Summary
Een efficiënte genoom-brede enkel gen mutatie methode is vastgesteld aan de hand
Abstract
Transposon mutagenese en single-gendeletie zijn twee methoden toegepast genoom knockout in bacteriën 1,2. Hoewel transposon mutagenese is minder tijdrovend, minder duur en vereist geen voltooid genoominformatie zijn er twee zwakke punten in deze werkwijze: (1) de mogelijkheid van een heterogene mutanten in de gemengde mutant bibliotheek die tegen de mutanten geselecteerd met verminderde concurrentie; en (2) de mogelijkheid van gedeeltelijke geninactivering waarbij genen niet geheel verliezen hun functie na het inbrengen van een transposon. Single-gendeletie analyse kan compenseren voor de nadelen van transposon mutagenese. Om de efficiëntie van genoom-brede enkele gendeletie te verbeteren, proberen we een high-throughput techniek voor genoom-wijde enkele gendeletie met Streptococcus sanguinis als een model organisme. Elk gen in S. deletieconstruct sanguinis genoom ontworpen om 1 omvat-Kb stroomopwaarts van het targetgen, de APHA-3-gen, dat codeert voor kanamycine resistentie-eiwit, en 1 kb stroomafwaarts van het targetgen. Drie sets van primers F1/R1, F2/R2 en F3/R3 respectievelijk zijn ontworpen en gesynthetiseerd in een 96-well plaat formaat voor PCR-amplificaties van deze drie componenten van elke deletieconstruct. Primers R1 en F3 bevatten 25-bp sequenties die complementair zijn aan gebieden van de APHA-3 gen einde hun 5'. Een grootschalige PCR amplificatie van de APHA-3 gen wordt eenmaal uitgevoerd voor het maken van alle enkel gen deletieconstructen. De promotor van APHA-3 gen aanvankelijk niet het potentiële effect van kanamycine polaire cassette minimaliseren. De gendeletie constructies te realiseren, worden high-throughput PCR amplificatie en zuivering uitgevoerd in een 96-well plaat formaat. Een lineaire recombinant PCR amplicon voor elk gen deletie wordt samengesteld door vier PCR-reacties met high-fidelity DNA polymerase. De initiële exponpreferentiële groeifase van S. sanguinis gekweekt in Todd Hewitt bouillon aangevuld met 2,5% geïnactiveerd paardenserum wordt de bekwaamheid verhogen voor de transformatie van PCR-recombinant constructen. Onder deze voorwaarde, tot 20% van S. sanguinis cellen kunnen worden getransformeerd met ~ 50 ng DNA. Op basis van deze benadering werden 2.048 mutanten met enkele gendeletie uiteindelijk verkregen uit de 2.270 genen in S. sanguinis met uitzondering van vier gen ORFs die volledig binnen andere ORFs in S. sanguinis SK36 en 218 potentiële essentiële genen. De techniek voor het maken gendeletie constructen high throughput en kan gemakkelijk in genoom gen deleties gebruiken voor transformeerbaar bacteriën.
Protocol
1. Primer ontwerp
- Primers zijn ontworpen met behulp huis scripts gebaseerd op de S. sanguinis SK36 genoomsequentie. Drie sets van primers, F1/R1, F2/R2 en F3/R3 zijn ontworpen voor amplificatie van de 1-kb stroomopwaartse sequentie van het doelwitgen, de APHA-3 gen dat codeert voor kanamycine resistentie (Km r) eiwit 3 en de 1 -kb stroomafwaartse sequentie van het doelwitgen, respectievelijk (Figuur 1). Van deze primers wordt F1 en R3 ontworpen met ePrimer3 in de EMBOSS pakket van programma's ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) om flankerende gebieden amplificeren stroomopwaarts of stroomafwaarts van het doelwit gen. Genspecifieke primers, R1 en F3 zijn ontworpen op basis van de 5'-en 3'-sequenties van het doelwitgen. R1 en F3 primers bevatten 25 bp adaptersequenties einde hun 5'die complementair zijn aan de APHA-3gen. De smelttemperatuur van elke primer werd ontworpen om zo dicht mogelijk bij 60 ° C tot gebruik van een uniforme annealing temperatuur voor PCR reacties in 96-well formaat mogelijk.
