Summary
תיאור חזותי קצר של הטכניקה והמכשיר הניתוחיים המשמשת לאספקה (גן ותא) טיפולים לחוט השדרה. הטכניקה באה לידי ביטוי בחיים, אבל הוא לגמרי לתרגום וכרגע בשימוש עבור יישום אנושי.
Abstract
זהו תיאור חזותי קומפקטי משילוב של טכניקה ומכשיר כירורגי למסירת גן (ותא) טיפולים לחוט השדרה. בעוד הטכניקה באה לידי ביטוי בחיים, הוא הליך ה-FDA אשר ומשמשת כיום להשתלת תאי גזע לתוך חוט השדרה של חולי ALS. למרות שה-FDA זיהה נתוני הוכחה של עיקרון על יעילות טיפולית במכרסמים אפיינו מאוד, השימוש בבעלי חיים גדולים נחשב קריטי עבור אימות שילוב של הליך כירורגי, והתקן, ואת הבטיחות של טיפול סופי לשימוש בבני אדם . הגודל, אנטומיה, והפגיעות כלליות של עמוד השדרה וחוט שדרה של החזירים מוכרים למודל טוב יותר האנושיים. יתר על כן, התהליך כירורגי של חשיפה ומניפולציה של עמוד השדרה, כמו גם לסגור את הפצע בחזיר אינו נבדל מהאדם. אנו מאמינים כי מודל החזיר הבריא מייצג critiהצעד הראשון cal במחקר של בטיחות פרוצדורלי.
Protocol
1. שימוש בבעלי חיים
נהלים הפגינו הסכם אושרו על ידי הטיפול באוניברסיטת האמורי המוסדי בעלי חיים והשתמשו ועדה (IACUC). minipigs הנשי גטינגן במשקל ק"ג בערך 15-20 משמשים.
2. הרדמה
בעלי חיים צמו כ 12 שעות לפני הניתוח. הרגעת בעלי חיים ואינדוקצית הרדמה מורכבת מקוקטייל של השריר קטמין (35 מ"ג / ק"ג), Acepromazine (1.1 מ"ג / ק"ג), ואטרופין (0.04 מ"ג / ק"ג). בעלי חיים אז הם מחוברים לצינורות ושמרו על חמצן ו% הרדמה כללית isoflurane 1-3. בשלב זה, הגב והראש של כל חיתו מגולח. עומק ההרדמה מבוקר על ידי צוות הווטרינרים. היעדרם של רפלקסים interdigital, קרנית וpalpebral, כמו גם קצב לב ונשימה, oximetry הדופק, לחץ דם ישיר / עקיף, מדידות סוף גאות פחמן דו חמצני, וטונוס שרירים / תגובה לגירוי מזיק משמשים לניטור עומק של הרדמה.
3. מיקום
בעלי החיים נלקחים לחדר הניתוח ולהציב לתוך אפרקדן על מנהג מסגרת שנועד לחקות את מיצוב חולים על שולחן ניתוחים בעמוד שדרת ג'קסון. המסגרת מנצלת מתלים מתכווננים שנמצאים מתחת לחזה והאגן של בעלי החיים, המאפשר הבטן לתלות חופשיה, ולכן צמצום לחץ על שרירי הבטן והחזה ודימום ורידי אפידורל סוגר (איור 1). המסגרת מספקת גם קיבוע חיצוני של עמוד השדרה להליך 1.
בנוסף, בעלי חיים מונחים על כרית מחוממת מחדש השאלה כדי לשמור על טמפרטורת גוף ווריד אוזן שולית צינתור לממשל נוזל וכל משלוח סמי צורך במהלך ניתוח. לבסוף, את שדה הניתוח הוא prepped עם פתרון Chlorhexadine או פולידין ואלכוהול ווילאות כירורגיות מונחים על שדה הניתוח.
le "> 4. Laminectomyכ 10-15 סנטימטר חתך בעור מתבצע ושרירי paraspinal נתח את עמוד השדרה בילטרלי. בשלב בא, laminectomy הגבה רב ברמה מתבצע. תהליכי lamina וspinous של שמעליה שלוש חוליות C3-C5 או L2-L4 מגזרים יוסרו באמצעות rongeurs ומקדח כירורגים.
5. מיקום של דריק השדרה
אנו קוראים דריק שדרת המכשיר המיועד למשלוח של גן (ותא) טיפולים ל2-5 חוט השדרה. דיון מפורט על העיצוב והאבולוציה של מכשיר זה ניתן למצוא בריילי et al., 2011. 4
כדי לאבטח את המכשיר למטופל, הודעות percutaneous מוצבות דרך חתכים בעור 1cm מעל ומתחת לחתך הראשוני ורכובות על lamina מעל ומתחת לחתך הראשוני.
