Summary
Bitki viral nanopartiküller (VNPs) biyomedikal uygulamalar için platformlar umut vericidir. Burada, biz bitki VNP yayılımı, saflaştırma, karakterizasyon ve bioconjugation ilişkin prosedürler anlatılmaktadır. Son olarak, biz bir fare ksenogreft model ve floresan görüntüleme kullanılarak tümör homing ve görüntüleme için VNPs uygulama göstermektedir.
Abstract
Nanomalzemelerin kullanımı malzeme bilimi ve tıp devrim potansiyeline sahiptir. Şu anda değişik nanopartiküller bir dizi görüntüleme ve tedavi uygulamaları için araştırılmaktadır. Bitkilerden elde edilen viral nanopartikül (VNPs) belirlenmiş boyutlarda ve şekillerde ile kendini monte bionanomaterials olarak kabul edilebilir. Steinmetz laboratuarda inceleme altına Bitki virüsleri çapı 30 nm her ikisi de Börülce mozaik virüsü (CPMV) ve Brom mozaik virüsü (BMV) oluşan icosahedral parçacıkları içerir. Biz de şu bitki virüsleri türetilen çubuk şeklinde ve ipliksi yapılar geliştiriyoruz: 18 nm 300 nm boyutlarında ve ipliksi parçacıklar 515 oluştururlar Patates X virüsü (PVX), rijit çubuklar oluşturur Tütün mozaik virüsü (TMV), uzunluk ve genişlik olarak 13 nm olarak nm (okuyucu Refs ifade edilir. VNPs hakkında daha fazla bilgi için 1 ve 2).
planta büyük ölçekte kolaylıkla üretilebilir, son derece istikrarlı ve biyouyumlu vardır. Ayrıca, VNPs özellikle genetik modifikasyon veya kimyasal bioconjugation yöntemleri 3 kullanılarak tasarlanmış olabilir "programlanabilir" birimlerdir. VNPs yapısı atomik çözüm bulunmakta olduğu bilinmektedir, ve modifikasyonlar atomik seviyede 4, mevcut teknoloji teknolojileri ile sentetik nano kullanılarak elde edilemeyen bir kontrol seviyesinde uzaysal hassasiyet ile gerçekleştirilebilir.
Bu yazıda CPMV, PVX, TMV ve Vigna ungiuculata ve Nicotiana benthamiana bitkilerde BMV yayılımı tanımlar. Her VNP için Ekstraksiyon ve saflaştırma protokolleri verilmektedir. Saflaştırılmış ve kimyasal-etiketli VNPs karakterizasyonu için yöntemler tarif edilmiştir. Bu çalışmada, ch odaklanmakemical florofor ile VNPs etiketlenmesi (örneğin Alexa Fluor 647) ve polietilen glikol (PEG). Boyalar izleme ve 5-10 VNPs tespiti kolaylaştırmak ve onların farmakokinetiği 8,11 artırırken PEG protein nanopartiküller immünojenite azaltır. Biz bir fare ksenogreft tümör modeli kullanılarak Pegile VNPs yuvalandırma tümör ortaya. Maestro Görüntüleme Sistemi kullanılarak dokuların ex vivo floresan görüntüleme, homojenize dokularda floresans ölçme ve konfokal mikroskopi kombinasyonu biyodağılımını incelemek için kullanılır. VNPs retiküloendotelyal sistem (RES) ile temizlenir; homing tümör geliştirilmiş geçirgenlik ve saklama (EPR) etkisi 12 ile pasif olarak elde edilir. VNP nanoteknoloji güçlü bir plug-and-play görüntü teknolojisi ve in vivo hastalık siteleri tedavi. Bu daha fazla ilaç için yük ve klinik olarak-ilgili görüntüleme kısımları gibi doku-spesifik ligandlar taşımak için VNPs geliştirmektedirkanser ve kardiyovasküler hastalık aşırı eksprese moleküler reseptörleri hedef.
Protocol
1. VNP (CPMV, BMV, PVX ve TMV) Yayılım
- Kapalı bitki odasının günün 15 saat (% 100 ışık, 25 ° C,% 65 nem) ve gece 9 saat (% 0 ışık, 22 ° C,% 60 nem) kontrollerini ayarlayın.
