절차는 뇌파, electromyogram, 그리고 뇌성 젖산 농도를 모니터링하는 동안 optogenetically 뇌성 대뇌 피질의 피라미드 뉴런의 활동을 조작하기위한 설명되어 있습니다. 사람들이 자연 수면 / 웨이크주기를 받아야 동안 실험 녹음 케이블 테 더링 마우스에 수행됩니다. Optogenetic 장비는 우리의 실험실에서 조립, 녹화 장비는 상업적으로 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
동시 Electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 Neuronal 활동 Optogenetic 조작의 실시간 측정
이 논문에서
요약
초록
뇌는 질량에 의해 신체의 5 % 이하를 나타냅니다이지만, 나머지 1에서 몸에서 사용하는 포도당의 약 분기 활용합니다. 비 급속 안구 운동 수면 (NREMS), 시간의 수면의 가장 큰 부분의 기능은 불확실합니다. 그러나, NREMS 중 하나를 분출하는 기능은 잠이 오지 않음 2-4를 기준으로 뇌성 포도당 이용의 속도에 상당한 감소이다. 해당 제품 및 기타 연구 결과는 수면 뇌성 신진 대사에 관련된 기능을 제공하는 널리 통용되고 있던 신념으로 이어 왔습니다. 그러나 NREMS 동안 뇌성 포도당 신진 대사의 감소 근간이 메커니즘은 elucidated 할 수 남아 있습니다.
뇌성 신진 대사 속도에 영향을 미칠 수 있습니다 NREMS과 관련된 하나의 현상이 뇌파 5,6에서 속도가 느린 파도, 4 Hz에서보다 주파수에서 진동의 발생입니다. 두개골 또는 대뇌 피질 표면의 수준에서 감지 이러한 느린 파도가를 반영depolarized / 최대 상태 hyperpolarized / 아래 상태 7 사이의 기본 뉴런의 진동. 다운 상태 동안, 세포는 수백 밀리 초까지 간격에 대한 작업 잠재력을 받아야하지 않습니다. 작업 잠재력에 대한 후속 이온 농도 그라디언트의 복원은 세포 팔에 큰 신진 대사 하중을 나타냅니다 NREMS과 관련된 아래 주 동안 활동 전위의 부재가 깨어날 상대적으로 감소 신진 대사에 참여할 수 있습니다.
두 기술 도전은 테스트하려면이 가상 관계를 위해 해결해야했습니다. 첫째, 대뇌 EEG의 역학을 반영한 시간적 해상도로 뇌성 glycolytic 신진 대사를 측정 할 필요 (그 대신 분 초 동안입니다.) 이렇게하려면 우리는 젖산의 농도, 에어로빅 작용의 제품, 따라서 쥐의 뇌에 포도당 신진 대사의 속도의 기록을 측정. 락트산였다전두엽 피질에 포함 된 젖산 산화 효소 기반의 실시간 센서를 사용하여 측정. 감지 메커니즘은 락트산 산화 효소 분자의 층으로 둘러싸인 백금 - 이리듐 전극으로 구성되어 있습니다. 락트산 산화 효소에 의해 젖산의 대사는 백금 - 이리듐 전극에 전류를 생산 과산화수소를 생산하고 있습니다. 그래서 대뇌 작용들로 ramping는 감지 전극에 증가 현재에 반영되어 락트산 산화 효소에 대한 기판의 농도 증가를 제공합니다. 이 NREMS의 다른 측면에서이 변수를 분리하기 위해 대뇌 피질의 흥분을 조작하는 동안이 변수를 측정하기 위해 추가로 필요했습니다.
우리는 Pyra의 optogenetic 활성화를 통해 뇌성 대뇌 피질의 neuronal 활동의 elecetroencephalogram, 락트산 바이오 센서를 통해 glycolytic 유량의 측정 및 조작을 통해 neuronal 활동의 동시 측정을위한 실험 시스템을 고안midal 뉴런. 우리는 수면 관련 electroencephalographic 파형과 대뇌 피질의 젖산 농도의 순간 - 투 - 순간 역학 사이의 관계를 문서화하는이 시스템을 활용하고 있습니다. 프로토콜 자유롭게 동물을 행동에 공부에 관심이있는 개인을 위해 유용 할 수 있습니다, 뇌 내의 electroencephalographic 수준과 세포 에너지 론에서 측정 neuronal 활동 사이의 관계.
프로토콜
1. 동물의 외과 준비
1. 실험 과목
대뇌 피질 뉴런에있는 파란색 빛에 민감한 양이온 채널, Channelrhodopsin-2를 표현 잭스 스트레인 # 7612) 또는 기타 마우스, B6.Cg-TG (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J 유전자 변형 라인 9 마우스를 사용합니다. B6.Cg-TG (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J 유전자 변형 라인의 대뇌 피질에 푸른 빛의 응용 가능성 9,10를 depolarize하고 조치를 받아야 할 Channelrhodopsin-2을 표현 피라미드 뉴런이 발생합니다. 피라미드 세포 활성화의 결과로서, 지역 interneurons가 활성화되며, 잠재적의 변화는 자극 (10)의 사이트 이외의 뉴런에 전달됩니다. , 핫 구슬은 모든 열 저항성 주입 금속 장치 (cannulas, 나사와 와이어) 소독 압력솥 수술 도구와 softpacks (수술 필드 거즈 패드) : 해당 규제 가이드 라인을 준수의 무균 조건 하에서 수술을 수행30 초에, 에탄올에서 10 초 수영과 열 차별적 인 implantable 장치 (광섬유 케이블, 플라스틱 커넥터) 소독, 통조림 공기의 응용 프로그램이 타격을....