בשלב בא, 2 מפשק משולב מצורפים לחצur percutaneous הודעות מעל ומתחת לאתר החתך כדי לחשוף את האזור של עמוד השדרה שעברה laminectomy.
6. פתיחת Dural
בעזרת כלי שיניים וודסון 11 להב, חתך 2.5 סמ נעשה באמצעות הדורה, חושף את חוט השדרה. הדורה משתקפת משכבת pial באמצעות תפר Nurolon 4-0 והבטיחה לשרירי paraspinal העמוקים.
קציצות כירורגים ממוקמות בקצוות המקוריים וזנב של הפתיחה. אלה מספקים מחסום חלקי לזרימת נוזל המוח ושדרה וגם מספקים יעד בטוח למנתחים למקום פרייר מבלי לפגוע בכבל. בבני אדם, בהגדלת מיקרוסקופ כירורגי, משטח pial מנותח בשלב זה. בשל מגבלות טכניות, הליך זה אינו נדרש או ריאלי בבעלי חיים.
7. זריקות חוט שדרה ותזוזה לרוחב של דריק השדרה להזרקה נוספתשל
מייד לפני זריקות, בולוס של מתילפרהדניזולון (125 מ"ג, IV) ניתן למניעת נפיחות חוט שדרה.
בשלב זה, מערכת רכבות הפלטפורמה מצורפת ואת המעקות מותאמים לייחס האורך המתאים. גונדולה היא עליונים הועמס על 2 ברים וכונן Z הוא רכוב על המפרק האוניברסלי. בשלב בא, הצינורית הטעונה מונחת על Microdrive. שימוש המשותף האוניברסלית על פלטפורמת microinjection, זוויות העטרה וsagittal מותאמים כדי להבטיח מסלול מאונך למשטח של זריקות השדרה בעקבות המיקום של הצינורית. המחט ממוקמת בהתאם המדיאלי לאזור כניסת השורש הגבה (DREZ). DREZ מזוהה תחת זכוכית מגדלת גדלת 3.5x כירורגית וחדר במסלול מאונך למשטח החוט בנקודה <1 מ"מ מדיאלית.
בבני אדם, MRI טרום ניתוחי מספק בסיס הערכת of ממדי חוט שדרה לתכנון אופרטיבי. יתר על כן, בעובי של חוט השדרה נמדד כדי לקבוע את עומק המטרה של הקרן הבטנית.
ההשעיה הוא החדיר בעומק של 4 מ"מ ממגע pial. מקורב עשוי מפלסטיק Ultem משמש כפקק על פני שטח פיא למנוע את המחט מהקידום עמוק יותר מרצוי. ברגע שקצה המחט ממוקם ביעד, שרוול החיצוני מהמתכת הקשה הוא כלפי מעלה, ומשאיר את הצינור הגמיש חשוף. לאחר ההזרקה הושלמה, המחט להישאר במקום במשך דקות נוספות 1 כדי למנוע ריפלוקס הנייד את מערכת הזרקת הצינורית.
טיפול נלקח כדי למנוע vasculature פני שטח על ידי התאמת microdrive או laterality או rostro-caudally מעט. דימום החלק מאתרי חדירה עלול להתרחש. כאשר דימום כזה הוא נתקל, קציצות מייקר ממוקמות מעל האתר לנקב דימום ויניקה מוחלת להם פתיל דם מצינורית penetrאתר ation ולמנוע הצטברות בכבל. זה אמין מאפשר לדם כדי להקריש. כווייה היא להימנע ככל הוא לחץ ישיר.
לאחר הסרת מחט, מנגנון stereotaxic הוא עבר לאתר היעד הבא לאורך ציר rostro-הזנב, מופרד על ידי 2 או 4 מ"מ או כדרוש כדי להימנע מכלי דם נראו על פני השטח הגבי של חוט שדרה. תהליך זה חוזר על עצמו פעמים רבות ככפי שהוצע במחקר נתון.
8. קנייה צפה
צינורית עירוי מנהג הקוטר צר משמשת לזריקות. הצינורית מורכבת ממחט קטומה 30-מד של אורך קבוע מחובר לצינורות גמישים 30-silastic מד באורך משתנה. סוף דיסטלי מצויד במנעול המילטון luer המחובר למשאבת microinjector. צינורות silastic הפרוקסימלי הוא ensheathed בתוך צינורית חיצונית נוקשה 24 מד המושבים בסוף הפרוקסימלי של מקורבות מחט הזריקה. מקורב זה שני המושביםצינורית והחיצונית משמשת כתחנה לעומק את המזרק. לכל הזרקה, הנפח המתאים של השעיה טיפולית הוא החדיר ידי שימוש מראש מכוילת-MINJ-PD microINJECTOR משאבה (Tritech Research, Inc, לוס אנג'לס, קליפורניה) בשיעור של 5 μl לדקה.