- Tablo 1'de çizelgesine göre bitki inoküle edin.
| CPMV | PVX, TMV ve BMV |
| Gün 0: Bitki 3 börülce tohum / saksı. | Gün 0: Bitki ~ 30 N. benthamiana tohum / saksı. 1 çorba kaşığı gübre / 5 L su ile haftada bir kez gübreleyin. |
| Gün 14: 1 Bitki / pot Re-pot N. benthamiana. | |
| Gün 10: Infect korindon tozunu bir ışık kullanarak mekanik inokulasyon tarafından CPMV (5 μg/50 ul / yaprak) ile primer yapraklar bırakır. | Gün 28: Infect üç five korindon tozunu bir ışık kullanarak mekanik inokulasyon yoluyla PVX, TMV veya BMV (5 μg/50 ul / yaprak) ile bırakır. |
| Gün 20: Hasat yaprak ve -80 mağaza ° C. | Gün 42: Hasat yaprak ve -80 mağaza ° C. |
, Büyüyen bulaşmasını ve yaprakları hasat için Tablo 1. Timeline.
Not: Sadece CPMV yayma, örnek olarak gösterilmiştir.
2. VNP (CPMV, BMV, PVX, ve TMV) saflaştırılması
Not: Tüm adımlar buz üzerinde veya 4 yürütülmektedir ° C
- Soğuk tampon 2 cilt (bkz. Tablo 2) kullanılarak standart bir blender dondurulmuş yaprakları 100 g homojenize. Tülbent 2-3 katmanları süzülür.
- PVX için, 1 M HCl ile pH 6.5 'e ayarlayın. % 0.2 (w / v) askorbik asit ve% 0.2 (w / v) sodyum sulfi eklemete.
- 20 dakika boyunca 5.500 xg'de ham bitki Homojenat santrifüjleyin. Süpernatant toplayın.
- BMV için, tabaka% 10 (w / v) sakaroz çözeltisi, 5 ml süpernatant üzerine, 25 ml. % 38.5 CsCl çözeltisi (w / v) içinde 3 saat ve pelet tekrar süspansiyon 9,000 x g'de santrifüjleyin. 5 saat sallayarak karıştırın, ardından adım 2.12 ile devam edin.
- 1:1 (v / v) kloroform :1-bütanol 0.7 hacim ekleme yoluyla bitki materyali ayıklamak. 30-60 dakika boyunca karışımı karıştırın.
- 20 dakika boyunca 5,500 x g çözelti santrifüjleyin. Üst sulu faz toplanır.
- M 0.2 ve% 8 (ağırlık / hacim) PEG (MW 8000) ile NaCl ekleyin. TMV için, aynı zamanda (v / v) Triton X-100,% 1 ekleyin. En az 1 saat süre ile karıştırınız, sonra en az 1 saat boyunca bekletilir.
- 15 dakika boyunca 15.000 xg'de çözümü santrifüjleyin. 10 ml tampon içinde yeniden süspanse pelet. PVX için, 0.5 M için% 0.1 β-merkaptoetanol ve üre ekleyin
- 30 dakika boyunca 8.000 xg'de santrifüjleyin ve süpernatant toplamak.
- 3 saat boyunca 160,000 x g süpernatant Ultrasantrifüj. 5 ml tampon o da süspanse peletvernight.
- Eşit hacimde% 10,% 20,% 30, ve tampon içinde% 40 sakaroz (ağır ilk) ile bir% 10-40 oranında sakaroz eğim hazırlayın. Gradyan oda sıcaklığında gece boyunca dengelenmeye bırakın.
- Ultrasantrifüj 2 saat (BMV için 24 saat) için 100.000 xg'de sukroz gradient üzerinde pelet yeniden süspanse.
- Işık saçılması bandı toplayın ve tampon karşı dialyze.