- F1, R1, F3 en R3 primers worden gesynthetiseerd in 96-well platen op basis van een gen order. Elke plaat bevat een type primers in hetzelfde gen order. Verdun de primers in 96-well plaat werken primer tot een eindconcentratie van 10 pM voor PCR amplificatie met een meerkanaalspipet.
2. High-throughput PCR Amplification and Purification
- Om high-throughput versterken 1-kb stroomopwaarts of stroomafwaarts van de doelgroep S. sanguinis genen monteren een PCR cocktail mengsel op ijs in een 15 ml conische buis met 1640 pi ddH 2 O, 250 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ul van 10 mM dNTP mengsel werd 100 ul 50 mM MgSO4, 100 pi 10 ng / ul S. sanguinis SK36 genomisch DNA en 10 pl Platinum Taq DNA polymerase high fidelity en overdracht 23 ul van het mengsel in elk putje op 96-well PCR-plaat met een meerkanaalspipet. Breng 1 pi van elke F1 en R1 (of F3 en R3) van 10 pM primer werkt platen aan de PCR plaat met meerkanaalspipet. Dicht de PCR amplificatie uitgevoerd plaat en bij 94 ° C gedurende 1 min, en 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 sec, 54 ° C gedurende 30 sec en 68 ° C gedurende 1,5 minuten.
- Bereid 1% agarose gel die ethidiumbromide met 48 wells fitting meerkanaalspipet loading. Meng 4 pl PCR product met 1 pi 5xDNA loading buffer op 96-well plaat en plaats de monsters op agarose gel met een 10-pl meerkanaalspipet. Draaien elektroforese bij 135 V gedurende 30 minuten. Onderzoek de band op gel onder UVP documentatie en analyse systeem.
- Zuiver de PCR producten van Purelink 96 PCR purification kit met centrifugatie volgens aanwijzingen van de fabrikant. Voor het elueren van DNA, voeg 40 ul steriel ddH 2 O naar de bron van de bINDENDE plaat.
- Willekeurig pick verschillende gezuiverd amplicons op de plaat om de DNA-concentraties met behulp van NanoDrop spectrofotometer te onderzoeken. Dient de concentratie van amplicons op plaat tot ~ 10 ng / ul.
- Een plasmide dat Kmr cassette wordt gedigereerd met EcoRI als PCR sjabloon. Het gedigereerde plasmide wordt gezuiverd door QIAquick PCR purification kit en het lineaire plasmide DNA wordt aangepast aan de uiteindelijke DNA concentratie van 10 ng / ul. Monteer 25 pi mengsel Kmr cassette amplicon inbegrip 16,4 ul ddH 2 O, 2,5 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ui 10 mM dNTP mengsel, 1 pi 50 mM Mg SO 4, 1 pi 10 pM F2, 1 pi 10 pM R2, 1 gl lineair plasmide DNA en 0,1 pl Platinum Taq DNA polymerase high fidelity. Voer PCR amplificatie bij 94 ° C gedurende 1 min, en 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 30 sec en 68 ° C gedurende 1 minuut. Onderzoeken PCR product door gel elektroforese op 1% agarose. Poola bulk van de Kmr cassette amplicon van 10 afzonderlijke PCR gezuiverd door QIAquick PCR purification kit. Stel de amplicon concentratie 10 ng / ul.
- Om de uiteindelijke lineaire recombinant PCR amplicon te verkrijgen, worden drie PCR amplicons met elkaar gecombineerd 1 pi (in nagenoeg gelijke molaire hoeveelheden) in een PCR plaat en de PCR sjabloon. Andere PCR-componenten bevat, met inbegrip 14,4 pl ddH 2 O, 2,5 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ui 10 mM dNTP mengsel, 1 pi 50 mM Mg SO 4, 1 pi 10 pM F1, 1 pi 10 pM R3, 0,1 ul Platinum Taq DNA-polymerase high fidelity. PCR amplificatie wordt uitgevoerd bij 94 ° C gedurende 2 min, 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 sec 55 ° C gedurende 30 sec en 68 ° C gedurende 3,5 min, en tenslotte 68 ° C gedurende 4 minuten.
