Summary
Den heterologe biosyntesen av erytromycin A gjennom
Abstract
Den heterologe produksjon av komplekse naturlige produkter er en tilnærming designet for å håndtere dagens begrensninger og fremtidige muligheter. Det er spesielt nyttig for de forbindelser som besitter terapeutisk verdi, men kan ikke være tilstrekkelig produsert eller ville ha nytte av en forbedret form for produksjon. De eksperimentelle prosedyrer involvert kan deles inn i tre komponenter: 1) genetisk overføring, 2) heterologe rekonstituering, og 3) produkt analyse. Hver eksperimentell komponent er under kontinuerlig optimalisering for å møte utfordringene og forutse muligheter knyttet til dette nye tilnærmingen.
Heterologe biosyntesen begynner med identifisering av en genetisk sekvens ansvarlig for en verdifull naturlig produkt. Overføre denne sekvensen til et heterologt vert kompliseres av biosyntetiske vei kompleksitet ansvarlig for produktdannelse. Den antibiotiske erytromycin A er et godt eksempel. Tjue gener (totalt> 50 kb) kreves for eventuell biosyntesen. I tillegg er tre av disse genene koder megasynthases, multi-domene enzymer hver ~ 300 kDa i størrelse. Dette arvestoffet må utformes og overført til E. coli for rekonstituert biosyntesen. Bruken av PCR isolasjon operon konstruksjon, multi-cystronic plasmider, og elektro-transformasjon vil bli beskrevet i overføre erytromycin En genetisk klynge til E. coli.
Når overføres, E. coli celle må støtte eventuell biosyntesen. Denne prosessen er også utfordrende med tanke på de betydelige forskjellene mellom E. coli og mest originale verter ansvarlig for komplekse naturprodukt formasjon. Cellen må gi nødvendige underlag for å støtte biosyntese og coordinately uttrykke overført genetisk klynge å produsere aktive enzymer. I tilfelle av erytromycin A, E. coli celle måtte være konstruert for å gi de to forløpere (propionyl-CoA og (2S)-methylmalonyl-CoA) kreves for biosyntesen. I tillegg ble gensekvensen modifikasjoner, plasmid kopiantallet, chaperonin ko-ekspresjon, posttranslasjonelle enzymatisk modifikasjon, og prosesstemperatur også nødvendig for å tillate endelig erytromycin En formasjon.
Til slutt må vellykket produksjon vurderes. For erytromycin A tilfelle, vil vi presentere to metoder. Den første er væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) for å bekrefte og kvantifisere produksjonen. Den bioaktivitet av erytromycin A vil også bli bekreftet gjennom bruk av en bioassay hvor antibiotisk aktivitet testes mot Bacillus subtilis. Vurderingskriteriene analyser etablerer erytromycin A biosyntesen fra E. coli og satte scenen for fremtidige ingeniører arbeidet med å forbedre eller diversifisere produksjonen og for produksjon av nye komplekse naturlige forbindelser ved hjelp av denne tilnærmingen.
Introduction
Erytromycin A er en polyketide antibiotika produsert av Gram-positive jord bakterien Saccharopolyspora erythraea, og dagens produksjon har blitt gradvis forbedret til ~ 10 g / L gjennom tiår med tradisjonell mutagenese og screening protokoller og senere gjennom prosessoptimalisering ordninger 1-6. Mutagenese og screening strategier er vanlig i antibiotika naturprodukt utvikling som følge av vanskeligheter i dyrking og / eller genetisk manipulere innfødte produksjons verter og på grunn av den lett tilgjengelige antibiotisk aktivitet eller forbedrede vekst fenotyper til hjelp valget. I tilfelle av erytromycin A, S. erythraea begrenses av en langsom vekst profil og mangelen på mer direkte genetiske manipulasjon teknikker (i forhold til organismer som E. coli), og dermed, hinder raske forbedringer i produksjon og biosyntesen av nye derivater. Etter å ha erkjent produksjon problemer og ulåst diversificatipå muligheter med forbindelser som erytromycin A, begynte forskningsmiljøene til å forfølge ideen om heterologe biosyntesen (figur 1) 7. Dette arbeidet falt sammen med tilgjengelig sekvens informasjon for erytromycin A clusteret 8-11. Det bør understrekes at antall sekvensert komplekse naturlige produkter genet klynger har sterkt utvidet 12-16, som gir drivkraft til fortsatt innsats i heterolog biosyntesen å få tilgang kodet medisinsk potensial. Å gjøre det, krever heterologe rekonstituering at den nye verten møte behovene til den spesifikke biosyntetiske vei. E. coli gir teknisk bekvemmelighet, et bredt spenner sett av molekylærbiologiske teknikker, og metabolske og prosessteknikk strategier for produktutvikling. Likevel, sammenlignet med innfødte produksjon verter, E. coli ikke viser den samme grad av kompleks naturprodukt produksjon. Det var derfor ukjent om E. coli kan tjene som et levedyktig heterologt alternativ for kompleks naturprodukt biosyntesen. Imidlertid ble det antatt at E. coli ville være et ideelt vertsorganisme hvis heterolog biosyntesen kunne oppnås.
