Summary
Orthotope levertransplantatie bij ratten is een onmisbare experimenteel model voor biomedisch onderzoek. Hier presenteren we onze chirurgische procedures voor orthotope rat levertransplantatie met een lever-arteriële reconstructie met behulp van een 50% gedeeltelijke graft.
Abstract
Orthotope levertransplantatie (OLT) bij ratten met behulp van een gehele of gedeeltelijke graft is een onmisbare experimenteel model voor transplantatie onderzoek, zoals onderzoek bij graft behoud en ischemie-reperfusie schade 1,2, immunologische reacties 3,4, hemodynamiek 5,6, en kleine-for-size-syndroom 7. De rat OLT is een van de moeilijkste diermodellen in experimentele chirurgie en vraagt om geavanceerde microchirurgische vaardigheden die een lange tijd om te leren nemen. Derhalve is het gebruik van dit model beperkt. Aangezien de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid zijn belangrijke componenten van de experimenten waarin dergelijke complexe diermodellen worden gebruikt, is het essentieel voor chirurgen die betrokken zijn bij rat OLT worden getraind in goed gestandaardiseerde en verfijnde procedures voor dit model.
Terwijl verschillende technieken en modificaties van OLT bij ratten zijn gemeld 8 sinds de eerste model was described. by Lee et al.. 9 in 1973, de eliminatie van de hepatische arteriële reconstructie 10 en de invoering van de manchet anastomose techniek Kamada c.s.. waren 11 een belangrijke vooruitgang in dit model omdat de reconstructie procedures vereenvoudigd in hoge mate . In het model van Kamada c.s.. Werd de lever rearterialization ook geëlimineerd. Omdat ratten kon overleven zonder hepatische arteriële flow na levertransplantatie, was er veel controverse over de waarde van de lever arterialization. Echter, de fysiologische superioriteit van de arterialized model in toenemende mate onderkend, met name in termen van het behoud van de galwegen systeem 8,12 en de lever integriteit 8,13,14.
In dit artikel presenteren we gedetailleerde chirurgische procedures voor een rat model van OLT met een lever-arteriële reconstructie met behulp van een 50% gedeeltelijke transplantaat na ex vivo lever resectie. De reconstructie procedures voor elk vaartuig en de galwegen worden uitgevoerd door de volgende methoden: een 7-0 polypropyleen continue hechtdraad voor de supra-en infrahepatic vena cava, een manchet techniek voor de poortader, en een stent techniek voor de leverslagader en de galwegen.
Protocol
1. Basis Technieken en gemeenschappelijke procedures
- Alle procedures worden uitgevoerd onder schoon, maar niet steriel omstandigheden.
- Zodra de buik van de rat wordt geopend, worden alle procedures uitgevoerd onder een chirurgische microscoop bij een vergroting van 16x. Uitzonderingen zijn de ex vivo leverresectie, die wordt uitgevoerd op 10x, en de volgende procedures, die worden uitgevoerd op 25x: het inbrengen van een stent in de galwegen en de leverslagader en de reconstructie van de arteria hepatica, de infrahepatic vena cava (IHVC) en de galwegen.
- Wattenstaafjes worden gebruikt voor zachte manipulatie van organen, stompe dissectie van weefsels, en compressie hemostase. Gaaskompressen (5 x 5 cm) gedrenkt Ringerlactaat worden gebruikt om de lever en darmen trekken en te houden organen vochtig. De Satinsky klem kan worden gebruikt voor het terugtrekken van gaas bedekte darmen naar links of de staart van de rat om het chirurgische gebied te verbreden om de IHVC.
- Alle ligaties worden uitgevoerd met een 6-0 zijden draad behalve de steeltjes van leverlobben in ex vivo leverresectie, waarbij 4-0 zijdedraad gebruikt. De ligatuur kan worden getrokken door een DeBakey Bulldog klem of andere instrumenten om voldoende spanning aan de geligeerde punt zodat de tweede ligatuur kan worden gemaakt op een afstand van de eerste en de scheiding tussen de twee geligeerde punten goed kan worden uitgevoerd.
- Alle intraveneuze injecties worden uitgevoerd via de penis ader.
- Tijdens de reconstructie procedures voor de suprahepatic vena cava (SHVC), de poortader, de leverslagader en de galwegen, een klompje oliebasis klei wordt gebruikt om een vinger ring van perifere vasculaire klem of een mug forceps houden ze vast in positie te houden.
2. Pre-operatieve voorbereiding
- Mannelijke Lewis ratten met een gewicht tussen 230 en 250 g worden gebruikt als donor en ontvanger voor levertransplantatie. De ratten zijnverschuldigd vrije toegang tot water en voedsel tot de inductie van de anesthesie.
