하면 신경이 전극에 부착되고 더 큰 안정성을 제공합니다.
- 전극이 올바르게 구성되고 그대로 있는지 확인하기 위해 멀티 미터를 사용하십시오. 한 금 커넥터 한 와이어의 끝과 관련하여 대략 200-500 옴의 저항 판독이 있어야합니다, 다른 금 연결또는 다른 선에 비해 비슷한 읽기가 있어야합니다.
- 한 와이어에 그대로 연결이없는 경우는 와이어 다시 제거 끝으로하고 다시 납땜 한 다음 연결을 생성 할 두 골드 커넥터 수도 있습니다. 모두 골드 커넥터가 모두 전선으로 연결되어있는 경우 전극이 접촉하는 두 노출 된 전선이있을 수 있습니다. 그것은이 문제를 제거하기 위해 다른 쪽 끝을 해결하기 위해 수도, 그렇지 않으면 전극은 폐기해야합니다.
- 많은 전극이 같은 실험에 필요한대로이 절차를 반복합니다. 후크 전극이 신경에 부착하는 끝을 잘라과 와이어 많은 사용 후 너무 짧 될 때까지, 새로운 후크를 작성하여 실험 실험에서 다시 사용할 수 있습니다. 때마다이 작업을 완료되며, 전극이 그대로 있는지 확인하기 위해 멀티 미터를 사용합니다.
- 실험, 라벨 전극과 케이블 동안 다른 전극을 추적합니다. 실험실 테이프의 다른 색상을 사용하면 도움이됩니다.
- 200-300에 대한 g 무게의 건강한 동물을 선택합니다. 다시마가 표시되면, 동물 3-5 초에 정기적으로 강력한 protractions과 간식을 생산해야합니다.
- 해부 트레이에 동물을 놓고 50 %의 체중 등장 염화 마그네슘 솔루션에 대해 주입하여 마취. 중간과 동물의 꼬리를 향해 가리키고 30-15 정도도 각도에서 주사기로 첫 번째 주사를합니다. 주사 후, 부드럽게 염화 마그네슘을 보급 할 수있는 동물의 표면을 마사지. 동물의 머리를 향해 가리키고 주사기와 필요에 따라 추가 주사합니다.
- 동물이 부드러운 촉감 자극에 응답을 중지 한 후 꼬리에서 한 핀과 각각 앞 촉수 한 핀과 함께, 최대 트레이, 등쪽의 옆에 동물을 핀.
- rhinophores 뒤에, 머리의 중간에있는 동물의 피부를 꼬집어하고 리프트에 집게를 사용하십시오. 엠그냥 포인트가 잡혀 뒤에 동물의 머리에서 피해는 코로나 절개. 그런 다음 구강 질량을 노출, 입쪽으로 rhinophores 사이에 앞으로 midsagittal 절개를합니다.
- 구강 대량 멀리에게 가까이 피부를 당겨, 그리고 신경과 완전히 구강 대량의 피부의 플랩을 분리하기 위해 몸을 벽에 부착 결합 조직을 잘라 집게를 사용하십시오. 모든 신경이나 구강 대량으로 고유 조직을 건드리지 않게해야합니다.
- 식도을 잡고 개최 집게를 사용하십시오. 개최되는 지점으로 식도의 뒤쪽으로 자른다. 다음과 같은 상처가 만들어집니다으로 구강 대량을 올려 식도에 당겨.
- 구강 질량 뒤에, 뇌성-구강 connectives (CBCs)에 의해 구강 신경절에 부착 된 대뇌 신경과, 링 대뇌, 흉막, 그리고 페달 신경절 양식. 구강 질량에 부착이 링 신경절를 남겨,이 신경절에서의 다른 부분에 돌출 모든 신경을 잘라몸.
- 그것이 몸에 덜 연결되면서 구강 대량를 들어 계속 모든 구강 대량 주변의 결합 조직을 통해 잘라 요. 구강 질량 만 입에 부착되면, 식도 및 구강 질량은 직선으로 실시해야합니다.
- 몸에서 구강 질량을 확보 할 턱에 불과 앞 최종 편집하십시오. 전극이 부착하는 동안 일부 anesthetization을 유지하기 위해에서 50 % 등장 염화 마그네슘 솔루션 50 % Aplysia의 생리의 솔루션에 구강 질량을 배치합니다.