Med dette målet i tankene, begynte første forsøk på å produsere polyketide aglycone 6-deoxyerythronolide B (6dEB) gjennom E. coli. Men innfødt E. coli metabolisme kunne ikke gi nevneverdig nivåer av propionyl-CoA og (2S)-methylmalonyl-CoA forløpere nødvendig for å støtte 6dEB biosyntese heller kunne den nye verten etter translationally endre deoxyerythronolide B syntase (DEBS) enzymer. For å bøte på disse problemene, ble en metabolismevei bestående av innfødte og heterologe enzymer bygget inn E. coli slik at eksogent matet etylpropionat ble konvertert intracellulært til propionyl-CoA og deretter (2S)-methylmalonyl-CoA; under prosjektering å fullføre denne veien, ble en SFP genet plasseres i the kromosom av E. coli BL21 (DE3) til å lage en ny stamme kalt BAP1. SFP enzymet er en phosphopantetheinyl transferase stand feste 4'-phosphopantetheine kofaktor til Debs enzymer 17,18. De tre Debs gener (hver ~ 10 kb) ble deretter plassert på to separat valgbare ekspresjonsvektorer inneholdende induserbare T7 promotorer. Etter en nøkkel justering av post-induksjon temperatur (til 22 ° C), ble Debs gener coordinately uttrykt innen BAP1 i en aktiv tilstand i stand til å generere 6dEB 19.
Jakten på hele erytromycin A biosyntesen deretter begynte å bruke en tilsvarende clusteret fra Micromonospora megalomicea eller en hybrid vei sammensatt av gener fra S. erythraea, S. fradiae og S. venezuelae som produserte mellomproduktene erytromycin C og 6-deoxyerythromycin D, henholdsvis 20-22. Nylig har vår gruppe utvidet dette arbeidet ved å produsere erythromycin A (mest klinisk relevant form av erytromycin) gjennom E. coli. I motsetning til tidligere arbeid, vår strategi coordinately uttrykte 20 originale S. erythraea gener som trengs for polyketide biosyntese, deoxysugar biosyntese og vedlegg, ytterligere skreddersøm, og selv-motstand (figur 2). I alt ble 26 (innfødt og heterologe) gener konstruert for å tillate E. coli å produsere erytromycin A ved 4 mg / L 23,24. Dette resultatet etablert komplette produksjons av et komplekst polyketide naturprodukt hjelp E. coli og fungerer som et grunnlag for å utnytte denne nye produksjonen alternativet eller forfølge nye.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Teksten nedenfor er spesifikt for erytromycin A antibiotikum, men fremgangsmåten er utformet for å være generelt anvendelig til andre naturlige produkter som kandidater for heterolog biosyntesen.
1. Erytromycin A Genetic Cluster Transfer
- Fotografi PCR primere til å forsterke alle gener forbundet med erytromycin En klynge innenfor S. erythraea kromosom. Dette trinnet er spesifikk for de naturlig produkt kandidater som genetiske sekvenser er fastsatt. Alternativt kan de nødvendige gener bli syntetisert (gjennom flere kommersielle leverandører alternativer) med den fordel at de nylig syntetiserte gener vil være utformet for optimal kodon bruk i den nye E. coli vert. Hvis DNA-syntese er forfulgt, er en aktuell utfordring genererer megasynthase gener som kan overstige 10 kb i lengde. Teknisk sett kan syntese oppnås, men det er utfordrende og kostbare. Det er forventet at kontinuerlig improvementene i genet syntese teknologi vil arbeide med aktuelle ulemper og videre validere denne tilnærmingen for å gi heterologe genetisk materiale.