- Onderzoeken PCR amplicons op agarosegel. Zuiveren en kwantificeren PCR amplicons zoals hierboven beschreven. Bevries de gerecombineerde PCR amplicons bij -20 ° C.
3. Combevoegde Cellen Voorbereiding
- Todd Hewitt bouillon bereid, pH aangepast tot 7,6 met 10 N NaOH, verwarmd tot koken en daarna afgekoeld tot kamertemperatuur en gesteriliseerd met 0,22 urn polystyreen filter 4. Voeg 300 ul hitte geïnactiveerd horse sera (eindconcentratie 2,5%) en 11,7 ml Todd Hewitt bouillon in 15-ml conische buis te maken TH + HS medium. Aliquot TH + HS medium in 2 ml en 10 ml in buizen.
- Inoculeer 5 ul van voorraad S. sanguinis SK36 ingevroren bij -80 ° C in 2 ml TH + HS medium en incubeer overnacht cultuur met aftopping goed bij 37 ° C tezamen met pre-incubatie van 10 ml-TH + HS buis.
- Na overnacht, Pipetteer 50 ul cultuur in 10 ml TH + HS en incubeer de buis bij 37 ° C gedurende 3 uur (overeenkomend met OD 660 van 0,07 tot 0.08), onmiddellijk gebruikt voor transformatie.
4. Cel Transformatie en antibiotische selectie
- Voeg 2 pl 70 ng S. sanguinis SK36 bevoegdetentie stimulerende peptide (CSP) en 2 ui lineaire recombinant PCR amplicon (~ 50 ng) naar Eppendorf buisjes op 96-well blok voorverwarmen ze bij 37 ° C. Breng 330 pl van 3 hr-bebroede SK36 cultuur in elke buis. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Vervang DNA met steriel ddH 2 O als controle.
- Plaats het blok op ijs en verdeeld 100 pi van elke transformatie op Brain Heart Infusion (BHI) agar plaat met 500 ug / ml kanamycine. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 2 d onder microaerobe omstandigheden.
5. Mutant Bevestiging en opslag
- Voor elke mutant vervanging, willekeurig neem 2 afzonderlijke kolonies, de kolonie inoculeren in 5 ml BHI dat 500 ug / ml kanamycine en incubeer het inoculum microaerobically nacht bij 37 ° C. Cryopreserveren elke cultuur in 30% glycerol bij -80 ° C
- Om te onderzoeken of de mutant met de verwachte genvervanging, kolonie PCR voor elke mutant met F1 en R3 voerenprimers in 96-well plaat PCR. Ongeveer 1-pi overnacht cultuur van individuele kolonie wordt gebruikt als DNA template in 25-ul PCR-amplificatiereactie. PCR wordt uitgevoerd bij 94 ° C gedurende 5 min, 35 cycli van 94 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 30 sec en 68 ° C gedurende 3,5 min, en tenslotte 68 ° C gedurende 4 minuten.
- Om precies te identificeren dubbele band mutanten of contaminant PCR amplicon, onderzoekt de PCR amplicon door elektroforese gedurende 4 uur op> 12 cm lang 2% agarose gel met ethidiumbromide kleuring. Onder deze agarosegelelektroforese conditie, werden alle amplicons met ≥ 100 bp verschil duidelijk. Bij bands gevolg van amplificatie van de Kmr cassette en het wild-type gen worden verwacht verschillen <100 bp, een interne T1 primer wordt gebruikt om te bepalen of een wild-type gen kan worden gedetecteerd door PCR.