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결과
으로, 그림 2에 표시된 EEG, EMG 및 뇌성 젖산 농도가 지속적으로 모니터링하는 동안 optogenetic의 자극과 EEG / 락 테이트 / EMG 데이터 수집을위한 시설을 갖추고 쥐가 자연 슬립 / 웨이크 상태 전환을 받았습니다. 락트산 센서의 전류는 EEG 낮은 진폭의 기간 동안 증가하고 EEG 높은 진폭의 기간 동안 감소. 그림 3에 도시 된 바와 같이, EEG의 두 채널은 전두엽 피질에 전달 optogenetic의 자극에 민감하게 반응합니다.
그림 1. 수술 - 성형 한 EEG 전극, 젖산 센서와 optogenetic의 자극에 캐뉼라의 A) 도식 .......
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토론
방법은 하나 이전에 불가능 시간 규모 glycolytic 중간 락트산의 두뇌 농도의 수면과 변화 사이의 관계를 측정 할 수 있도록 여기에 소개했다. 동물이 깨어나, NREMS와 REMS 사이의 자발적인 전환을 받고있다. 동물이 전환을 받다 동안 또한, 우리는 optogenetic 자극을 적용 할 수 있습니다. 데이터 락트산 산화 효소 기반 바이오 센서의 판독에 그 자연과 유도 모두 파도에 미치는 영향을 설명 데이트를 모았습니다.
하나는 다른 출처의 장비 및 소프트웨어와 함께 여기에 설명 된 것과 유사한 실험 시스템을 구성 수 있습니다. 설치류에 적합한 polysomnographic 시스템의 대체 소스는 데이터 과학 국제 11과 Embla 12 등이 있습니다. 슬립 상태 분류를위한 소프트웨어가 Somnologica 12 이용이 가능하며, 13 로그인 Icelus 14 자. 젖산의 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
국방부 (국방 고급 연구 프로젝트 기관, 젊은 교수 상, 그랜트 번호 N66001-09-1-2117)과 NINDS (R15NS070734)의 지원을받는 연구.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 구성 요소 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 (선택 사항) |
| BASi 마우스 가이드 정맥 | 피나클 기술 / BASi 주식회사 | 7032 | |
| 락트산 바이오 센서 | 피나클 기술 | 7004 | |
| 머리 산 | 피나클 기술 | 8402 | |
| 수면 / 바이오 센서 녹화 시스템 | 피나클 기술 | 8400-K1-SL | 이 EEG 채널, 1 EMG 채널, & 1 바이오 센서 |
| 테 더링 마우스 인 체외 보정 키트 | 피나클 기술 | 7000-K1-T | |
| 광섬유 가이드 정맥 | 플라스틱 하나 | C312G | 21 게이지 가이드 정맥 |
| 더미 정맥 | 플라스틱 하나 | C312DC | 21 게이지 더미 |
| 다이아몬드 섬유 스크라이브 | Thorlabs | S90W | |
| 섬유 커넥터 크림프 도구 | Thorlabs | CT042 | |
| 분기 관 | Thorlabs | FT030 | 03.0 mm |
| Thorlabs | T10S13 | 최대 DIA. 0.012 | |
| 분기 튜브 스트리퍼 | Thorlabs | FTS3 | |
| 맨 하드 Cladding 멀티 섬유 | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm 코어, 0.37 NA |
| 와이어 자르는 / 케블라 자르는 가위 | Thorlabs | T865 | |
| 광섬유 에폭시 | Thorlabs | F112 | |
| 섬유 스트리퍼 도구 | Thorlabs | ||
| 유리 연마 플레이트 | Thorlabs | CTG913 | |
| 고무 폴리싱 패드 | Thorlabs | NRS913 | |
| 아이 루페 | Thorlabs | JEL10 | |
| 김 물티슈 | Thorlabs | KW32 | |
| 압축 공기 | Thorlabs | CA3 | |
| 폴리싱 퍽 | Thorlabs | D50-XX | |
| 섬유 검사 범위 | Thorlabs | CL-200 | |
| 연마 영화 | Thorlabs | LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P | |
| FC / PC 커넥터 끝 | Thorlabs | 30126G2-240 | 240 μm의 정공, SS 페럴 |
| MC의 자극 단위 | 멀티 채널 시스템 | STG-4002 | |
| MC의 자극 소프트웨어 | 멀티 채널 시스템 | MC-자극 V 2.1.5 | |
| 블루 레이저 | CrystaLaser | CL473 - 050-0 | |
| 레이저 전원 공급 장치 | CrystaLaser | CL2005 | |
| 광섬유 로타리 조인트 | 도리스 식 렌즈 | FRJ-V4 | |
| 표 2. 용품 및 장비. |
참고문헌
- Magistretti, P. Brain Energy Metabolism. Fundamental Neuroscience. Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. , Academic Press. New York. 389-413 (1999).
- Maquet, P., et al. Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in ma....
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