- 4'te VNPs (aşağıda) ve mağaza Karakterize ° C. Uzun süreli depolama için, -80 ° C'de saklayın
| CPMV ve TMV | 0.1 M potasyum fosfat tamponu (pH 7.0) 38.5 mM KH 2 PO 4 61.5 mM K 2 HPO 4 |
| PVX | 0.5 M borat tamponu (pH 7.8) 0.5 M borik asit NaOH ile pH ayarlama |
| BMV | SAMA tamponu (pH 4.5) 250 mM sodyum asetat 10 mM MgCl2 2 mM β-merkaptoetanol (taze ekleyin) |
Tablo 2. Her VNP için Tamponlar ve kendi tarifleri.
Not: Sadece CPMV yayma, örnek olarak gösterilmiştir.
3. VNP (CPMV, BMV, PVX ve TMV) Karakterizasyonu
- VNPs konsantrasyonunu belirlemek için UV / Görünür Bölge spektroskopisi gerçekleştirin.
- Bir Nanodrop spektrofotometre kullanılarak numunenin 2 ul absorbansı ölçülür.
- Beer-Lambert yasası kullanılarak partikül ve boyaların konsantrasyonu belirleyin (A absorbans A = εcl, ε sönüm katsayısı, c konsantrasyon ve l yol uzunluğu). Yol uzunluğu Nanodrop için 0,1 cm dir.
VNP özgü nesli katsayıları şunlardır:
CPMV: 8.1 cm -1 mg -1 ml (260 nm)
PVX: 2.97 cm -1 mg -1 ml (260 nm)
TMV: 3,0 cm -1 mg -1 ml (260 nm)
BMV: 5.15 cm -1 mg -1 ml (260 nm)
- Boyut dışlama hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) parçacıkları analiz edin.
- Bir Superpoze 6 boyut dışlama kolon ve AKTA Explorer, 0.1 M potasyum fosfat tamponu (pH 7.0) ve 200 ul içinde VNPs yük 50-100 ug kullanılması.
- 260 nm (nükleik asit), 280 nm (protein) ve bağlı herhangi boyaların uyarma dalga boyu dedektörü olarak ayarlayın.
- 72 dakika boyunca 0.5 ml / dak 'lık bir akış hızında çalışırlar.
- Elüsyon profili ve A260: A280 nm VNP hazırlık saf olup olmadığını ve parçacıklar sağlam ve monte olup olmadığını gösterir.
Aşağıdaki A260: 280 oranlarında saf VNP hazırlık göstermektedir:
CPMV: 1,8 ± 0,1
PVX: 1.2 ± 0.1
TMV:1.1 ± 0.1
BMV: 1.7 ± 0.1
- Bireysel kat proteinlere hazırlanması ve konjugasyon saflığını analiz (prekast NuPAGE) Bis-Tris poliakrilamid 4-12% gradyan jel elektroforezi denatüre gerçekleştirin.
- Potasyum fosfat tampon 9 ul içinde 10 ug parçacıkların için 4x LDS numune tamponu 3 ml ilave edilir. Disülfid bağlarının yüksek sayısını azaltmak için BMV 4x LDS örnek tampon ve β-merkaptoetanol 3 ul ilave 1 ul ekleyin.
- 100, 5 dakika süreyle ısıtma bloğu içinde inkübe ° C.
- SDS jel üzerine örnekler yükleyin.
- Tampon çalıştıran 1x MOPS 1 saat için 200 V örnekleri çalıştırın.
- Floresan ceket proteinleri görselleştirmek için UV ışık altında jel belgeleyin.
- Floresan olmayan protein için, 1 saat için Coomassie mavisi (% 0.25 (w / v) Coomassie Brillant Blue R-250,% 30 (v / v) metanol,% 10 (v / v) asetik asit) ile leke.
- Gece boyunca% 30 metanol,% 10 asetik asit ile Destain. Change çözüm isteniyorsa.
- Beyaz ışık altında jel belgeleyin.
- Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından parçacıkların bütünlüğünü analiz.
- 0.1-1 mg / DI su 20 ul ml numune sulandırınız.
- Parafilm ile ilgili örnekler 20 ul damla yerleştirin.
- TEM ızgara ile damla örtün ve 2 dakika bekletin. Filtre kağıdı ile ızgara üzerinde aşırı Solüsyon Wick.