9. סגירה
ברגע שכל הזריקות נעשו, דריק השדרה הוסר בעדינות והחתכים סגורים בארבע שכבות. הדורה סגורה באמצעות 4.0 Nurolon תפר, בצורה אטומה למים. תפר 0 Vicryl משמש לשכבת שרירים העמוקה. אז fascia סגור עם תפרי 0 Vicryl גם באופנה אטומה למים. שכבת הדרמיס היא סגרה לבסוף עם 2.0 Vicryl, עם תפר פועל. סגירת עור הושלמה באמצעות תפרי ניילון 3-0.
10. התאוששות וטיפול בכאב
בעלי חיים והפיקוח extubated להתאוששות הרדמה הבאה 2 שעות. בשלב הבא, בעלי חיים הועברו לג פרטגילים ומעקב לפחות פעם ביום לצריכת מזון, עשיית צרכימים, והשתנה.
לניהול כאב, מדבקת פנטניל דרך עור (75 ק"ג) היא משודכת על גבם של בעלי החיים לשלושה ימים של כאבים שלאחר הניתוח. בנוסף, עצירות (0.05 מ"ג / ק"ג, BID, IM) יכולות גם תינתננה לתקופה של עד שלושה ימים לאחר הניתוח.
11. תוצאות ותוצאות מייצגות
תצפיות קליניות והתנהגות מבוצעות לפני ניתוח ולאחר מכן נרשמו בימים 1 עד 7 ועד נקודת סיום שבועי על פי תכנון המחקר. נתוני התנהגות נאספים להעריך תחלואת נוירולוגית כפי שתוארו בעבר 6. תפקוד חושי מוערך על ידי נוכחות או היעדר של תגובה לגירוי מכאני נסיגה עד בוהן גפיים קדמיים ואחוריים. תפקוד מוטורי כדלקמן ניקוד Tarlov (טבלה 1): 0 - שיתוק, אין תנועה; 1 - הטונוס ניכר בגפיים האחוריים, מ 'קלovement; 2 - תנועה בגפיים האחוריים, אבל לא מסוגל לשבת או לעמוד, 3 - היכולת לעמוד וללכת אבל ataxic ולתקופות קצרות; 4 - התאוששות מלאה, תפקוד מוטורי נורמלי.
בטיחות שבהליך זה נקבע על ידי יכולתו של בעל חיים כדי לחזור לנקודת התחלת טרום ניתוחית. גירעונות נוירולוגיות חולפים צריכים בעיקר לפתור בין ימים שלאחר ניתוח 1 ו 7, בשינויים קלים בהתאם לגזעים והנהלים של בעלי החיים (מספר הזריקות, בין פרמטרים אחרים). תחלואה קבועה מוגדרת על ידי גירעונות נוירולוגיות ארוכי טווח שלא ליישב בזמן בעלי חיים להגיע לנקודת סיום כברירת מחדל IACUC (איור 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
| ציון Tarlov | |
| 0 | שיתוק, אין תנועה |
| 1 | טונוס ניכר בגפיים האחוריים, תנועה קלה |
| 2 | תנועה בגפיים האחוריים, אבל לא מסוגל לשבת או לעמוד |
| 3 | יכולת לעמוד וללכת אבל ataxic ולתקופות קצרות |
| 4 | התאוששות מלאה, תפקוד מוטורי נורמלי |
טבלת 1. ציון Tarlov. תחלואה והחלמת נוירולוגיות מוערך על ידי בקיע התפקוד המוטורי של בעלי החיים.
איור 1. מיקום שולחן לProcedurדואר. בעלי חיים ממוקמים לתוך אפרקדן על מנהג מסגרת שנועד לחקות את מיצוב חולים על שולחן ניתוחים בעמוד שדרת ג'קסון. המסגרת מנצלת מתלים מתכווננים שנמצאים מתחת לחזה והאגן של בעלי החיים, המאפשרת בטן לתלות חופשיה, ולכן צמצום לחץ על שרירי הבטן והחזה ודימום ורידים אפידורל עקב כך. המסגרת מספקת גם קיבוע חיצוני של עמוד השדרה להליך.