- Manchet voor de poortader (figuur 1): Bereid de manchet voor de poortader door het snijden van een 14-gauge katheter met een nr. 11 scalpel onder de microscoop. De manchet bestaat uit een lichaam en een verlenging, elk met een lengte van 2 mm. Maken omtreksgroeven op de manchet door klemming de wand van de manchet stapsgewijze omtrek met een mug forceps zodat een thread nauwkeurig kunnen worden bevestigd aan de manchet zonder afglijden.
- Stents voor de galwegen en leverslagader (Figuur 1): Cut 24-gauge catheters met een scalpel onder de microscoop afschuiningen produceren beide uiteinden van de katheters met een lengte van 4 mm voor de leverslagader en 5 mm voor de galwegen .
3. Donor Operatie
Het schema van de verwijdering van de lever van de donor rat wordt getoond in figuur 2. Deze procedure duurt ongeveerimately 30-35 min.
- Verdoven de rat met inhalatie van 4 vol% isofluraan in 100% zuurstof met een debiet van 4 L / min voor de inductie van de anesthesie en 1,5 vol% bij 2 L / min voor het onderhoud. Injecteer buprenorfine (0,1 mg / kg) subcutaan als analgeticum. Plaats de rat op een verwarmingselement, en bevestig de bovenarmen met behulp van de magnetische fixator retractie systeem (figuur 3a). Scheren de vacht van het gehele buik van de rat, en steriliseer de overeenkomstige huid met een povidon-joodoplossing.
- Open de buik door een incisie met bilaterale extensies. Plaats een 5 ml spuit onder de achterkant van de rat zodat de SHVC ventraal wordt verhoogd. Met behulp van een mug een tang, klemmen en trek de zwaardvormig proces in de richting van het hoofd, en breng de subcostal oprolmechanismen aan het chirurgische veld (figuur 3a) te openen.
- Prepareer de falciform ligament en de linker driehoekige ligament. Vervolgens ligeren en verdeel de linker phrenicus ader.
- Retromhoog handelen de mediaan en linker laterale lobben met een natte gaas wattenstaafje. Met behulp van een bipolaire tang, coaguleren en verdeel de para-oesofageale schepen tussen de linker laterale en anterieure Spiegelse kwab.
- Verplaats de darmen buiten de buik op de linkerkant van de rat, en bedek ze met een natte gaas wattenstaafje. Naar boven Trek de rechter laterale kwab met een natte gaas wattenstaafje. Isoleer de IHVC van de retroperitoneale weefsel en ligeren rechts bijnier ader, die later wordt verdeeld vlak voor de graft verwijderen.
- Een stent te plaatsen in de galweg (figuur 3b):
- Ligeren van het galkanaal ter hoogte van de splitsing van de gastroduodenale slagader. De zachte weefsels rond de galwegen moet zoveel mogelijk worden behouden, en de scheiding van de galwegen van de leverslagader moet worden vermeden om voldoende arteriële bloedtoevoer naar de galwegen verzekeren.
- Met rechte micro schaar, maken een kleine incisie in de anteriof wand van de galwegen proximaal van de geligeerde punt. Houd de voorste wand van de incisie met een rechte micro pincet in de linkerhand, plaatst u een stent in het kanaal met behulp van een gebogen micro pincet in de rechterhand, en zet het vast met een 6-0 zijden draad. Een van de afgesneden einden van de draad op de galwegen wordt op een lengte van 4 mm waardoor de draad kan worden gehouden tijdens de latere anastomose.
- Bevrijd de poortader van de pylorus en de milt aderen door het ligeren en ze te delen.
- Ligeren en verdeel de gastroduodenale slagader, dan is isoleren de gemeenschappelijke leverslagader (CHA) van de pancreas hoofd naar de wortel. Draai de lever naar rechts met wattenstaafjes en ontleden het ligament rond de achterkant van de lever en de slokdarm.
- Bij de voltooiing van de voorbereidingen voor de lever excisie, verwijdert u de oprolmechanismen, de mug pincet voor de zwaardvormig proces, en de 5-ml spuit onder de achterkant van de rat. Zet de darmen om de abdominal holte.
- Injecteer 500 IE Heparine Natrium-in 2 ml van een fysiologische zoutoplossing via de penis ader. Ongeveer 3 minuten later, stelt u de 5-ml spuit, de mug tang, en de oprolmechanismen. Ligeren van het CHA proximaal aan de wortel. Houd een van de afgesneden einden van de draad geligeerd voor de CHA lang.