- Kuru esneklik ardından DI bir damla su üzerine koyarak ızgara yıkayın.
- % 2'lik bir 20 ul damla (w / v) 2 dk için uranil asetat ile ilgili yerleştirilmesi ile ızgara Leke. Filtre kağıdı ile leke aşırı kapalı Wick.
- Suda bir kez daha ızgara yıkayın.
- Bir transmisyon elektron mikroskobu altında ızgara gözlemleyin.
4. PEG ve fluorophores, Saflaştırılması, ve karakterizasyonu ile VNPs Kimyasal Konjugasyon
- Aşağıdaki reaksiyonlar için hesaplamalar için, VNPs molar kütlesi vardır:
CPMV: 5.6x 10 6 g / mol
PVX: 35 x 10 6 g / mol
TMV: 41 x 10 6 g / mol
BMV: 4.6 x 10 6 g / mol - Tek adımlı bir N-hidroksi süksinimit bağlama reaksiyonu kullanılarak CPMV ve PVX yüzey lysines ile boyalar ve PEG konjugatı: Alexa Fluor 647 süksinimidil ester ve 4.500, 2.500 eşdeğer molar eşdeğerleri (tüm molar aşırı VNP göre molar fazlalıkta bakınız) ekleyin NHS PEG (MW 5,000) 0.1 M potasyum fosfat tamponu içinde CPMV için DMSO içinde çözülür. PVX çalışırken, NHS-boya ve NHS-PEG 10.000 molar aşırı ekleyin. CPMV ve PVX nihai konsantrasyon 2 mg / ml DMSO ve içeriği toplam reaksiyon hacmi% 10 olacağı şekilde DMSO ve tampon hacim ayarlayın. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı gece boyunca inkübe edin. CPMV ve PVX, sırasıyla, 300 ve 1,270 adreslenebilir lysines sahiptir. (Okuyucu üzerine daha ileri okumalar için aşağıdaki referanslar denirCPMV ve PVX kimyasal modifikasyonu: 13-15).
- Diazonyum kaplin ile TMV tirozinlerin konjugat boyalar ve PEG bakır (I) katalizli azit-alkin siklo izledi.
- 0.3 M p-tolüensülfonik asit monohidrat, 3.0 M sodyum nitritin 25 ul, ve 0.68 M damıtık, 1 saat boyunca 4 ° C 'de, asetonitril içerisinde çözündürüldü 3-ethynylaniline için 75 ul 400 ul karıştırılarak diazonyum tuzu (alkin) hazırlayın.
- TMV 1.25 ml (20 mg / ml stok çözeltisi) için NaCl 100 mM borat tamponu, pH 8.8, 3.3 ml ilave edilir.
- Bir alkin ligasyon diazonyum bağlanması ile TMV işlemek için eklemek için 3 saat boyunca bir buz banyosu içinde diazonyum tuzu (alkin) çözeltisi 450 ul TMV React. Çözüm açık kahverengi bir renk dönüşecektir. TMV konjugasyon için 2.140 kullanılabilir tirozinlerin vardır.
- Adım 4.4 'de tarif edildiği gibi bir sükroz tampon kullanarak nihai ürün üzerine koyulmuştur.
- Azid fonksiyonlu Alexa Fluor 647 ve PEG-azid (MW 5000) istimal takıng bakır (I) katalizli azit-alkin siklo (CuAAC). 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG, ve 15 dakika süreyle oda sıcaklığında 2 mM sodyum askorbat ile kılıf proteini ve inkübe başına boya ve PEG-azit 2 eşdeğer ekleyin. TMV nihai konsantrasyon tepki 2 mg / ml 'dir ki bu tür tampon hacim ayarlama. (: 16,17 okuyucu TMV kimyasal modifikasyonu üzerine daha ileri okumalar için aşağıdaki referanslar denir).