- Om bevestigen de verwijdering worden de amplicons gezuiverd door Purelink 96 PCR purification kit en de sequentie met de primer P1 diebindt aan de Kmr cassette. Uitsluitend juiste mutanten bevestigd door sequencing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om de mogelijke polaire effecten van de vervanging van een targetgen met exogeen gen antibiotica op naburige genen minimaliseren, worden twee stappen terwijl de initiële primer ontwerpen. Voor de meeste van verwijderde genen, de primers R1 en F3 om de coderende regio 6 bp verwijderen na het startcodon tot 30 bp vóór het stopcodon. De laatste 30 basenparen vastgehouden mogelijke ribosomale bindingsplaats die de aangrenzende downstream gen beschermen. De bewaarde gebied tussen twee naburige genen wordt uitgebreid tot 100 bp wanneer ze zich in tegengestelde oriëntaties en de N-termini van beide eiwitten dicht bij elkaar voorkomen verwijderen van een potentiële promotor regio. De promotor van APHA-3 gen is uitgesloten recombinant construct voor gendeletie 5. Een ribosomale bindingsplaats wordt in de APHA-3 gen voor vertaling. Om onze strategie te testen, hebben we willekeurig geconstrueerd 10 en vervolgens 96 allelische uitwisseling mutanten. We obtained 10 en 93 mutanten op respectievelijk kanamycineselectie platen, wat suggereert dat de promoter-less APHA-3 gen en tot expressie werd gebracht in de meeste gevallen. Vervolgens ontworpen en gesynthetiseerd voor de primer promoter-less APHA-3 gen voor gendeleties in de S. sanguinis genoom. Maar we sommige genen in S. sanguinis werden lage expressie of expressie die waarschijnlijk de expressie van het promoterloze APHA-3 gen en daardoor de kanamycineselectie beïnvloeden. Om dit probleem, de promotor van APHA-3 gen uit het plasmide lossen werd in de Kmr cassette. Een massa van de promoter Kmr cassette amplicon werd verkregen van 10 afzonderlijke PCR met primers F2p/R2. Behalve dat nieuwe R1 promoter primers werden ontworpen voor R1p complement met de promoter Kmr cassette amplicon, alle andere constructie stappen waren dezelfde als voor promoter-less constructie.
Om de efficienc te verbetereny van homologe recombinatie selecteren we lang (1 kb) flankerende sequenties stroomopwaarts en stroomafwaarts van de S. sanguinis doelgen in het maken van gen-deletie constructen. De flankerende sequentie grootte is beperkt tot 1 kb aan de hand van twee punten: (1) het DNA fragment length (~ 3 kb) toegestaan klaar PCR amplificatie van de APHA-3-gen (~ 1 kb) plus 2 kb van flankerende sequenties met high-fidelity DNA polymerase, en (2) de haalbaarheid van sequentie flankerende gebieden door ABI sequencing methode van beide kanten (~ 1 kb). Grote aantallen transformanten in de meeste S. sanguinis gendeleties aangegeven 1 kb upstream en downstream sequenties, respectievelijk, waren genoeg om knock-out van de doelgenen.
Om succesvol sluit de stroomopwaarts en stroomafwaarts van het doelwitgen met de twee uiteinden van APHA-3 gen in PCR amplificatie recombinant, primers R1, F2, F3 en R2 worden toegevoegd aan hun 5 'einde van een extra sequentie die complementair is met de aansluitingenecting einde van de andere zijde in veel bacteriële gendeletie gevallen 6,7. Voorlopige studies toonden aan dat de extra sequentie kunnen worden teruggebracht tot 25 bp voor dit recombinante PCR protocol. In dit protocol we de extra sequenties van primers F2 en R2 geëlimineerd APHA-3 gen en toegevoegd 25-bp extra sequentie aan het 5'-uiteinde van R1 en F3 in stroomopwaarts en stroomafwaarts van de S. sanguinis doelgen. Dit ontwerp zal de lengte en hoeveelheid primers dus afnemen en de kosten en de tijd PCR om de efficiëntie van single-gendeletie verbeteren. In ons laboratorium, werd dit ontwerp ook met succes aangetoond voor gendeleties in andere microben zoals Streptococcus mutans en Streptococcus pneumoniae en Porphyromonas gingivalis.
In dit protocol, de specificiteit van PCR-primers is van cruciaal belang. De primer smelttemperatuur was hoog (> 58 ° C), de primer grootte was lange (> 21 bp) en de primer binding site was uniek in het genoom van S. sanguinis. Dit ontwerp gen-specifieke producten geproduceerd in bijna elk van onze PCR amplificaties. Een genspecifieke PCR amplificatie product is kritisch voor de laatste PCR amplificatie. Anders het uiteindelijke PCR amplificatie die resulteert in de vorming van de uiteindelijke recombinante samengesteld upstream en downstream elk gen regio's en antibiotica gencassette respectievelijk moeilijk.