- Utfør PCR ved hjelp av nystekte forberedt S. erythraea genomisk DNA som en mal. Det kromosomale DNA kan fremstilles fra kulturer av S. erythraea eller fra frosne bestander av bakterien (Figur 3) 25. PCR reaksjoner kan dra nytte av den tilsetning av DMSO (4 pl i 50 pl reaksjoner) å ta hensyn til høy G+ C innhold i målet S. erythraea gener. Hver amplifisert genet bør sekvensert for å bekrefte at den fulle-genet er blitt hentet, og at ingen mutasjoner er blitt innført under PCR-prosessen.
- Gjennom restriksjon fordøye og ligering, sette inn hvert av de isolerte gener inn ekspresjonsvektorer utformet for E. coli (figur 3). Dette er initiert ved å utforme restriksjonsseter innenfor PCR primere for å tillate fordøyelsen og ligering i egnede expression vektorer (et eksempel er inkludert i figur 3). Vi har brukt både pET21 og pET28 vektorer. Den pET28 vektor tillater inkludering av en 5 'leder sekvens som hjulpet genuttrykk i erytromycin En sak. Bekreft individuell genekspresjon gjennom RT-PCR, SDS-PAGE-analyse (ved hjelp av oppløselige proteinfraksjoner), eller praktisk fenotypiske assays (figur 4).
- Konstruer operons basert på gener vellykket uttrykt fra individuelle uttrykk plasmider (figur 3). Vi har tradisjonelt brukt kombinasjoner av kompatibel-kohesive restriksjonsenzymer (for eksempel Xbal og Spe I) 24 til sekvensielt konvertere gener til operons, men må restriksjonsseter valgt for operon byggingen ikke bor innenfor (eller må fjernes fra) den isolerte gensekvenser (et problem som kan unngås hvis genet syntese brukes). Dette trinnet konsoliderer 20 erytromycin A gener før E. coli TRANSFOrmation. Foreløpig har vi brukt denne metoden for å inkludere opptil 20 kb av fremmed DNA inn en standard pET vektor (to gener av ~ 10 kb hver). Videre har vi brukt denne tilnærmingen til å generere operons inneholder ni gener. Det er ukjent nøyaktig hvor mye DNA eller mange gener kan integreres i pET-attraksjon plasmider, men beregningene sitert ovenfor gir en referanse for kompliserte systemer som erytromycin biosyntetiske vei. Endelig standard in vitro ligation trinn og påfølgende vellykkede transformasjon trinn blir stadig vanskeligere som operon og plasmid størrelsen øker. Ligeringen temperatur (12-22 ° C) og tiden (3-24 t) er variert og elektro-transformasjon anvendes for å hjelpe prosessen med å produsere endelige plasmidkonstruksjoner.
- Transformere de nydesignede biosyntetiske plasmider inn E. coli-stamme BAP1 med elektro-transformasjon (figur 5). Prosedyren kan forsøkes med plasmider innføres enten sekvensielt eller i combination. Når transformerende størrelse-stand eller mange plasmider, har vi tradisjonelt brukt elektro-transformasjon (i motsetning til kjemisk transformasjon). Gang transformert, tallerken cellene på fast LB-medium inneholdende tetracyklin (5 mg / l), Carbenicillin (100 mg / l), kanamycin (50 mg / l), streptomycin (50 mg / l), og apramycin (50 mg / l ) for å velge for plasmid vedlikehold. Det er svært uvanlig å bruke seks forskjellige utvalg antibiotika etter transformasjon av en E. coli celle, men dette gjenspeiler simpelthen det totale antall plasmider kreves for å tillate endelig erytromycin A biosyntesen. Mens det er mulig, vil tilnærmingen begrense produksjon egenskapene forbindelsen når dyrking har begynt (se nedenfor).
2. E. coli Biosyntetiske Rekonstituering
- Strain BAP1 har blitt designet for å gi de nødvendige underlag for biosyntese og til post-translationally endre deoxyerythronolide B megasynthase. Enkelte gener i erythromycin En vei har blitt testet for genuttrykk og konsolidert som operons i uttrykket plasmider. Denne delen er dedikert til kultur forhold til å teste for felles aktivitet av hele erytromycin A veien.