- Na het klemmen van de IHVC dicht bij de juiste nierader met een mug tang, klemt u de poortader met een wegwerp micro schip klem onder de stomp van de milt ader. Incise de voorste wand van de poortader, en plaats een 18-gauge katheter in de vena porta.
- Perfuseren de lever in situ met 60 ml koud histidine-tryptofaan-ketoglutaraat (HTK) oplossing bij een hydrostatische druk van 20 cm H2O Onmiddellijk daarna, snijd het middenrif en doorsnijden de intrathoracale vena cava, en snijd de voorste wand van de IHVC open, zodat de perfusie-oplossing worden gespoeld van de lever (figuur 3c).
- Klem de IHVC met een disposable micro schip klem net onder de lever. Snijd de lever door het ontleden van de IHVC net onder het midden tussen de lever en de juiste nierader, de poortader onder de stomp van de milt ader, het membraan, de resterende ligamenten aan de achterkant van de lever, bijnier rechts ader en de CHA aan de wortel. Plaats de uitgesneden lever in koud HTK oplossing in een metalen cup gemonteerd in een plastic doos vol gemalen ijs.
4. Ex vivo Graft Voorbereiding
Alle procedures voor de lever transplantaat worden uitgevoerd in de metalen kom gevuld met ijskoude HTK oplossing. De ex vivo transplantatie voorbereiding vraagt ongeveer 30 minuten.
- Voor het bevestigen van een boei tot de poortader (figuur 4):
Klem de portale veneuze stam met een DeBakey Bulldog klem. Plaats de klem in een overbruggende positie over de kop (figuur 4a, b). Zet de poortader door de manchet, en klemde poortader opnieuw combinatie met de verlenging van de manchet op de 12 uur positie (figuur 4c). Evert de wand van de vena porta over de manchet om de stomp van de milt ader positioneren buiten de manchet op de 7 uur positie (Figuur 4d), en zet de poortader met een 6-0 zijden draad (Figuur 4e) . - Een stent te plaatsen in de leverslagader (Figuur 5):
Bevestig de lever door klemmen beide randen van het membraan door een tang en trek de CHA recht door te oordelen de geligeerde draad met de DeBakey Bulldog klem (figuur 5a). Met rechte micro schaar, maken een kleine incisie in de voorste wand van de CHA. Met de linker hand de voorwand van de incisie met een rechte micro forceps, en met de rechterhand een stent te plaatsen in de CHA met een gebogen micro forceps. De stent wordt voorgewassen met heparine-oplossing Natrium (100 IU / ml) (figuur 5b-d). Secure de stent met een 6-0 zijden draad en houdt een van de afgesneden einden van de draad met een lengte van 4 mm. Spoel de lever via de arteriële catheter met 5 ml koude HTK oplossing. - Voor 50% leverresectie (Figuur 6):
- Klem de achterste Spiegelse kwab met een mug een tang om het te repareren op zijn plaats. Resectie de nok na ligatie van de pedikel met een 4-0 zijden draad (Figuur 7a). Op dezelfde wijze, verwijderen anterior caudate kwab.
- Draai de plastic doos 90 graden. Klem de rechterrand van het membraan en het linker gedeelte van de mediaan kwab. Een kleine incisie aan de bovenrand van de rand van de bilaterale delen van de mediaan kwab en verwijder het linker gedeelte na ligatie (figuur 7b). Verwijder de linker laterale kwab na ligatie van de pedikel met een 4-0 zijden draad. Zorgvuldig cauterize de verwijderde lever oppervlak met een bipolaire tang. Daardoor wordt de levermassa verlaagd metpproximately 50% 15 (figuur 7c, d).
- Voor plastie van de SHVC (Figuur 8):
Bepaal de positie van de lever door klemmen beide randen van het membraan met een mug forceps (figuur 8a). Trim de voorwand van de SHVC door verwijdering van de overeenkomstige membraan. Bevestig twee 7-0 polypropyleen hechtingen van buiten naar binnen op beide hoeken als hechtingen blijven voor de latere anastomose (figuur 8b). Dan knip de achterste wand van de SHVC. - Sla de lever transplantaat bij 4 ° C in oplossing in een HTK koud waterbad.
5. Ontvanger Operatie
Het schema van het transplantaat implantatie in de ontvanger rat wordt getoond in figuur 9. De ontvanger bewerking vereist 60-70 min, 10-11 min van anhepatische tijd en ongeveer 23-24 min IHVC klemmen tijd omvat.
- Voer dezelfde procedures als in de doof bediening (3.1 tot 3.4) met uitzondering van de opening van de buik door een incisie zonder bilaterale extensions (figuur 10a).