- Lysines ve BMV sistein mutant (cBMV) ve sistein ile PEG boyalar Dualı:
- 0.1 M TNKM tampon maddesi (50 mM Tris baz, 50 mM NaCI, 10 mM KCI, 5 mM MgCl2, pH 7.4) içinde cBMV için DMSO içinde çözülür Oregon Green 488 süksinimidil ester, 2.000 molar eşdeğer ekleyin. BMV nihai konsantrasyon 1 mg / ml DMSO ve içeriği toplam reaksiyon hacmi% 10 olacağı şekilde DMSO ve tampon hacim ayarlayın. 4. gece boyunca reaksiyon karışımı inkübe ° C'de ışıktan korunur.
- Santrifüje kullanarak Purify parçacıklarolarak fugal filtreleri adım 4.4 'de tanımlanmıştır.
- Daha önce olduğu gibi aynı reaksiyon koşulları kullanılarak, PEG-maleimit (MW 2,000), 2.000 molar fazlası ilave edin ve 4 de 2 saat boyunca, reaksiyon karışımı inkübe ° C cBMV 180 reaktif lysines ve sistein sahiptir. (: 18 okuyucu BMV kimyasal modifikasyonu üzerine daha ileri okumalar için aşağıdaki referanslar denir).
- Saflaştırma: 2.5 saat boyunca 160,000 x g bir% 40 (w / v) sakaroz yastığı çözelti geçirir. Tampon pelet yeniden çözülür. Alternatif olarak, 10 kDa kesme spin-off filtreleri kullanarak uygun tampon karşı dialyze.
- Karakterizasyon: Pegile ve floresan-etiketli VNPs yukarıda tarif edilen yöntemler kullanılarak analiz edilmiştir: görünür / UV spektroskopi, SDS jel elektroforezi, FPLC ve TEM (gösterilmemiştir, ancak, Şekil 6 ve 7'ye bakın).
5. Bir Fare Xenograftlarında Modeli kullanılarak Tümör Hedefleme ve Görüntüleme
- Kültür HT-29 RPMI medyumu içinde insan kolon kanser hücreleri 175 cm2 hücre kültür şişeleri ile% 5 CO2 içinde% 5 FBS, 37% 1 penisilin-streptomisin,% 1 L-glutamin ° C ile desteklenmiştir.
- 5 dk için 37 ° C 'de tripsin-EDTA 5 ml steril PBS ile inkübe ederek ve hasat ile iki kere yıkayın hücrelerini. RPMI ortam 5 ml tripsin inaktive eder. 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüj hücreleri toplayın. 4 at 5x10 6 cells/50 ul orta (tripan mavi ve bir hemasitometre kullanarak toplam hücre sayısını belirlemek) taze RPMI ° C ve tekrar süspansiyon. Enjeksiyonu (tüm çözeltiler ve reaktifler steril tutmak) öncesinde Matrigel eşit hacmi ile karıştırın.
- Procure altı hafta eski NCR nu / nu farelerine ve 2 hafta boyunca bir yonca ücretsiz diyet onları korumak. [Not:. Bütün hayvan prosedürleri IACUC onaylanmış olmalıdır] subkutan enjeksiyon yoluyla tümör xenografts øndükle 5x10 6 cells/100 steril bir 18 1/2 ölçü kullanarak yamaçlarında ul / tümör (2 tümörler / fare)iğne. Düzenli hayvanları izleyin. Pergel ile ölçülür ve tümör boyutu tümör 20 mm 3 (bir sonraki 12 gün içinde) bir ortalama hacim büyümesine izin verir. PBS ve VNP (n = 3 hayvan / grup / zaman noktası): rastgele iki farklı grup fareler atayın. Bir 1 ml 28 gauge insülin şırıngası kullanılarak, damar içi steril PBS kuyruk damarından enjeksiyon 100 ul ya da 10 mg / kg VNP formülasyon tarafından idare.