- Sylgard 바닥과 페트리 접시에, 솔루션, 구강 대량를 놓습니다. 대뇌 신경에 자신의 연결을 절단하여 흉막과 페달 신경절을 제거합니다. 대뇌 - 구강 connectives (CBCs)를 통해 구강 신경절 및 구강 질량에 첨부 된 대뇌 신경을 남겨, 대뇌 신경과 구강 질량 사이의 다른 연결을 끊을. 그들은 g되지 않도록 짧은 길이의 식도와 침샘을 손질동부 표준시 방법은 아니에요.
5. 후크 전극 첨부 파일
- 녹음 및 자극의 경우, 후크 전극은 실험 (그림 2) 적절한 다른 신경과 근육의 수에 첨부 할 수 있습니다.
- Cullins와 Chiel 4에 의해 생체에서 보여준으로 패턴을 특징하려면 radular 신경에 전극, I2 근육 및 구강 신경 2, 3를 첨부합니다. 함께,이 녹음은 구강 대량 3,7,8에 고유의 주요 근육을위한 모터 뉴런의 활동을 보여주고 I2 기록 3, 구강 신경에서 철회 단계 2, 3 녹음 2에서 길게 끌기 단계의 식별을 허용 , 5,8, 그리고 radular 신경 기록 2 식품 움켜 잡 기사의 폐쇄시기. 패턴 자극에 대한 구강 신경 2를 지점으로 추가 후크 전극을 연결합니다. 전극의 첨부 파일은 demonstrat 비슷한 절차를 다음과Cullins 및 Chiel 4의 에드, 그리고는 다음 단계에 설명되어 있습니다.
- 각 전극 첨부를 들어, 굵은 속이는에 전극을 배치합니다. 속이는 사람으로, 그 끝 악어 클립으로 나무 막대기를 녹화하고 전극의 끝을 잡고 클립을 사용합니다. 클립에 대한 1cm 실리콘 코팅이 종료되기 전에, 전극의 실리콘 코팅 부분에 연결해야합니다. 구강 질량 근처의 후크 전극을 위치로 속이는를 사용하십시오.
- 그 옆에있는 구강 대량으로 및 안정성을위한 접시의 벽에 위치, 가장 어려운 전극 첨부 파일을 제공 radular 신경과 시작합니다. 이 신경에 액세스하는 두 가지 옵션이 있습니다.
- radular 신경 구강 신경절 아래에서 프로젝트와 두 가지의 I2 근육 아래갑니다. 첫째, radular 신경이 근육을 절단하지 않고 액세스 할 수 있는지 확인하십시오. D, 부드럽게 I2 근육에 구강 신경절을 부착 흰색 드레스를 버리게O이 칼집을 잘라 없습니다. 신경에 액세스 할 경우, 신경 중 하나 지점을 올려 후크에 팁 구부러진와 집게를 사용합니다.
- radular 신경이 방법으로 액세스 할 수없는 경우, 두 번째 옵션은 얇은 I2 근육 아래의 신경을 찾아 신경을 노출 할 수 I2의 작은 절개를 만드는 것입니다. 이 절개 근육의 두 층을 통과해야합니다. 근육 아래에서 radular 신경의 지점을 잡아 갈고리 집게를 사용하십시오.
- 신경 옆에있는 전극의 후크를 위치로 속이는를 사용하십시오. 훅에 신경을 배치하려면, 동시에 개최되는 신경의 두 반쪽 사이의 분리를 만들 포셉의 다른 쌍을 사용하는 동안 갈고리 집게에 신경을 보유 할 도움이 될 것입니다.
- 신경이 용의 선상에 고정되면이 긴장 될 때까지 구강 질량에서 떨어져 신경을 올려하지만, overstretch하지 않는 속이는를 사용합니다.
- Kimwipe를 가지고 긴밀하게 작은 심지를 형성 한 모서리를 묶으. 건조이 심지를 사용하여전극과 걸려있다 신경 섹션의 끝.
- 갈고리 신경에 빠른 젤 슈퍼 접착제의 글로브를 적용 할 곡선 팁 포셉의 다른 세트를 사용합니다. 와이어와 신경 사이의 접촉 지점에서 응용 프로그램을 시작합니다. 후크가 완전히 접착제으로 덮여되어 있으며, 참조 와이어의 끝은 접착제 (그림 3)에 포함되지 않았는지 확인합니다.