- Ta 3 separate kolonier av ferskt transformert BAP1 og inokuler 1,5 ml LB kulturer inneholdende de nødvendige plasmid valg antibiotika (ved de samme konsentrasjonene angitt ovenfor for å selektere for transformanter på fast medium), isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 100 uM ) og arabinose (2 mg / ml) for å indusere genekspresjon, og 20 mM natrium propionate å støtte intracellulær biosyntetiske forløper formasjon. Når produksjonen er bekreftet, kan større kulturer gjennomføres i et forsøk på å skalere og maksimere produktet titere.
- Kultur cellene ved 22 ° C og 250 rpm i 24-48 timer. I dette tilfellet sikrer antibiotika utvalg at de nødvendige plasmider blir opprettholdt i de tidlige stadier av cellulær kultur. Imidlertid plasmids kan lett gå tapt som valg antibiotiske nivåer endres i løpet av den perioden dyrkning. Dette kan føre til ustabilitet plasmid (dvs. tap av en eller flere plasmider under kultur), som da ville begrense produksjon evne. Problemet blir forverret når uforenlige plasmider brukes til å introdusere en komplett heterolog clusteret. Slik er tilfellet for erytromycin A forbindelsen (figur 5), og vil måtte bli avhjelpes å virkelig overprodusere forbindelsen fra E. coli. Imidlertid, for det formål å demonstrere innledende produksjon, blir slike design feil tolerert av hensyn massedrap etablere gjennomførbarheten av heterologe tilnærming.
- Klargjøre kulturene ved sentrifugering ved 10.000 rpm i en Eppendorf mikrosentrifuge. Supernatanten fjernes og oppbevar ved 4 ° C for analyse.
- I tilfelle av erytromycin A, mangel på sammensatte produksjonen ble adressert av inkludering av Groes / EL chaperonin (med pGro7spesielt for å ta mangel på aktivitet av enzymene etter uttrykk) og inkludering av ytterligere gen kopier (for de gener som er mistenkt for svak ekspresjon / aktivitet). Lignende strategier kan være nødvendig med andre heterologe naturlige produkter produksjon innsats.
3. Produktet Analyse
- Å bekrefte og kvantifisere erytromycin En formasjon, injiserer kulturen supernatanten på en LC-MS-system (figur 6). Kommersielt tilgjengelig erytromycin A ble brukt for å bekrefte produksjon og som en standard under kvantifisering. For saker uten kommersielt tilgjengelige standarder, ville LC-MS-analyse krever ekstra kjemisk karakterisering av NMR og høy oppløsning massespektrometri.
- Sammenlign produksjonen mellom de tre kolonier / kulturer fra BAP1 transformasjon. Velg den høyeste produsent og utarbeide en glyserol lager fra kolonien kilde. Dette trinnet kan utføres parallelt med produksjons kulturene protokoll Seksjon2 ved hjelp av en liten del av kulturene for å forberede glyserol aksjer. Oppbevar glyserol lager i en -80 ° C fryser.
- Bruke bekreftet, mestproduserende celle lager, begynner en egen produksjonslinje kultur og trekke den endelige supernatant med 2x volum etylacetat. Bruk et vakuum fordamping system for å tørke ekstraktet og resuspender i 100 pl metanol. Overfør ekstraktet til et sterilt filter disk (~ 1/4 tommers diameter) og la disken tørke. Separat, kultur B. subtillis i LB væske over natten. Tilsett 20 pl av den B. subtilis kultur til 20 ml flytende LB-agar ved 45 ° C. Plate agar og tillate å stivne. Plasser filteret disken på plate og inkuber ved 37 ° C (fig. 7). Alternativt kan ekstraktet tilsettes flytende kulturer innenfor en 96-brønns plate å kvantifisere aktiviteten ved hjelp av en plate-leser (figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det ønskede resultatet av denne tilnærmingen er produksjonen av en fullt bioaktiv naturlig produkt fra E. coli heterologe vert. Dette er best representert ved de LC-MS blir brukt til å bekrefte og kvantifisere produksjonen (figur 6) og den antibakterielle bioassay brukt til å bekrefte endelige aktivitet (figur 7). I den generelle ordningen med heterolog biosyntese, definerer dette resultatet suksess. Når oppnådd, forskning og slå til optimalisering (både på mobilnettet og prosess skalaer) og molekylær engineering. De endelige mål inkluderer økonomiske produksjonsprosesser for den opprinnelige forbindelsen og kontroll over det heterologe systemet slik at rasjonelle modifikasjoner prosessen kan bli gjort for å produsere varianter av den opprinnelige forbindelsen med potensialet for en forsterket eller utvidet aktivitet spektrum.