Not: Canlı hayvanlar ile Doku kültürü deneyleri ve çalışmalar göstermiştir olmayacaktır. Hands-on gösteri doku işleme ve veri toplama ile sınırlı olacaktır. HT-29 tümör ksenogreft modelinde bir referans için, okuyucunun ref adlandırılır. 19
Üç teknikleri VNPs yuvalandırma tümörü değerlendirmek için kullanılır:
- CO 2 kullanarak farklı zaman noktalarında (2, 24 ve 72 saat) de Kurban fareler: Maestro Görüntüleme Sistemi kullanarak Floresans görüntülemegaz. Kanatlarda tümörleri ile birlikte hayvan ve tüketim tüm önemli organları (beyin, kalp, akciğer, dalak, böbrek ve karaciğer) teşrih, parafilm üzerindeki dokular yerleştirin ve (800 ms sarı eksitasyon ve emisyon filtreleri kullanarak floresan görüntüleme cihazı ile analiz dokularda floresan sinyalleri (VNPs konjuge A647 etiket türetilen) varlığını tespit maruz kalma). Görüntüleri kaydedin ve ImageJ 1.44o yazılımını kullanarak (floresan yoğunlukları analiz http://imagej.nih.gov/ij ). Süre ile diğer dokularda önemli olan tümörlerde VNPs alımını paterni karşılaştırın.
- Görüntüleme sonra yarıda her doku kesilmiş ve kriyo-kesit ve konfokal analizi için Ekim bileşik bir buçuk gömün. Önceden tartılmış kriyo-flakonlarda diğer yarısı toplayın ve bunları hemen sıvı N 2 kullanarak dondurma. Mağaza -80 ° C daha fazla işlem için hazır olana kadar.
- Floresans ölçümü: Rekord dokuları ağırlıkları. Oda sıcaklığında dondurulmuş doku çözülme ve PBS 1 ml içeren ayrı 50 ml Falcon tüpleri yerleştirin. Bir el dokusu homojenizatör kullanarak, PBS içinde 2-3 dakika süreyle doku homojenize sonra mikrofuge'de tüplere homojenat aktarın. Non-homojenize doku kaldırmak için 13.000 g'de 10 dakika süreyle homojenatlarında santrifüjleyin.
- 384 de siyah UV plaka içine her grup (PBS ve VNP formülasyonları / zaman puan) dokulardan süpernatant pipetleyin 100 ul. Bir plaka okuyucu kullanarak floresan yoğunluğu (Ex / Em dalga boylarında 600/665) değerlendirin. Doku ağırlıkları ile elde edilen floresan değerlerini normalleştirmek.
- İmmünohistokimya: -20 ° C'de kriyo-mikrotom bölümleri (10 mikron) ve mağaza hazırlayın Hücre çekirdeğinin (DAPI) ve endotel hücre işaretleyici (CD31 antikoru anti-fare FITC-etiketli) için doku kesitleri Leke. Floresan-etiketli VNP ve vasküler ve intra-tümöral yerelleştirme haritasına konfokal mikroskopi analizi yapıns.
Not: Bu işlem ortaya olmayacak, temsilci veriler Şekil 8 'de gösterilmiştir. Immünohistokimya ve anlatılan boyama yöntemleri ile ilgili bir başvuru için okuyucu ref adlandırılır. 19
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol vivo tümör görüntüleme için VNPs ve uygulamaları kimyasal modifikasyonu için bir yaklaşım sağlar. Burada sunulan hayvan floresan görüntüleme, floresans ölçme ve immunohistokimyasal teknikler biyodağılımını okuyan ve tümör homing değerlendirmek için yararlıdır. Bu teknikler EPR etkisi ile tümörün nanopartiküller erişim konusunda değerli bilgiler sağlamaktadır. Çeşitli analitik yöntemlerle elde edilen sonuçları birleştirerek, VNPs lokalizasyonu ve biyodağılımını değerlendirmek için güçlü bir yaklaşım olsun.
Bu çalışmalar ancak yapılabilir önce, saf bir virüs hazırlığının sağlanması esastır. Apart mekanik inokulasyon gelen, VNP yayılması için olası bir alternatif yüksek dönüşüm ve birikim hızına sahip olabilir agroinfiltration vardır. VNPs propagandasını yaparken, bakımı ayrı t gibi farklı virüsler ile enfekte bitkiler tutmak için alınması gerekençapraz bulaşmayı önlemek o. Özellikle, TMV kolayca yayılmış ve mekanik olarak iletilir. Dikkatli olmak başka kritik adım buz üzerinde veya 4 ° C'de virüs arındırma yürütüyor Bütün buz gibi soğuk tampon kullanılır. Düşük sıcaklık proteazlar ve bitki malzemesi içinde mevcut oksitleyici enzim bir sonucu olarak VNPs hasar görmesini önlemek için gereklidir.
