Summary
Korte visuele beschrijving van de chirurgische techniek en apparaat voor de levering van (gen en cellen) therapieën in het ruggenmerg. De techniek blijkt in het dier, maar is volledig en vertaalbaar momenteel gebruikt bij de mens.
Abstract
Dit is een compacte visuele beschrijving van een combinatie van chirurgische techniek en inrichting voor de levering van (gen en cellen) therapieën in het ruggenmerg. Hoewel de techniek is aangetoond in het dier, de procedure FDA goedgekeurd en momenteel gebruikt voor stamceltransplantatie in het ruggemerg van patiënten met ALS. Terwijl de FDA erkent proof-of-principle gegevens therapeutische werkzaamheid in zeer kenmerk knaagdiermodellen is het gebruik van grote dieren die kritisch zijn voor het valideren van de combinatie van een chirurgische ingreep, een apparaat en de veiligheid van een definitieve therapie voor menselijk gebruik . De grootte, anatomie en algemene kwetsbaarheid van de wervelkolom en het ruggenmerg van de varkens worden opgenomen beter model de mens. Bovendien het chirurgische proces van het blootstellen en het manipuleren van de ruggengraat en sluiten van de wond in het varken nauwelijks van de mens. Wij zijn van mening dat de gezonde varkensmodel een kritisch vertegenwoordigtcal eerste stap in de studie van procedurele veiligheid.
Protocol
1. Animal Use
Procedures aangetoond hierin zijn goedgekeurd door de Emory University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). Vrouw Göttingen minivarkens een gewicht van ongeveer 15-20 kg worden gebruikt.
2. Anesthesie
Dieren worden gevast ongeveer 12 uur voorafgaand aan de operatie. Animal sedatie en anesthesie inductie bestaan uit een cocktail van intramusculaire Ketamine (35 mg / kg), Acepromazine (1,1 mg / kg) en Atropine (0,04 mg / kg). Dieren worden vervolgens geïntubeerd en onderhouden op zuurstof en 1-3% isofluraan algemene anesthesie. Op dit punt wordt de rug en het hoofd van elk dier geschoren. Diepte van de anesthesie wordt gecontroleerd door de veterinaire personeel. Aangezien interdigitale, cornea en palpeerbaar reflexen, en hart-en ademhalingsfrequentie, pulsoximetrie, directe / indirecte bloeddruk, end-tidal kooldioxide metingen en spiertonus / reactie op schadelijke stimuli worden gebruikt dieptemonitor van de anesthesie.
3. Positionering
Dieren worden genomen om de operatiekamer en geplaatst in een buikligging op een frame op maat ontworpen om patiënten positionering na te bootsen op een Jackson spinale operatietafel. Het frame gebruikt verstelbare banden die zijn geplaatst onder de borst en het bekken van het dier, zodat de buik te hangen vrij en derhalve om de druk op de buik en borst en daaruit epidurale veneuze bloeding (figuur 1). Het frame heeft ook externe immobilisatie van de wervelkolom van de procedure 1.
Daarnaast worden dieren op een verwarmde re-circulerende pad om de lichaamstemperatuur en een marginale oorader gecatheteriseerd voor toediening van vocht en eventueel noodzakelijke drug delivery tijdens de operatie te handhaven. Tenslotte wordt het operatiegebied voorbereid met alcohol en Chlorhexadine of Betadine oplossing en chirurgische doeken worden op de chirurgische veld.
le "> 4. LaminectomieEen ongeveer 10-15 cm incisie in de huid wordt uitgevoerd en de paraspinale musculatuur wordt doorsneden van de wervelkolom bilateraal. Vervolgens wordt een multi-level dorsale laminectomie uitgevoerd. De lamina en doornuitsteeksels van drie wervels liggende C3-C5 of L2-L4 segmenten verwijderd met rongeurs en een chirurgische boor.
5. Plaatsing van de Spinal Derrick
We noemen Spinal Derrick het apparaat ontworpen voor de levering van (gen-en cel) therapieën in het ruggenmerg 2-5. Gedetailleerde bespreking van het ontwerp en de evolutie van dit apparaat vindt u op Riley et al.., 2011. 4
Om de inrichting aan de patiënt verzekeren, zijn percutane berichten geplaatst via 1cm incisies boven en onder de primaire incisie en gemonteerd op de lamina boven en onder de primaire incisie.