- 설정할 수있는 접착제의 표면을 유발합니다 접착제로 요리에서 솔루션을 적용 할 폴리에틸렌 관의 첨부 파일이있는 주사기를 사용하십시오. 철저하게 접착제가 제대로 설정되도록 솔루션 접착제 목욕을해야합니다.
- 신경의 긴장을 풀어 한 다음 클립에서 전극을 출시 할 속이는를 사용하십시오. 즉, 하나의 후크 전극을 첨부 할 수있는 절차를 완료합니다.
- I2 근육 전극은 다음 첨부해야합니다. I2 신경이 매우 SMA 때문에 우리는 I2 근육보다는 innervating 신경의 ENG 활동에서 EMG 활동을 기록그대로 구강 대량에 액세스 할테니까 어렵다. 구강 신경이 근처 I2 근육의 하나 또는 두 개의 밴드를 들고, 그리고 근육의 나머지에서 그들을 분리하기 위해 포셉의 다른 쌍을 사용하는 갈고리 집게를 사용합니다. 분리 I2의 부분은 구강 신경 2 또는 3에 두께와 유사해야합니다. 하지 (근육을 denervate 수 있음) 이상 - 분리주의하십시오. radular 신경에 사용 된 동일한 절차로 훅 전극을 연결합니다.
- 첨부 할 수있는 다음 전극은 해당 분기 구강 신경 2에. 이 지점은 전기 모터 프로그램에게 9 유도하는 자극 할 수 있습니다. 구강 신경 2 측면 홈에있는 I1 근육 아래에 들어가기 전에, 신경이 trifurcates, 가지가 분리 된 최초의 지점입니다. 지점은 아주 작은, 그래서 전극 첨부 파일은주의하여야한다. 전극을 부착하기 위해 같은 절차를 따르십시오.
- 구강 신경을 2, 3은 쉽게 액세스 할 수 있습니다. elec을 부착, 동일한 절차를 따르십시오약 절반 구강 신경절과 측면 홈 사이 trodes.
- 일부 뉴런이 ipsilateral 대에 다르게 반응하기 때문에 일방적 인 대 양자 투영의 경우와 뉴런을 구분하기 위해는, 구강 질량뿐만 아니라, 구강 신경이 지점의 반대편에 구강 신경에 전극을 2, 3을 첨부하는 것도 유용합니다 . contralateral BN2 - 자극.
6. 신경을 위치와 피복을 썼음
- 구강 질량은 2 절에서 설명하는 내내 100 X 50mm Pyrex 요리로 이동합니다. 그림 1을 참조하십시오.
- 진공 그리스의 글로브를 들고 노치를 통해서 확산 pipet 팁을 사용하여 대뇌와 구강 챔버 사이의 노치에 진공 그리스의 얇은 층을 적용합니다. 우리는 진공 기름은 바세린보다 누설 더 나은 최소화 것으로 나타났습니다. Aplysia의 식염수에 전면 챔버를 입력합니다. 조심스럽게 전면 chamb에 페트리 접시에서 구강 대량 이동신경을 깰 수있는 전극의 아무 것도 단단하게 당기지도되어 있는지 확인하고이 큰 접시의 어,,.
- 요리는 칼집을 썼음에 대해 다른 쌍안 해부 현미경으로 전송해야하는 경우 후크 전극 매우주의해야합니다. 그룹은 함께 구강 대량의 한쪽면에 전극, 또한 함께 구강 질량의 다른 쪽 그룹 전극을. 조심스럽게 다시 전극의 아무 것도 단단히 당겨되지 않도록 만드는 커넥터 핀을 커버 연구실 테이프를 쥐었고하여 전극을 누르고 있습니다.
- 요리는 현미경으로 위치하면 전극은 접시 옆에있는 플랫폼에서 음식과 휴식의 측면으로 부드럽게 장식해야합니다.
- 휴식 시간과 실험의 단계 사이에, 수족관 airstone을 사용하여 구강 대량 챔버에 호수가 폭기.
- 노치를 통해 실행하는 대뇌 - 구강 connectives (CBCs)와 뒤쪽에 대뇌 신경을 핀. 더 많은 진공 g을 적용CBCs 이상 rease 한 다음 음식의 두 부분에 더 많은 Aplysia의 생리를 추가 신경절이 완전히 잠기 갖고 있습니다. 더 누설은 챔버 사이에 발생하지 않도록 추가 진공 기름의 양이 대뇌 나 구강 방 하나를 생리의 수준보다 높은 것을 확인하십시오. 이 단계에서, 구강 질량은 신경과 신경절에 너무 강하게 끌어 안 듯 앞 챔버의 하단에 휴식을해야합니다.