Saflaştırılmış VNPs Düşük verimleri birçok faktöre doğabilmektedir. Bunun nedeni yayılması için kullanılan VNPs yaşına olabilir. Bu, daha yeni virüs preparatları kullanmak için tercih edilir. Örneğin, CPMV ve G kat proteininin C-terminal 24 amino asitleri gen susturma ve bastırılması için gereklidir. Bu yüzeyin maruz kalan bölgenin Silme proteoliz nedeniyle zamanla oluşur. CPMV yapısı ve kararlılık etkilenmiş olmamakla birlikte, büyüme gerili ve geciktirilmiş virüs sonuç yayıldı. Düşük verimler diğer bir kaynağı saflaştırma sırasında VNPs kaybıdır. De özeltention PEG çökeltme sonra yeniden süspanse edilmesi adımına verilmelidir. Pelet yeniden süspanse Incomplete sonraki adım santrifüj pelet içinde kayıp VNP neden olur.
Genel olarak, burada sunulan bioconjugation kimyaları açıktır. Açıklanan 14,17,18,21 karakterizasyon yöntemleri partikül bütünlüğünün sağlanması ve konjugasyon kapsamını belirlemek için değerlidir. Molar aşırılıkların göre uygulama ve arzu edilen işlevsellik derecesine bağlı olarak ayarlanabilir.
Fare ksenogreft modeli ile çalışırken, en önemli uygulama aseptik teknik takip ediyor. Buna ek olarak, kuyruk damarından enjeksiyon her bir fare için üniform bir örnek doz sağlamak için özel bir öneme sahiptirler. Bu önceden damar genişletmek için ılık suda kuyruk yerleştirmek için yardımcı olabilir. Diğer bir önemli husus floresan görüntüleme ve ölçümler için otofloresans olduğunu. Genel olarak, doku otofloresans minimiz olduğugörüntüleme probu olarak optimum 600 nm ötesinde emisyon maxima ile uzun dalga boya yapma 600 nm, ötesinde ed. Ancak, normal fare diyetler de kırmızı fluoresces klorofil içeren yonca, oluşur. Bunun sonucu olarak, arka plan sinyallerini azaltmak için en az 2 hafta için bir yonca diyet üzerinde fareler korumak için gereklidir. Son olarak, floresan görüntüleme kullanılarak flüoresan tespiti sayesinde, çeşitli dokuların saçılma ve emme ortamlarda farklılıklar ile sınırlı olduğunu belirtmek gerekir. Kantitasyonu doku homojenatları kullanılarak yapılır iken Sonuç olarak, görüntüleme, izleme ve görüntüleme için biyodağılımını için bir yöntem, ilk olarak kullanılmaktadır.
Teknoloji platformu VNPs kullanmanın bazı avantajları kendi monodispersity, biyouyumluluk, ölçek-up üretimi için yeteneği ve çoklu işlevsellik stratejileri amenability vardır. Kimya mühendisliğinde ilave olarak, genetik mühendisliği ile introduc burada açıklanmaktadırbioconjugation için bir hedef olarak BMV için sissteinler sorusunu gündeme getirir. Genetik mühendisliği, aynı zamanda peptid veya afinite etiketleri hedefleme getirmek için kullanılabilir. Tanımlanan protokol (boya ve PEG) parçacıklar çift etiketli kullanır iken, devam eden çalışmaları doku özgüllüğü ve terapötik etkinliğinin artırmak için ek işlevler (yani, tedavi ve hedefleme) birleştiren bakıyoruz. Dolayısıyla, bu yaklaşım gelecekte biyomedikal uygulamalar için zemin bırakır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH / NIBIB hibe R00 EB009105 (NFS) ve P30 EB011317 (NFS), bir NIH / NIBIB eğitim bursu T32 EB007509 (AMW için), bir Case Western Reserve Üniversitesi Disiplinlerarası Birlik Yatırım Hibe (NFS), tarafından desteklenen ve Bir Olgu Kapsamlı Kanser Merkezi'nde hibe P30 CA043703 (NFS). Biz onların için Steinmetz Lab lisans öğrencisi araştırmacıların teşekkür hands-on desteği: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Yani, ve Paul Chariou .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VNP production | |||
| Indoor plant chamber | Percival Scientific | E-41L2 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| N. benthamiana seeds | N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation. | ||
| Carborundum | Fisher | C192-500 | |
| Pro-mix BX potting soil | Premier Horticulture | 713400 | |
| Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer | JR Peters | 77860 | |
| Equipment | |||
| 50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | |
| SW 32 Ti rotor | Beckman | 369694 | |
| Optima L-90K ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| SLA-3000 rotor | Thermo Scientific | 07149 | |
| SS-34 rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Polypropylene bottle | Beckman | 355607 | For SLA-3000 rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 357002 | For SS-34 rotor |
| Ultra-Clear tube | Beckman | 344058 | For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 355618 | For pelleting and 50.2 Ti rotor |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop2000c | |
