Summary
Neste protocolo, w e identificou um novo população de células de melanócito-like (também conhecido como melanócitos cardíacos) nos corações de ratos e humanos que contribuem para a arritmia atrial dispara em camundongos.
Abstract
Foi descoberta uma nova população de células de melanócitos tipo (também conhecido como melanócitos cardíaca) nos corações de ratos e seres humanos, que contribuem para os gatilhos de arritmias atriais em ratinhos. Para investigar as propriedades elétricas e biológicos de melanócitos cardíacos foi desenvolvido um procedimento para isolá-los do rato corações que nós derivados das destinadas a isolar cardiomiócitos murinos neonatais. A fim de obter melanócitos cardíacos saudáveis adequados para mais extensa patch clamp ou estudos bioquímicos, foi desenvolvido um procedimento refinado para isolar e cultivar melanócitos cardíacos baseados naqueles originalmente projetado para isolar os melanócitos cutâneos. O procedimento refinado é demonstrado nesta revisão e produz um maior número de células de melanócito-like saudáveis que pode ser banhado em uma população pura ou com cardiomiócitos.
Introduction
Nós recentemente identificada uma população de células romance no coração de camundongos e humanos que expressam enzimas melanina-síntese e morfologicamente se assemelham melanócitos cutâneos. Chamamos 'melanócitos cardíacos' essas células e descobrimos que eles estão presentes em locais anatômicos a partir do qual arritmia atrial desencadeia muitas vezes se originam em seres humanos. Encontramos também melanócitos cardíacos contribuir para arritmias atriais em camundongos com deleção da linhagem germinativa de Dct. Melanócitos cardíacas são escassamente distribuídos por todo o átrio do rato onde eles compreendem menos de 0,1% de todas as células atriais. Para investigar as propriedades elétricas e biológicos de melanócitos cardíacos foi desenvolvido um procedimento para isolá-los do coração mouse usando marcadores específicos de melanócitos Cre-induzida. Nosso procedimento inicial foi desenvolvido daqueles usados para isolar cardiomiócitos murinos neonatais e rendeu um pequeno número de células adequadas para gravações de patch clamp ou análise de PCR. No entanto, para melhorar a curarº e viabilidade de melanócitos cardíacas, para mais aprofundada análise eletrofisiológica ou estudos bioquímicos, foi desenvolvido um procedimento refinado e as destinadas a isolar melanócitos cutâneos. O processo descrito e demonstrado neste teste tem a vantagem de produzir melanócitos cardíacas saudáveis, que podem ser plaqueadas como uma população pura ou com cardiomiócitos.
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Protocol
1 Preparar as soluções necessárias e Equipamentos
- Primeiro, esterilizar os instrumentos cirúrgicos (pinças retas forma, fórceps, tesouras forma curva de forma reta, e tesouras forma curva) em autoclave por 15 min. a 121 ° C. Preparar dois conjuntos de instrumentos, onde um conjunto é usado para dissecar os corações e o outro conjunto irá ser utilizados para triturar o tecido.
- Dissolve-se um pacote de meios de cultura MCDB153 em 900 ml de esterilizado, água filtrada e agita-se lentamente até que o pó esteja dissolvido. Adicionar 1,2 g de bicarbonato de sódio, ou de 15,7 ml de uma solução de bicarbonato de sódio [7,5% w / v], por cada litro de volume final de meio que está sendo preparada e agita-se até se dissolver. Ajustar o pH para 7,2 por adição de 1 N ou HCl ou NaOH 1 N, em seguida verter os meios de comunicação através de um filtro de topo de 0,2 um frasco sob condições estéreis num capuz de cultura de tecidos (cabine de segurança biológica). Em seguida, coletar o material e armazene-o a 4 ° C.
- Prepare os suplementos paraadicionar ao meio de cultura (Lista de Materiais). Os suplementos devem ser adicionados ao meio antes de apenas meios de comunicação é necessária para o plaqueamento das células.
- Prepare DPBS com FBS a 10% mais antibióticos (penicilina e estreptomicina).