Vervolgens worden twee geïntegreerde retractors aan de four percutane berichten boven en onder de incisie het gebied van de wervelkolom dat reeds bloot laminectomie.
6. Dural Opening
Met behulp van een Woodson tandheelkundige hulpmiddel en een 11 blad is een 2,5 cm incisie gemaakt door de dura, waardoor de ruggenmerg. De dura wordt weerkaatst de pial laag met 4-0 Nurolon hechting en bevestigd aan de diepe paraspinale spieren.
Chirurgische pasteitjes worden in de rostrale en caudale uiteinden van de opening. Deze bieden een gedeeltelijke barrière voor cerebrospinale vloeistof flow en ook een veilige doelstelling voor de chirurgen om sukkels plaatsen zonder beschadiging van het snoer. In mensen, voor chirurgische microscoop vergroting is pial oppervlak ontleed op dit punt. Door technische beperkingen, is deze procedure niet vereist of haalbaar dieren.
7. Spinal Cord Injecties en zijdelingse verplaatsing van de Spinal Derrick voor extra injecties
Onmiddellijk voorafgaand aan injecties, wordt een bolus van methylprednisolon (125 mg, IV) gegeven ruggenmerg zwelling voorkomen.
Op dit punt wordt het platform railsysteem bevestigd en de zijhekken worden aangepast om de juiste lengte te passen. De gondel is top-geladen in 2 bars en Z drive is gemonteerd op de kruiskoppeling. Vervolgens wordt de beladen canule geplaatst op de Microdrive. Met de kruiskoppeling op de micro-injectie platform zijn de coronale en sagittale hoeken aangepast om een traject loodrecht op het oppervlak van de spinale injecties volgen de plaatsing van de canule te waarborgen. De naald blijft staan dus mediaal van de dorsale wortel ingangszone (DREZ). De DREZ is vastgesteld in het kader 3.5X chirurgische loupe vergroting en drong op een orthogonale traject aan het snoer oppervlak op een punt <1 mm mediaal.
In mensen, een pre-operatieve MRI geeft een nulmeting of ruggenmerg afmetingen voor operatieve planning. Bovendien is de dikte van het ruggenmerg gemeten om de gewenste diepte van de voorhoorn bepalen.
De suspensie wordt toegediend op een diepte van 4 mm van pial contact. Een flens van Ultem plastic dient als een stop op de pia oppervlak om de naald te voorkomen bevorderen dieper dan gewenst. Zodra de naald wordt geplaatst op het doel, wordt de stijve metalen buitenhuis getrokken, waardoor de flexibele buis blootgesteld. Nadat de injectie is voltooid, wordt de naald blijven voor nog eens 1 min. tot reflux cel voorkomen de canule injectie veroorzaken.
Zorg wordt besteed aan het oppervlak vaatstelsel te voorkomen door iets aanpassen van de microdrive of lateralisatie of rostro-caudaal. Sommige bloeden van penetratie sites kunnen optreden. Wanneer een dergelijke bloeding wordt aangetroffen, worden micro-pasteitjes geplaatst over het bloeden prikplaats en zuigkracht wordt toegepast op hen om bloed lont uit de canule penetratie ter voorkoming en opbouw in het koord. Dit maakt betrouwbaar voor het bloed te stollen. Elektrochirurgie wordt vermeden is directe druk.
Na naald verwijderen, wordt de stereotaxische apparaat verplaatst naar het volgende doel site langs de rostro-caudale as, gescheiden door 2 of 4 mm of als nodig is om zichtbare bloedvaten op het dorsale oppervlak van het ruggenmerg te voorkomen. Dit proces wordt herhaald zo vaak als voorgesteld in een bepaalde studie.
8. Drijvende canule
Een aangepaste infusie cannula van kleine diameter gebruikt voor de injecties. De canule bestaat uit een 30-gauge naald afgeschuinde van vaste lengte verbonden met een 30-gauge flexibele slang silastic van variabele lengte. Het distale einde is voorzien van een Hamilton luer lock die is gekoppeld aan een microinjector pomp. De proximale buis wordt silastic ensheathed in een 24-gauge stijve buitenste canule die stoelen op het proximale uiteinde van de injectienaald flens. Deze flens beide stoelende buitenste canule en dient als diepteaanslag voor de injectienaald. Voor elke injectie wordt het juiste volume van een therapeutische suspensie toegediend door middel van een vooraf geijkte Minj-PD microINJECTOR pomp (Tritech Research, Inc, Los Angeles, CA) met een snelheid van 5 ul per minuut.