Cell dichtheid afhankelijkheid van transformatie is aangetoond in vele streptokokken zoals S. sanguinis 8, S. mutans 9 en S. pneumoniae 10. Wanneer celdichtheid van S. sanguinis bereikt OD 660 van 0.07 tot 0,08 (overeenkomend met 5x10 ~ 6 CFU / ml) in TH + HS medium de hoogste transformatie-efficiëntie van S. sanguinis met een lineaire recombinant PCR amplicon verkregen en tot 20% van S. sanguinis cellenkan worden omgezet. Na voltooiing van genoom-brede gendeleties in S. sanguinis vonden we dat het aantal transformanten voor verwijdering van sommige niet-essentiële genen laag was (~ 10). Er is geen twijfel dat hoge transformatie-efficiëntie van bacteriën is belangrijk om alle niet-essentiële gendeleties vervullen in het genoom-brede genetische diversiteit knockouts.
Behalve recombinant construct creatie van PCR, zijn er ook andere technieken voor enkelvoudige genetische inactivering. Bijvoorbeeld, zelfmoord plasmide creatie is geweest is van toepassing op grote schaal van bacteriële genen te inactiveren op kleine schaal. Echter is deze techniek niet gebruikt genoomwijde gen inactivatie omdat grootschalige plasmide maken veel tijdrovend en omslachtig, en sommige bacteriën moeten worden gecreëerd specifieke zelfmoord plasmide. Hoewel marker-less gendeletie kan voorkomen dat de mogelijke polaire effect van de antibiotica-resistentie-gen, traditionele marker-less gendeletie methode is meer tijd-contijdrovende en moeilijk om een gen dan het zelfmoord plasmide methode inactiveren. In Escherichia coli, zijn genoom mark-less gendeleties verkregen door vervanging met antibioticumresistentiegen en eliminatie van de weerstand cassette 6. Echter, dit E. coli-stam heeft de faag λ Red recombinase. Voor gen-deletie verwerking moet de Red helper plasmide pKD46 worden ingebracht in E. coli 11. In onze techniek geëlimineerd we de promoter van APHA-3 resistentiegen in de meeste genen geschrapt mutanten gemaakt en de twee einden van APHA-3 ORF de expressie structuur van het gen-gedeleteerde gebied volgen, de polaire voorkomen effect kwestie van het verzet cassette. Tot nu toe hebben we niet gevonden de polaire effect kwestie na onderzoek van de functie van vele mutanten die door deze technologie. Een genoom-brede en heldere set van essentiële genen verworven in S. sanguinis met behulp van e12 is techniek impliceren ook mogelijk de laag polaire effect van antibiotica cassette in het systeem. We hebben aangetoond andere promoter-less antibioticumresistentiegenen, zoals erythromycine en chlooramfenicol resistentiegenen, kunnen worden toegepast in deze techniek (data niet getoond). Bovendien is deze techniek niet nodig zelfmoord plasmide en gereconstrueerd host. Algemeen is deze techniek high throughput om genoomwijde gendeletie constructies te realiseren en kan gemakkelijk uit te voeren in genoom gen mutatie van een bacterie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies R01DE018138 van de National Institutes of Health (PX) en gedeeltelijk door Virginia Commonwealth University Presidential Research Incentive Program (PRIP) 144.602-3 (PX). Wij danken Drs. Lei Chen, Yuetan Dou en Xiaojing Wang voor het assisteren bij de bouw van genoom brede mutanten. We danken ook de DNA-Core Facility in Virginia Commonwealth University voor DNA-sequencing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5' end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5' end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5' end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet's Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet's Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
- Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis. Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).
- Kobayashi, K., et al. Essential Bacillus subtilis genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).
- Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III. Gene. 23, 331-341 (1983).
- Paik, S., et al. Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis. Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).
- Lukomski, S., et al. Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization. Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, (2006).
- de Berardinis, V. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Rodriguez, A. M., et al. Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis. Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).
- Perry, D., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect. Immun. 32, 1295-1297 (1981).
- Pakula, R., Walczak, W. On the nature of competence of transformable streptococci. J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Xu, P., et al. Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis. Sci. Rep. 1, (2011).