- 중앙 플랫폼에서 구강 신경절을 핀. 아직 구강 대량에 부착되어있는 신경 손상을 방지하려면 두 신경의 집에 핀을 배치합니다. 을 확장하고 고정 CBCs의 측면에 두 개의 핀을 추가합니다.
- 관심 뉴런의 위치를 기준으로 구강 신경절의 평면 또는 회전세요. 구강 신경을 회전하려면, CBC의 일부 초과 칼집을 잡아 고급 집게를 사용하여 2, 3 구강 신경 사이를 핀. 그런 다음 가장 다시 챔버에 인접하고 easi 수 없습니다 세포 기관의구강 신경절의 상단에서 액세스 통증이 볼 수 있습니다. 마지막으로, 구강 신경의 움직임을 최소화하기 위해 구강 대량 측에 인접 구강 신경절의 집에 두 핀을 추가 할 수 있습니다. 그림 4를 참조하십시오.
- 다시 챔버에 인접 구강 신경절의 피복을 잡아 고급 집게를 사용하여 다음 셀 몸을 노출시키지 않고 고급 가위로 초과 피복을 떼어. 피해를 최소화하기 위해, 만 셀 몸을보고하기 위해 필요한 피복의 양을 제거합니다.
7. 자극과 녹화
- 칼집이 완료의 숱이 후, 앰프에 연결 케이블에서의 소켓에 대한 모든 전극 핀을 연결합니다. 다시 말하지만,이 일을하는 동안 전극이 단단히 당겨되지 않았는지 확인합니다. 전극이 올바르게 적절한 케이블에 연결하고 극성이 올바른지되어 있는지 확인합니다.
- 남아있는 염화 마그네슘을 씻어하려면 Aplysi를 교체신선한 Aplysia의 생리와 구강 대량 챔버에서 염분.
- 턱 연골에 구강 질량, anterodorsal의 앞쪽에있는 부드러운 조직을 통해 실크 봉합 실을 꿰다, 따라서 그 앞쪽 끝에서 구강 질량을 일시 중지, 요리의 가장자리에 봉합을 첨부 모델링 점토의 두 조각을 사용합니다. 뒤쪽 끝은 구강 신경절에 부착 된 구강 신경에 의해 중지되어 있습니다.
- 전극 팁은 구강 신경절 근처에 있도록 유리 세포 전극을 잡고 속이는를 배치합니다.
- 신경 세포를 찾아 확인하려면 부드럽게 신경 소마 (그림 5) 위에 피복에 세포 전극의 끝을 누르 속이는를 사용합니다. 자극 전류를 적용하고 신경의 세포 전극과 대응 활동 (그림 6)의 활동을 기록하기 위해 녹화 모드로 소마을 자극하는 데 사용되는 채널을 전환합니다. 참조뉴런의 식별에 도움을 신경 투영 및 근육 innervations (예를 들면 7,8) 등의 게시 된 신경절지도 및 신경 설명.에
- 먹이 프로그램, 위치 구강 대량의 전면과 측면 전망은 (거울의 위치는 그림 1에 개략적으로 표시됩니다) 동시에 볼 수 있도록 요리의 측면에서 거울.의 비디오 녹화 전면과 뷰의 분야에서 측면 전망 모두 비디오 카메라를 배치합니다.
- 비디오 및 electrophysiological 녹음 카메라의보기에 전자 타이머와 AxoGraph, electrophysiological 데이터를 기록하고 분석하는 데 사용되는 컴퓨터 프로그램의 채널에 모두 TTL 펄스를 전송하여 동기화 할 수 있습니다. 이 펄스는 파일이 동기화 할 수있는 기반 AxoGraph 및 비디오 레코딩 정확히 동일한 시점을 제공합니다.
- 신경이 위치한 후, 그 활동은 다른 먹이와 같은 행동, CA에 기록 할 수 있습니다N 아래에 설명 elicited 수.
- 유도하기 위해 거부과 같은 모터 프로그램, 자극 BN2 - 2 Hz에서, 1 밀리 초 펄스 9 (우리의 경험이 자극이 안정적으로이 설정에 egestive 패턴을 생성하는 것입니다)의 긴 기차와. 패턴은 자극의 기간 동안 계속 자극이 끝날 곧 때까지 계속 사용할 수 있습니다.