Unnlatelse å produsere den ønskede forbindelse utløser så tallrike beredskapsplaner to vurdere hvilken del av tilnærmingen forbyr vellykket biosyntesen. Mange av disse feilsøking mekanismer er i bygget i fremgangsmåten ovenfor. I vår erfaring, er det viktig, som et minimum, for å bekrefte vellykket genekspresjon (SDS-PAGE-analyse av oppløselige biosyntetiske enzymer) av nylig introduserte clusteret før prøver å vurdere biosyntesen av det dannede naturprodukt. Post uttrykk, som indikert ovenfor, har bruken av proteinfolding anstand, forbedret genet kopitall og prosesstemperatur vært effektive middel for å tillate eventuell biosyntesen.
Figur 1. En samlet fremstilling av heterologe naturprodukt biosyntetiske ordningen med erytromycin Forbindelse. De eksperimentelle skritt som kreves inkluderer 1) utforming og overføring av erytromycin clusteret frOm S. erythraea til E. coli, 2) rekonstituering av biosyntese innen E. coli, og 3) produkt analyse av erytromycin A.
Figur 2. A. erytromycin clusteret som organiseres i den innfødte S. erythraea kromosom. B. Erytromycin A biosyntesen. Innen E. coli er SFP enzym som kreves for posttranslational modifisering av DEBS1, 2, og 3 polyketide syntase enzymer (hver> 300 kDa), dette er betegnet med koble armen tilknyttet hver ACP domene. De Debs enzymer danner en α 2 β 2 γ 2 kompleks inndeles i modulenheter som katalyserer de sammenhengende kondensasjoner av en starter propionyl-CoA enhet og seks (2 S)-methylmalonyl-CoA extender enhetene å danne polyketide 6-deoxyerythronolide B (6dEB). KS-ketosynthase, AT-acyl transferase, ACP-acyl carrier protein, KR-ketoreductase (med inaktive KR bemerket i Modul 3), DH-dehydratase, ER-enoyl reduktase, TE-thioesterase. En PrpE (propionyl-CoA syntetase) og PCC (propionyl-CoA karboksylase, sammensatt av to protein subenheter) er nødvendig for å konvertere eksogen propionate til begynner underlag propionyl-CoA og (2 S)-methylmalonyl-CoA. Genene for SFP og PrpE tidligere konstruert innenfor BAP1 E. coli kromosom 19. Konvertering av 6dEB molekyl til erytromycin oppnås ved deoxysugar biosyntese og vedlegg, ytterligere skreddersøm, og selv-motstand enzymer. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. A. Isolering av enkelte gener som kreves for erytromycin A biosyntesen (unntatt de tre Debs gener). Individuell plasmid design inkludert PCR oligonukleotidprimerer brukes for å isolere eryCI, primer restriksjonsseter er angitt i fet skrift og komplementær sekvens er understreket. Også inkludert er restriksjonen analyse av de resulterende pET21 og pET28 vektorer inneholdende individuelle gener og operons. B. jeg. Konsolidering av biosyntetiske gener som trengs for polyketide skreddersøm som operons for introduksjon til E. .. coli ii Restriction nettstedet og andre uttrykk elementer involvert med operon konstruksjon og design, X / S representerer den kompatible-sammenhengende ligation av Xbal og Spe I områder som resulterer i en ny sekvens ukjent ved enten restrictipå enzymet. Klikk her for å se figur 3 .
Figur 4. A. SDS-PAGE-analyse av de individuelle gener som presenteres i figur 3.. Stjernene betegne disse genene uttrykt med 5 'leder sekvenser som følge av pET28 ekspresjonsvektor. B. Fenotypisk vurdering av Erme (erytromycin A motstand). Erytromycin A innenfor fast medium som brukes til å teste E. coli stammer harboring plasmider med eller uten Erme erytromycin A motstand genet. Cellevekst er reddet med med Erme uttrykk.
Figur 5. A. Skjematisk av full erytromycin A pathway introdusert til E. coli, inkludert en plasmid for GroEL / ES chaperonin (pGro7) og et plasmid som inneholder en ekstra kopi av Eryk. B. Transformasjon sammenligning mellom kjemiske og elektro metoder bruker både kombinasjon (i) og sekvensiell (ii) innføring av plasmider. C. plasmidstabilitet av transformert belastning. Klikk her for å se større figur .
Figur 6. En standard LC-MS spor av erytromycin A produsert fra E. coli.