| PowerEase 500 pre-cast gel system | Invitrogen | EI8675EU | |
| Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | 28-4062-66 | |
| Allegra X-12R | Beckman | 392302 | Benchtop centrifuge |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Maestro 2 | Caliper Life Sciences | In vivo imaging system | |
| Tissue-Tearor | Biospec Products | 985370-395 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite-200 | |
| Transmission electron microscope | ZEISS | Libra 200FE | |
| FluoView laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Chemicals and Reagents | |||
| 3-ethynylaniline | Sigma Aldrich | 498289-5G | |
| 384 well black plate | BD Biosciences | 353285 | |
| 4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel | Invitrogen | NP0321BOX | |
| 4X LDS sample buffer | Invitrogen | NP0008 | |
| Acetic Acid | Fisher | A385-500 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 271004-1L | |
| Alexa Fluor 647 azide | Invitrogen | A10277 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20006 | |
| Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters | Millipore | UFC501096 | 10 kDa cut-off |
| Aminoguanidine hydrochloride | Acros Organics | 36891-0250 | |
| Boric acid | Fisher | A74-500 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher | BP101-25 | |
| CsCl | Acros Organics | 42285-1000 | |
| DAPI | MP Biomedicals | 157574 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-100 | |
| Filter paper | Fisher | 09-801K | P5 grade |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend | 102406 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| KCl | Fisher | BP366-500 | |
| L-ascorbic acid sodium salt | Acros Organics | 35268-0050 | |
| Methanol | Fisher | A412P-4 | |
| MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | |
| Microscope cover glass | VWR | 48366-277 | |
| MOPS buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-2k | MW 2000 |
| mPEG-N3 | Nanocs | PG1-AZ-5k | MW 5000 |
| mPEG-NHS | Nanocs | PG1-SC-5k | MW 5000 |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* | Invitrogen | O-6149 | |
| p-toluenesulfonic acid monohydrate | Acros Organics | 13902-0050 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Sodium acetate | Fisher | BP333-500 | |
| Sodium nitrite | Acros Organics | 42435-0050 | |
| Sodium sulfite | Amresco | 0628-500G | |
| Sucrose | Fisher | S6-500 | |
| TEM grid | Ted Pella | FCF-400Cu | |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | TX1568-1 | |
| β-mercapt–thanol | Fisher | O3446I-100 | |
| Tissue Culture | |||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 12483-020 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| HT-29 cells | ATCC | HTB-38 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-080 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 10378-016 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 31800-089 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 431080 | 175 cm2 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
| Animal Studies | |||
| 18% Protein Rodent Diet | Harlan Teklad | Teklad Global 2018S | Alfalfa free diet |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329410 | 28 gauge |
| Isoflurane | Baxter | AHN3637 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | BD Biosciences | 356234 | |
| NCR nu/nu mice | CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility |
||
| Sterile syringe | BD Biosciences | 305196 | 18 1/2 gauge |
| Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
References
- Description of Plant Viruses [Internet]. , Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
- Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
- Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
- Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. , (2011).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
- Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
- Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
- Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
- Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
- Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
- Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
- Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. , (2012).
- Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
- Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. , (2012).
- Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).