- Em seguida, preparar uma solução de tripsina a 0,25% por adição de 0,25 g de tripsina (de pâncreas de bovino, actividade> 2.500 unidades USP / mg, ultrapura; USB) a 100 ml de DPBS mais antibióticos (penicilina e estreptomicina).
- Outros equipamentos necessários necessários para concluir este procedimento incluem um microscópio estereoscópico, placas de Petri (10 cm), tubos cônicos de 50 ml, filtros de células 40 mícrons, DPBS mais antibióticos, de 60 mm e placas de cultura de 35 mm placas de cultura.
2 Isolando Corações de Neonatais rato filhotes de cachorro
- Em primeiro lugar, obter P0 para p2 de rato neonatal filhotes (n = 6 a 8). Recomenda-se usar os filhotes gerados por meio de cruzamento DCT-Cre fêmeas homozigotas com os machos que são heterozigotos para tanto o R26R: alelo EYFP ou o alelo Z / EG para rotular omelanócitos semelhante. Ambos R26R: EYFP e Z / EG ratinhos estão disponíveis a partir de Jackson Laboratories (números 006148 e 003920 banco, respectivamente).
- Em seguida, a eutanásia os filhotes recém-nascidos de rato, limpe o peito com um algodão embebido em álcool e em seguida, coloque os filhotes em uma placa de Petri de 10 cm com DPBS.
- Cortar a pele sobre o peito e esterno com pinça e tesouras esterilizadas e em seguida, abra o baú com cuidado sob microscópio estereoscópico. Os corações dos filhotes recém-nascidos de rato são muito pequenos por isso tome cuidado para se certificar de remover todo o coração com os átrios anexados.
- Lave os corações em DPBS e transferi-los para um novo prato de 10 cm Petri.
3. digestão enzimática
- Traga a placa de Petri com o coração excisadas para uma capa de cultura de tecidos (cabine de segurança biológica) e, em seguida, siga os passos abaixo usando técnicas estéreis na capa.
- Em primeiro lugar, os corações lavar três vezes em DPBS estéril mais antibióticos.
- Colocar os corações (n = 6-8) numa60 mm de placa de cultura e adicionar 6-8 mL de solução de tripsina a 0,5% para o prato.
- Em seguida, o coração cortado em pedaços pequenos (menos de 1 mm de tamanho) e incubar a 37 ° C durante 30 min numa atmosfera de CO2 a 5%.
- Após o período de incubação estiver completa, despejar a solução resultante de tecido cardíaco e tripsina a partir do prato para um tubo de 50 ml estéril cónica.
- Em seguida, usando uma pipeta estéril de 10 ml, rapidamente mas suavemente, tritura-se a solução no tubo de 50 mL cónico 30-50 vezes.
- Filtra-se a solução resultante através de um filtro de células de 40 mícrons no início de um novo tubo cónico limpo de 50 ml e recolher o filtrado.
- Em seguida, o tubo de centrifugação de 50 ml a 240 x g numa centrífuga de bancada durante 5 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento restante em 6-8 ml de DPBS estéril. Repita este passo mais duas vezes. Esta etapa pelotas miócitos atriais e melanócitos cardíacos, mas não derrubar a fifibroblastos desde os fibroblastos são menores e permanecerão no sobrenadante.
4. chapeamento Cardiac Melanócitos como células
- Após a terceira lavagem, após a centrifugação, com cuidado drenar ou aspirar para fora da solução de lavagem (DPBS) e ressuspender o sedimento em 6 ml de meio de cultura MCDB aos quais foram adicionados os suplementos.
- Agora, extrair a solução ressuspenso para uma pipeta de transferência estéril e colocar as células em uma placa de 35 mm, ou de um poço de uma placa de 6 poços, e reunir as células cardíacas isoladas a partir de três ratinhos neonatais em um prato de 35 mm ou bem.