- 무는 같은 모터 프로그램 12 유도하기 위해 직접 대뇌 신경에 고체 carbachol 몇 크리스탈을 배치합니다. carbachol 노출의 제어 수준이 필요한 경우 또는, Aplysia 생리 1 ~ 10 밀리미터 carbachol의 솔루션을 사용합니다. 높은 농도는 응답을 얻을 가능성이 더 높습니다. 반복적 인 패턴은 일반적으로 5 분, 아래로 실행 시작하기 전에 약 10-15 분 정도 거리에 시작합니다.
- 유도 삼키는과 같은 모터 프로그램 13 carbachol을 적용하고, 구강 대량 강한 자국을 생성 할 때까지 기다리십시오. 그런 다음 식사 중에 스트립을 배치김 (마른 김) radula은 김 (그림 7)을 grasps 수 있도록 동물의 입 인치 스트립의 길이는 5cm가 보통 0.5 cm 폭입니다.
- carbachol 유도 패턴의 첫 번째 시리즈 후에는 추가 carbachol 응답을 얻기 위해 자주 가능합니다. 철저히 적어도 세 번 제거하고 생리를 교체, 대뇌 신경 챔버에 Aplysia의 생리를 씻어. 다시 carbachol를 적용하기 전에 적어도 20 분 기다립니다. 40 분까지 기다리는 것은 더 신뢰할 수있는 결과를 얻을 수 있습니다.
미국에서 현재 invertebrate 동물은 기관 동물 사용 및 관리위원회의 정식 승인을 필요로하지 않습니다. 그러나, 우리는 Aplysia의 모든 트리트먼트 해를 최소화하고 동물에 고통, 그리고 동물이 완전히 anesthetized있는 동안 모든 dissections이 완료되는 것을 보장합니다.
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Discussion
이전 작업은 그대로 동물과 같은 고립 된 신경절 등의 감소 준비에서 Aplysia 모터 프로그램을 특징으로하고 있습니다. 개별 뉴런의 녹음은 5를 획득 한하지만 그대로 동물에서 같은 실험은 매우 어려운이며, 전극은 먹이를하는 동안 신경 세포로 신경 세포에서 이동할 수 없습니다. 절연 신경절에서 신경 활동에 의해 유도 먹이 움직임이 관찰 할 수 없습니다. 정지 구강 대량 준비는이 두 극단 사이의 간격을 다리.
다른 반 그대로 준비가 이전 연구에서 사용하지만, 정지 구강 대량 준비 상당한 장점이있다. 한 반 그대로 준비에서 입술과 구강 질량은 여전히 첨부되었지만, 준비도 14 관찰 할 전체 먹이의 움직임에 감소했다. 체외의 움직임을 먹이의 먹이 헤드 준비 15,16 허용 관찰. 그러나, 일머리 준비를 공급하는 것은 중지 구강 대량 여기서 설명한 것보다 설치가 더 복잡했고, 만 구강 신경절에서, 대뇌 신경의 개별 뉴런에 액세스 할 수 없습니다 제공됩니다. 먹이 헤드 준비에 장점이있다, 그의 입술과 앞 촉수의 존재는 무는 패턴의 생성은 김의 응용, 천연 자극을 통해 허용됩니다. 이 실험을 더 어렵게 만들지 것이지만, 개별 뉴런에 대한 액세스 구강 신경절을 달아 동안 구강 질량에 부착 입술을 남겨두고 준비를 결합 할 수도 있습니다.
Aplysia의 먹이 패턴이 모터 프로그램의 길게 끌기과 후퇴 단계에 비해 음식 움켜 잡 기사를 종료 radular 신경의 활동의 타이밍에 따라 ingestive 또는 egestive으로 분류 할 수 있습니다. radular 신경 활동이 후퇴 단계와 동시에 발생하는 경우, 패턴은 ingesti 아르VE, 그것은 구강 캐비티에 음식을 끌어하므로 움켜 잡 기사는 폐쇄하고 retracting 때문입니다. radular 신경 활동이 길게 끌기 단계에서 발생하는 경우 움켜 잡 기사는 폐쇄하고 구강 캐비티 (2)의 자료를 밀어 protracting 때문에, 패턴, egestive 있습니다.