איור 2. הערכת מוטור פונקציה ותוצאות מייצגות. בעלי חיים לעבור בדיקת נוירולוגית כללית לפני ניתוח ועל בסיס קבוע לאחר התאוששות מלאה מההליך. בהליכה ובתפקוד מוטורי מוערכות לפי ציון Tarlov. סולם זה מספק קריטריונים אובייקטיביים להערכת יכולתם של בעלי החיים לambulate כsurroמדד שער של תפקוד מוטורי. בטיחות שבהליך זה נקבע על ידי יכולתו של בעל חיים כדי לחזור לנקודת התחלת טרום ניתוחית. גירעונות נוירולוגיות חולפים צריכים בעיקר לפתור בין ימים שלאחר ניתוח 1 ו 7, בשינויים קלים בהתאם לגזעים והנהלים של בעלי החיים (מספר הזריקות, בין פרמטרים אחרים). תחלואה קבועה מוגדרת על ידי גירעונות נוירולוגיות ארוכי טווח שלא ליישב בזמן בעלי חיים להגיע לנקודת סיום כברירת מחדל IACUC.
הוספות
במקרה של תא טיפולים, לפני laminectomy ותחת הרדמה, קטטר וריד צוואר 10f כרוני (טכנולוגיות גישה, CCPS072106A) ממוקם לעירוי לוריד של מערכת חיסון לתקופת המחקר. הצוואר של חית prepped ועטופה. וריד הצוואר הפנימי חשוף ניתוח וcannulated עם קטטר, שהוא מאובטח עם עניבת משי 3-0. הסוף הפרוקסימלי של הצוואר הפנימי הואn גבעול עם עניבת משי 3-0. בשלב הבא, צנתר מנהרה מחוץ לעור הצוואר dorsally ומאובטח עם 3-0 תפרי ניילון. לבסוף, הפצע מושקה וסגר עם תפר ריצת 3-0 ניילון. הליך כזה אינו נדרש בבני אדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות אישור להמשיך בטכניקה המתוארת בבני אדם 7-9, שאלות קריטיות להישאר להיות ענו במטרה לטיפולים בעמוד שדרה כדי להצליח. הבנה קפדנית של סובלנות חוט שדרה להזרקת intraparenchymal נדרשת כדי לאפשר תכנון וביצוע הניסויים לפיתוח טיפולים לdemyelinating, ניוונית, ומחלות עמוד שדרה טראומטיות. נכון לעכשיו, אין הבנה ברורה של מספר הזריקות שעמוד השדרה של יונקים הגדול יכול לסבול ללא תחלואה חולפת וקבועה. כמו כן, מרווח בין זריקות עלול להשפיע על תחלואה. יתר על כן, מאקרוסקופיים (למשל, תנועת מטופל מכוונת אוורור הקשורה או) ומיקרוסקופיות (כלומר, תנודה עם שניהם אוורור ודופק לב) תנועות עמוד שדרה מהוות סיכון לחוט השדרה במהלך זריקה. הבנה של הסף לתחלואה במודל חיה גדולה תסייעמינון חישובים לכל תוכניות הטיפול בעמוד השדרה. חוט שדרת translational השתלת המעבדה שלנו זמינה כדי לעזור תוכניות פיתוח קליניות של כל צוותות תכנון ניסויים כיום ליישום חוט שדרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ד"ר וליס הוא הממציא של מכשירים כדי לאפשר הזרמה בטוחה ומדויקת של חוט השדרה של האדם. Neuralstem, Inc רכש רישיון בלעדי לטכנולוגיה זו. ד"ר וליס קבל הנתח של invento של תשלום זה, ויש לו את הזכויות לתשלומי תמלוגים עבור הפצה של טכנולוגיה זו. מחברים אחרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לחטיבת אוניברסיטת האמורי בצוות בעלי חי משאבים לטיפול וטרינרים. מקורות מימון כוללים: ALS אגודה, משרד ההגנה, וNeuralstem, Inc
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal Derrick | Neuralstem, Inc. | Neuralstem, Inc. has purchased an exclusive license to this technology | |
| MINJ-PD Microinjector pump | Tritech Research, Inc. | Customized for this specific application | |
| Floating Cannula | Neuralstem, Inc. | Custom-designed for this specific application |
References
- Usvald, D., et al. Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs. Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).
- Riley, J., et al. Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation. Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).
- Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord. Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).
- Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery. Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).
- Riley, J., et al. Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform. Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, 164-171 (2011).
- Boulis, N. M., et al. Translational stem cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Nat. Rev. Neurol. , (2011).
- Riley, J., et al. Intraspinal Stem Cell Transplantation in ALS: A Phase I Safety Trial, Technical Note & Interim Safety Outcomes. Neurosurgery. 71 (2), 405-416 (2012).
- Boulis, N. M., et al. Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients. Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).