- Incubar as placas durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%, aspirar fora do meio de cultura, juntamente com quaisquer células não ligadas e depois enxaguar as placas uma vez com DPBS. Em seguida, adicione meio fresco para as placas e substituir os meios de comunicação a cada 2 dias. As células isoladas a partir de corações neonatais ou embrionários pode ser mantido em cultura durante até 3 semanas, enquanto que as células isoladas de ouvir adultots podem ser mantidas em cultura durante até 10 dias.
Células 5 Isolando Cardiac Melanócitos como de rato adulto Coração
- Em primeiro lugar, retirar os corações de ratos maduros (3-4 semanas de idade, n = 3), através de uma esternotomia linha média após a administração de heparina 100 U intraperitoneal para os ratinhos e, em seguida, eles eutanásia. Recomenda-se usar pentobarbital para sacrificá camundongos para este procedimento, mas este medicamento não está disponível em todos os locais.
- Em seguida, lave os corações excisadas em DPBS estéreis contendo antibióticos em uma capa de cultura de tecidos (cabine de segurança biológica). Aperte os corações um pouco com uma pinça de dissecação curvas para remover qualquer vestígio de sangue restante deles e, em seguida, enxaguar os corações em DPBS mais uma vez.
- Remover os átrios e anel atrioventricular dos corações (estas estruturas contêm as células de melanócito-like) e coloque as amostras de tecido excisadas em um prato de 35 mm.
- Corte os corações em pedaços pequenos usando uma tesoura curva e forçaps e, em seguida, adicionar 6-8 mL de solução de tripsina a 0,5% para o prato. Em seguida, os pratos incubar a 37 ° C durante 45-60 min.
- Agora, siga os passos do procedimento acima a partir do passo 3.6 em diante.
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Representative Results
O protocolo descrito neste artigo é uma técnica aprimorada em comparação com o que anteriormente publicado para isolar melanócitos cardíacos do coração murino. Este procedimento emprega a utilização de marcadores fluorescentes accionados por síntese de melanina-específica enzima Cre-recombinase para marcar as células de melanócitos, como cardíacas. É importante a utilização de um marcador para rotular melanócitos cardíacas quando se trabalha com células embrionárias ou neonatais recém-isolados, uma vez que as diferenças morfológicas que distinguem melanócitos cardíacas a partir de miócitos atriais ainda não desenvolveram (Figura 1A). Como mostrado na Figura 1A, quando o passo de isolamento foi bem, um número bastante grande de miócitos atriais e melanócitos cardíacas vai aderir à laminina prato revestido com apenas algumas células não-aderentes. Neste caso, as células aderentes aparece plana sobre o fundo do prato (setas amarelas Figura 1A, seta). Por outro lado, quando o procedique dure não funciona bem na maioria das células será não-aderente e muitas vezes olhar esférico e arredondado (setas azuis claros, Figura 1A).
Quando as células isoladas são visualizados utilizando imagiologia de fluorescência verde, é claro que as células são melanócitos cardíacos e que as células são miócitos atriais (Figura 1). Como mencionado acima no protocolo (passo 3.9), os fibroblastos são removidos do pool de células atriais isoladas utilizando baixa força de centrifugação que pelotas miócitos atriais maiores e melanócitos cardíacos, mas não derrubar os fibroblastos cardíacos menores. As células isoladas de fresco pode agora ser usado para uma única célula registos electrofisiolicos (Figura 2), a análise do RNA de células individuais ou de ensaios bioquímicos.
Nós também temos cultivado e mantido células atriais neonatais ou embrionárias isoladas usando esse protocolo para até 21 dias. Usando as condições de cultura descritas no presenteprotocolo, os melanócitos semelhante cardíacas irá se diferenciar e proliferar, enquanto que os miócitos atriais tendem a separar a partir do prato e morrem dentro de 2-3 dias depois de terem sido isolados. Mostrado na Figura 3A são melanócitos cardíacas saudáveis 5 dias depois de terem sido isolados a partir de um coração neonatal mouse. Note-se a falta de quaisquer miócitos atriais em torno destas células (por oposição às células isoladas recentemente mostrados na Figura 1). Além disso, estes melanócitos cardíacas desenvolveram extensos processos dendríticos e assemelham-se muito melanócitos cutâneas que também tenham estado em cultura para o mesmo número de dias (Figura 3B).