Figur 7. A. Fast fase bioassay av filter disker som inneholder jeg. Trekke fra en uninduced BAP1 E. coli negativ kontroll, ii kommersielt tilgjengelig erytromycin A (positiv kontroll),.. og iii erytromycin A hentet fra en indusert BAP1 E. coli system. Skivene ble belagt på en plen av B. subtilis bakterier og resulterende soner av hemming indikerer antibiotisk aktivitet. B. Assay demonstrert i væskefase ved hjelp av 96-brønns plate tidsforløp prøver. Klikk her for å vise større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinnene i heterolog biosyntesen påtreffes ved hvert av de tre prosessuelle punkter i prosessen: 1) genetisk overføring, 2) biosyntetiske rekonstituering, og 3) produktet analyse. Et problem på ethvert stadium vil avspore den ultimate målet om etablering heterologt biosyntesen. Kanskje den mest utfordrende aspekt av prosessen er å etablere rekonstituert biosyntese, siden dette er absolutt nødvendig for å tillate vellykket analyse. Imidlertid er rekonstituering avhengig forsiktig design og overføring av det genetiske materialet er ansvarlig for eventuell biosyntesen. Likeledes etablert, kan følsomme analysemetoder (som LC-MS) oppdage små titer nivåer som ellers kan tolkes som mangel på produksjon. Det er kulminasjonen av disse situasjonene som gjør heterolog biosyntesen utfordrende.
Med hensyn til erytromycin A eksempel ble bekreftet gensekvenser isolert av PCR individuelt testet for expression før konsolidere genene for samordnet uttrykk og naturlig produkt formasjon. Under første forsøk på produktutvikling analysen ble mellomliggende forbindelser først identifisert bare når en chaperonin (GroEL / ES) var co-uttrykt med den nødvendige clusteret. Det endelige produktet ble bare produsert når en ekstra kopi av genet er ansvarlig for det siste trinnet i biosyntesen (Eryk) ble inkludert. Begge disse tiltakene godt av det følsomme LC-MS analytisk metode som brukes til utgangspunktet vurdere produksjonen.
Nå som produksjonen er blitt bekreftet, E. coli cellular bakgrunn tilbyr en rekke tekniske muligheter. Hvorav den første er å optimalisere produksjonen av de innfødte erytromycin Forbindelse. Dette ville tilby et alternativ produksjon rute med potensielle besparelser i prosessen tid og kostnader. Videre erytromycin A veien kan bli manipulert for det formål å spre produktdannelse. Nye analoger tilbypotensialet for ny antibiotikum (eller andre terapeutiske) aktivitet. De samme muligheter for generelle anvendelser av heterolog biosyntese og gir den primære motivasjonen for tilnærming, videre støttet av de problemstillinger med mange originale organismer. Stadige applikasjoner og forbedringer av tilnærming beskrevet i denne artikkelen vil øke frekvensen av fremtidige heterolog biosyntetiske suksess.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne takke NIH (AI074224 og GM085323) og NSF (0.712.019 og 0.924.699) om midler til å støtte prosjekter dedikert til heterologt biosyntesen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
| Electroporator | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Fisher | BP1620 | |
| Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
| L-arabinose | Sigma | A3256 | |
| Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
| pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |
References
- Adrio, J. L., Demain, A. L. Genetic improvement of processes yielding microbial products. FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).
- Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb). Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).
- Chen, Y., et al. Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).
- McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W. "Ilotycin," a new antibiotic. Antibiot & Chemother. 2, 281-284 (1952).
- Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea. Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).
- Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale. Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).
- Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. Methods and options for the heterologous production of complex natural products. Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).
- Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea. Nature. 348, 176-178 (1990).
- Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis. Science. 252, 675-679 (1991).
- Salah-Bey, K., et al. Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea. Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).
- Summers, R. G., et al. Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production. Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).
- Corre, C., Challis, G. L. New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining. Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).
- McAlpine, J. B. Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products. J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).
- Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes. Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).
- Oliynyk, M., et al. Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338. Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).
- Wilkinson, B., Micklefield, J. Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways. Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).
- Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases. Science. 284, 482-485 (1999).
- Quadri, L. E., et al. Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases. Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).
- Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science. 291, 1790-1792 (2001).
- Lee, H. Y., Khosla, C. Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli. PLoS Biol. 5, e45 (2007).
- Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).
- Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products. Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).
- Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering. Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).
- Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host. Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. Norwich, UK. (2000).