, 무는 음식을 파악하려고하고, 삼키거나, 이미 파악 식품 1,2의 교통 : Ingestive 패턴은 적어도 두 개의 서브 타입 구분으로 나눌 수 있습니다. 그러나, 체외 작업 (예 : 14,17,18)의 대부분은 삼키는에서 무는 구별하려고 시도하지 만 섭취 / egestion 이분법에 초점을 맞추고있다. 두 연구 16,19가 무는 같은과 삼키는 같은 그룹에서 체외 ingestive 패턴에 분류했습니다. 이러한 연구의 첫 번째에서 패턴은 절연 신경절에서 관찰 된, 구강 질량의 관련 먹이 움직임을 관찰 할 수 있다면,이 인수를 강화 겠어요SE 패턴 물고 및 생체에서 볼 삼키는를 나타냅니다. 두 번째 연구에서는 패턴이 먹이 헤드 준비에서 관찰되었다, 그래서 패턴이 관찰 움직임에 따라 분류되었지만, 구강 신경절의 뉴런의 더 녹음 얻을 수 없습니다.
, 물고 삼키는 및 거부 - - 정지 구강 대량 준비 행동의 세 가지 유형을 관찰 할 수있는 방법을 제공 동시에 주요 구강 신경과 근육의 활동을 기록, 개인 뉴런에서 자극 및 녹음을 모두 동안. elicited 강한 먹이와 같은 움직임이 거의 확실 세포 전극를 제거하기 때문에 세포 뉴런 기술 6이 준비 다른 키 사전입니다. 이 단독으로 신경 녹음과 어려운 것 때 여러 단위가 F 때문에 개별 뉴런의 세포 녹음으로, 모터 프로그램 동안 이러한 뉴런의 활동의 타이밍은 ascertained 수 있습니다동시에 iring.
우리는 정지 구강 대량의 먹이 움직임이 생체에서 본 것과 질적으로 유사하게 나타납니다 것이 관찰되었습니다. 중요한 자극은 (carbachol 각각 구강 신경이 지점 자극)보다 감소 준비에 사용, 우리의 자극은 생리 움직임을 생성하는 찾는 일은 다른 설정에서의 사용에 신뢰성을 대여 한 무는 및 거부 패턴을 생성하기 위해 사용됩니다. 대조적으로, 삼키는 패턴을 생성하기 위해, 우리는 격리 된 신경절에 적용 할 수없는 자연 식품 자극 (김 스트립)와 인공 자극 (carbachol)을 결합. 우리는 또한 중지 구강 대량의 신경 패턴이 감각 피드백 CPG에서 패턴을 형성에 중요 할 수 있습니다 제안, 더 감소 준비에서 얻은 패턴보다 생체 패턴에 더 유사한 것으로 나타 관찰했다. 절연 갱의 예를 들어, 모터는 프로그램정지 구강 대량의 모터 프로그램은 일반적으로 손상 동물 (게시되지 않은 데이터)의 모터 프로그램에 기간이 더 가까워지는 반면 리아는 그대로 동물의 모터 프로그램보다 기간에 여러 번 더 일반적입니다. 중지 된 구강 대량의 또 다른 장점은 동시 측 있으며, 먹이 장치의 전경을 얻을 수 있습니다. 턱 근육 수축을 더 잘 관찰을 허용하면서 정면은 생체에서 볼 수있는 것입니다 거기에 입과 비슷한 전망을 제공합니다. 측면 뷰는 쉽게 다른 행동을하는 동안 biomechanical 변경 사항을 이해하고, 구강 근육의 수축이 관찰하고 근육 아래에 움켜 잡 기사의 앞으로 및 뒤로 이동을 할 수 있습니다.
이 준비에서, 우리는 동시에 다섯 신경 (radular 신경과 양국 구강 신경 2, 3)과 I2 근육에에서 최대 기록했으며, 확인 두번 세포 전극까지 배치신경절의 신경 세포. 이 실험 원하는 경우, 추가 신경 및 / 또는 근육에서 기록하는 것이 가능해 질 것입니다. 또한 뇌성 구강 interneurons의 자극, 일반적으로 17,19가 생체 행동과 비슷한 모터 프로그램을 유도하는지에 대한 통찰력을 줄 수 대뇌 신경의 뉴런에서 자극하고 기록하는 것이 가능해 질 것입니다. 이렇게하면 준비의 기술적 어려움을 증가했지만, 구강 동맥 재관류 15는 준비가 강하고 오래 지속되는 행위 (게시되지 않은 관찰)을 생성하기 위해 허용 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 보조금 NS047073 및 NSF 보조금 DMS1010434에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
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