Figura 1 representativas (A) e DIC (B) imagens de GFP recém icélulas atriais Solated de um embrião (E19.5) DCT-Z / EG rato filhote. A seta branca identifica o melanócito cardíaca em ambos os painéis. Note-se que, sem o auxílio do marcador fluorescente, o melanócito cardíaca é difícil identificar e distinguir entre os miócitos atriais (setas amarelas) ligados ao prato. A luz de setas azuis apontam para células atriais que não são bem ligados ao prato.
Figura 2. Dct - / - melanócitos cardíacas demonstrar a duração do potencial de acção prolongada. Gravações pinça de corrente de (A) Dct cardíaca +/- e (B) Dct cardíaca - / - células demonstram o aumento da duração do potencial de ação na ausência de Dct. Potencial de repouso da célula Dct +/- é -62 mV, enquanto que o DCT - / - célula tem um potencial de repouso-60 MV. Reproduzido, com permissão, de Levin et al. J. Clin. Invista. 119, 2920-2936 (2009).
Figura 3. Imagens representativas de isolado (A) células de melanócitos, como cardíacas e (B) melanócitos cutâneas. Os melanócitos foram isolados dos corações e pele de ratinhos neonatais (P1), respectivamente, e, em seguida, cultivadas durante 5 dias.
Figura 4. células Dct expressando preencher o coração. (A) A hibridação in situ de um coração de rato E13.5 mostra expressão Dct(setas cheias) de todo o sistema operacional da veia pulmonar (seta aberta). (B) Coloração por imunofluorescência de células Dct-positivas (setas) no interior das veias pulmonares. (C) A coloração por X-gal das células Dct-positivas no átrio posterior de um rato E16.5 coração Dct-LacZ (setas). (D) A coloração por X-gal em um DCT-LacZ coração do rato E17.5 ao longo do septo RA nas regiões do forame oval, ósmio seio coronário e veia cava inferior; inserir escala = 500 pm. (E) do mouse Adulto (p60) resultante do cruzamento de um DctCre +/- e R26R rato demonstra células LacZ positivas (setas) no interior das veias pulmonares e do átrio esquerdo. células (F) DCT-positivas detectadas por coloração de imunofluorescência (setas) no endotélio de uma veia pulmonar humano cirurgicamente removido. Escala = 500 um em todos os painéis excepto os painéis (B e D; escala = 100 pm) e painel (F; escala = 50 mm). Abreviaturas: PV, veia pulmonar; LA, átrio esquerdo; Ao, aorta; PA, Pulmoartéria pulmonar; RA, átrio direito; IVC, veia cava inferior; FO, forame oval; CS, seio coronário. Reproduzido, com permissão, de Levin et al. J. Clin. Invista. 119, 2920-2936 (2009).
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Discussion
Melanócitos cardíacas estão presentes em locais anatômicos dentro do coração que normalmente dão origem a gatilhos arritmia atrial. Essas regiões incluem as veias pulmonares, o anel atrioventricular, a posterior do átrio esquerdo e do forame oval (Figura 4). Para compreender o papel dessas células desempenham na arritmogênese, desenvolvemos técnicas para isolá-los e estudar sua fisiologia. No entanto, reconhecemos que melhorar esta técnica para produzir quantidades mais saudáveis e maiores de melanócitos cardíacos permitiria mais estudos para investigar a resposta dos melanócitos cardíacos a estímulos exógenos. Além disso, a melhoria das técnicas de isolamento também pode permitir estudos para investigar a interação de melanócitos cardíacas com miócitos atriais durante fisiologia normal e na doença.