9. Sluiting
Zodra alle injecties werden gemaakt, wordt de spinale boortoren voorzichtig verwijderd en de incisies gesloten vier lagen. De dura is gesloten met behulp van een 4,0 Nurolon steek, in een waterdichte manier. 0 Vicryl hechtdraad voor de diepe spierlaag. Fascia wordt dan gesloten met 0 Vicryl hechtmateriaal ook in een waterdichte manier. De dermale laag wordt tenslotte afgesloten met 2,0 Vicryl, met een rijgsteek. Wondsluiting wordt uitgevoerd op een 3-0 nylon hechtdraad.
10. Herstel en Beheer van de Pijn
Dieren worden geëxtubeerd en gecontroleerd op 2 uur volgende anesthesie herstel. Vervolgens worden de dieren overgebracht naar individuele cleeftijden en ten minste eenmaal per dag gecontroleerd op voedselconsumptie, ontlasting, en mictie.
Voor pijnbestrijding is een transdermale pleister Fentanyl (75 mcg) geniet aan de rug van de dieren drie dagen post-operatieve analgesie. Bovendien kan Buprenorfine (0,05 mg / kg, tweemaal daags, IM) worden gegeven drie dagen na de operatie.
11. Resultaten en vertegenwoordiger Outcomes
Klinische en gedrag waarnemingen worden uitgevoerd voor de operatie en vervolgens worden opgeslagen op dag 1 tot en met 7 en wekelijks tot eindpunt op basis van de onderzoeksopzet. Behavioral gegevens worden verzameld om neurologische morbiditeit te evalueren zoals eerder beschreven 6. Sensorische functie wordt beoordeeld door de aanwezigheid of afwezigheid van een respons van terugtrekken van mechanische stimulus de tenen van voor-en achterpoten. Motorische functie volgt de Tarlov score (tabel 1): 0 - verlamming, geen beweging; 1 - Voelbare tonus in de achterste ledematen, lichte movement, 2 - Beweging in de achterste ledematen, maar niet in staat om te zitten of te staan; 3 - Mogelijkheid om op te staan en lopen, maar ataxie en voor korte periodes, 4 - volledig herstel, normale motorische functie.
Veiligheid van de procedure wordt bepaald door het vermogen van een dier terugkeren naar pre-operatieve baseline. Voorbijgaande neurologische tekorten moeten meestal opgelost tussen postoperatieve dagen 1 en 7, met enkele variaties afhankelijk dieren rassen en procedure (aantal injecties, onder andere parameters). Blijvende morbiditeit wordt bepaald door blijvende neurologische stoornissen die niet corresponderen met de tijd dieren bereiken IACUC standaard eindpunt (figuur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
| Tarlov Score | |
| 0 | Verlamming, geen beweging |
| 1 | Waarneembaar tonus in de achterste ledematen, lichte beweging |
| 2 | Beweging in de achterste ledematen, maar niet in staat om te zitten of te staan |
| 3 | Mogelijkheid om op te staan en lopen, maar ataxie en voor korte periodes |
| 4 | Volledig herstel, normale motorische functie |
Tabel 1. Tarlov Score. Neurologische morbiditeit en herstel wordt beoordeeld door het scoren van het dier motorische functie.
Figuur 1. Tabel Plaatsing voor PROCEDUREe. dieren worden geplaatst in een liggende positie op een frame speciaal ontworpen om patiënten positionering bootsen op Jackson spinale operatietafel. Het frame gebruikt verstelbare banden die zijn geplaatst onder de borst en het bekken van het dier, zodat de buik te hangen vrij en derhalve om de druk op de buik en borst en daaruit epidurale veneuze bloeding. Het frame heeft ook externe immobilisatie van de wervelkolom van de procedure.