Este artigo descreve um procedimento para isolar células de melanócito-como viáveis a partir do coração do rato que desenvolvemos a partir de protocolos destinados a isolComeram melanócitos da pele. O passo fundamental para este protocolo é extrair as células de melanócito-like do coração. Embora o isolamento de melanócitos cardíacos dos corações neonatais é relativamente simples, extraindo melanócitos cardíacas do coração madura é muito mais difícil devido ao aumento da quantidade de fibrose intersticial. Neste protocolo, usado digestão com tripsina para extrair células de melanócito-like do coração maduro. Para o desenvolvimento deste protocolo testamos várias combinações enzimáticas que consistiam de várias concentrações de tripsina, colagenase, e dispase.
Descobrimos que o tratamento átrios neonatais com uma combinação de colagenase (para os primeiros 30 minutos) seguido por tripsina (para o próximo 15 min) produziu inicialmente rendimentos mais elevados de células de melanócitos semelhantes, mas as células isoladas foram menos saudável com uma redução da viabilidade. Por outro lado, a digestão com tripsina sozinho produziu um número moderado de células de melanócitos, como saudáveis, da mcorações ature mouse. Portanto, recomendamos apenas usando tripsina para isolar células de melanócito-como de corações murino maduros. Além disso, verificou-se que a trituração vigorosamente a suspensão aquosa obtida após digestão com tripsina de corações de rato maduros melhorou o rendimento de células de melanócitos, como viáveis. Devemos mencionar que a tripsina tem o potencial para digerir parcialmente canais de membrana ou portadores de carga, e isso pode afetar a densidade de canais ao executar estudos patch-clamp. Apesar de não ter realizado uma análise rigorosa para determinar se digestão com tripsina afeta a densidade de corrente de células de melanócito-like maduras isoladas não ter notado quaisquer efeitos significativos sobre correntes ou potenciais de ação nos estudos temos realizado usando esse protocolo.
Melanócitos semelhante cardíacas são uma população de células muito escasso no coração (menos do que 0,1% de todas as células do átrio) que morfologicamente se assemelha melanócitos cutâneas (figura 1 e figura 3 </ Strong>). Devido ao fato de que há relativamente poucos melanócitos cardíacos presentes no coração; até recentemente, só temos sido capazes de usá-los para os ensaios de uma única célula (ou seja, remendo gravação de fixação ou de uma única célula PCR). No entanto, temos obtido grandes quantidades de melanócitos cardíacos, reunindo 20-30 neonatal, ou 5-8 corações maduros, e encontrei esta abordagem produz uma quantidade suficiente de tecido para a realização de immunoblot ou ensaios bioquímicos. Além disso, dado o baixo número de células de melanócitos, como no coração de murídeo, para melhorar o rendimento destas células depois de terem sido isolados que, muitas vezes, coloca 15-20 mm circular, Teflon insere nas placas de 35 mm usando esterilizado graxa vácuo . As células podem então ser colocados no interior das inserções para reduzir a área de revestimento e aumenta a sua densidade. Usando Teflon insere também melhora a viabilidade das células de melanócitos, como a seguir o seu isolamento e durante o período de chapeamento bem.
Alguns melano cardíacacélulas Cyte semelhante têm uma morfologia bipolar após isolamento, o que cremos representa um estado menos diferenciada destas células. Além disso, verificou-se que a cultura de melanócitos cardíacas durante 3 dias após o isolamento parece induzir a diferenciação adicional do fenótipo melanócito semelhante onde as células começam a formar dendrites. Descobrimos também este protocolo produz células de melanócito-like de corações maduros que podem ser mantidos por até 10 dias em cultura. No entanto, para além de 10 dias em células de melanócito-como cultura isoladas de corações maduros vai parar de proliferar e podem se tornar senescente. Melanócitos cardíacos isolados e plaqueadas pode ser utilizado para análise electrofisiológica celular ou outras análises de biologia molecular / celular, tais como perfis de ARN ou de estudos para avaliar as respostas fisiológicas de factores exógenos.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of prêmio Saúde R01 HL105734 para VVPMDL é suportado, em parte, pelo National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP é um pesquisador inovador da American Heart Association apoiada pela concessão 11IRG900384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
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