Figuur 2. Motor Function Assessment en vertegenwoordiger Outcomes. Dieren ondergaan een algemeen neurologisch onderzoek voor de operatie en op regelmatige basis na volledig herstel van de procedure. Gait en motoriek worden beoordeeld op basis van de Tarlov score. Deze schaal geeft objectieve criteria evaluatie van de dieren het vermogen om ambulate als Surropoort maatregel van de motorische functie. Veiligheid van de procedure wordt bepaald door het vermogen van een dier terugkeren naar pre-operatieve baseline. Voorbijgaande neurologische tekorten moeten meestal opgelost tussen postoperatieve dagen 1 en 7, met enkele variaties afhankelijk dieren rassen en procedure (aantal injecties, onder andere parameters). Blijvende morbiditeit wordt bepaald door blijvende neurologische tekorten die niet op te lossen op het moment dat de dieren komen IACUC standaard eindpunt.
Aanvullend
Bij celtherapieën voor laminectomie en onder verdoving, een halsader 10F chronische catheter (Access Technologies, CCPS072106A) geplaatst voor toediening van immunosuppressiva voor de duur van de studie. De hals van het dier wordt voorbereid en gedrapeerd. De interne halsader chirurgisch blootgesteld en gecanuleerd met de katheter, die is bevestigd met een 3-0 zijden band. Het proximale uiteinde van de inwendige jugular den geligeerd met een 3-0 zijden stropdas. Vervolgens wordt de katheter uit de tunnel nekvel dorsaal en vastgezet met 3-0 nylon hechtingen. Tenslotte wordt de wond gespoeld en gesloten met een doorlopende 3-0 nylon steek. Deze procedure is niet vereist bij de mens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks de goedkeuring om door te gaan met de beschreven techniek bij de mens 7-9, kritische vragen moeten nog worden beantwoord, zodat het ruggenmerg therapieën om te slagen. Een strenge begrip van het ruggenmerg tolerantie voor intraparenchymateuze injectie is nodig om de planning en uitvoering van proeven ontwikkeling van therapieën inschakelen voor demyeliniserende, degeneratieve en traumatische ruggenmerg ziekte. Momenteel bestaat er geen duidelijk beeld van het aantal injecties dat de grote zoogdieren ruggenmerg kan verdragen zonder transient en permanente morbiditeit. Ook afstand van injecties waarschijnlijk morbiditeit beïnvloeden. Bovendien macroscopische (bijvoorbeeld ventilatie-gerelateerde of onbedoelde beweging van de patiënt) en microscopisch (dwz oscillatie met zowel ventilatie en cardiale puls) ruggenmerg bewegingen risico's voor het ruggenmerg tijdens injectie. Een goed begrip van de drempel voor morbiditeit in een grote diermodel zal helpendosering berekeningen voor alle ruggenmerg therapieprogramma's. Onze translationeel ruggenmerg transplantatie laboratorium is beschikbaar voor preklinische ontwikkelingsprogramma's van alle teams die momenteel het ontwerpen van processen voor het ruggenmerg toepassing te helpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Boulis is de uitvinder van apparaten voor een veilige en nauwkeurige injectie van de menselijke ruggenmerg mogelijk te maken. Neuralstem, Inc heeft gekocht een exclusieve licentie voor deze technologie. Dr Boulis ontving een Invento het aandeel van deze vergoeding, en heeft de rechten op royalty's te betalen voor de distributie van deze technologie. Andere auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de Emory University afdeling Animal Resources personeel voor veterinaire zorg. Financieringsbronnen zijn onder meer: ALS Association, Ministerie van Defensie, en Neuralstem, Inc
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal Derrick | Neuralstem, Inc. | Neuralstem, Inc. has purchased an exclusive license to this technology | |
| MINJ-PD Microinjector pump | Tritech Research, Inc. | Customized for this specific application | |
| Floating Cannula | Neuralstem, Inc. | Custom-designed for this specific application |
References
- Usvald, D., et al. Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs. Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).
- Riley, J., et al. Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation. Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).
- Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord. Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).
- Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery. Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).
- Riley, J., et al. Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform. Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, 164-171 (2011).
- Boulis, N. M., et al. Translational stem cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Nat. Rev. Neurol. , (2011).
- Riley, J., et al. Intraspinal Stem Cell Transplantation in ALS: A Phase I Safety Trial, Technical Note & Interim Safety Outcomes. Neurosurgery. 71 (2), 405-416 (2012).
- Boulis, N. M., et al. Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients. Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).