- Een natte gaas swab de rechterkant van het duodenum en hele darmen op een chirurgisch veld te verkrijgen rond de IHVC. Zet de linker laterale en mediane lobben in de linker subfrenische holte, en naar boven trekken van de rechter laterale kwab met een natte gaas wattenstaafje. Isoleer de IHVC van het retroperitoneale weefsel. Ligeren en verdeel rechts bijnier ader (figuur 10b). Met een natte gaas en wattenstaafjes, draai de lever aan de linkerkant, en ontleden het ligament rond de achterkant van de lever.
- Zet de rechter laterale lob de anatomische positie. Plaats een nat gaasje wattenstaafje te dekken en naar boven trekken van de mediaan en linker laterale lobben. Transect de galwegen net onder de tak van de Spiegelse kwab. De zachte weefsels rond de galwegen moet zoveel mogelijk behouden blijven. Houd een van de afgesneden einden van de eLees geligeerd voor de galwegen bij 4 mm lang.
- Ligeren en verdeel de gastroduodenale slagader en de juiste leverslagader in een 3-mm afstand tot de vertakking van de CHA. Dan een Y-structuur van de slagader op het einde van de CHA. Houd een van de afgesneden einden van de draad geligeerd voor de juiste leverslagader bij 4 mm lang. Draai de lever naar rechts met wattenstaafjes en ontleden het ligament rond de achterkant van de lever aan de linkerkant.
- Na de intraveneuze injectie van 2 ml van Ringerlactaat, klemmen de IHVC met een metalen vat micro klem net boven de juiste nierader. Klem de poortader op het niveau van de bifurcatie in de lever hilum door een mug forceps aan de linkerkant van de rat. Samen Klem de SHVC met het membraan aan de goede kant door een perifere vasculaire klem, en bevestig de vinger ring van de klem in een keer van op olie gebaseerde klei.
- Verminder de anesthesie met isofluraan tot 0,4 vol% tijdens de anhepatische tijd (de duurvan cross-klemming van de poortader). Accijnzen de ontvanger inheemse lever door het ontleden van de SHVC, de poortader en de IHVC op de volgende niveaus: de SHVC, op de grens tussen de SHVC en de lever, en de poortader, net boven de kaak van de mug tang, en de IHVC iets onder het midden tussen de lever en de juiste nierader (figuur 10c). Orthotopically Plaats de lever transplantaat.
- Voor de anastomose van de SHVC door een continue hechting (figuur 11):
- Gebruik een gebogen micro pincet in de linkerhand tijdens de hechten procedure voor het vastgrijpen van de vaatwand of het bedrijf de hechten naald. Plaats eerst het verblijf hechting op de ontvanger SHVC van binnen naar buiten met behulp van de bijgevoegde 7-0 polypropyleen in de rechterhoek van het transplantaat, gevolgd door een knoop (of u kunt bind het immers hechten procedures zijn voltooid). Plaats vervolgens het tweede verblijf hechtdraad op dezelfde manier aan de linkerkant maïseh, dat zal het uitgangspunt steek van een lopende hechtdraad zijn. Om de anastomose te verbreden, te begrijpen en onderhouden van de hechtingen met behulp van DeBakey bulldog klemmen op beide hoeken met zachte tractie superiolaterally (Figuur 11a, b).
- Pierce de hechting in de linkerhoek door de wand van het transplantaat zijde van buiten naar binnen nauw om de knoop buiten en intraluminaal de achterste rij van het SHVC met 7 of 8 steken naar rechts (figuur 11c) hechten. Maak de eerste paar steken zorgvuldig, zodat de binnenkant lumen zijn elkaar geconfronteerd. In de rechterhoek, doorboren de 7-0 polypropyleen door het vat op het transplantaat kant naar buiten.
- Vervolgens hechten de voorste rij van buiten, van rechts naar links, met ongeveer 10 steken (figuur 11d). Vóór de voltooiing van de voorste rij, spoel de binnenkant met Ringerlactaat oplossing om luchtbellen te verwijderen. Maak de laatste steek op de voorste rij zo dichtmogelijk om het verblijf hechtdraad in de linkerhoek en knoop ze aan elkaar.
- Voor de reconstructie van de poortader door een manchet techniek (Figuur 12):
- Naar boven Trek de mediaan en linker laterale lobben met een natte gaas wattenstaafje. Klem de ontvanger poortader naar de monding in de pyloric ader door het gebruik van een wegwerp micro schip klem van rechts. Bevestig de mug tang die klemt de poortader in de klei, en trek de punt van de tang in de richting van de lever navel (Figuur 12a, b).
- Incise de voorste wand van de vena porta net onder de kaak van de mug tang. Was de binnenkant van de ontvanger poortader en de manchet Ringerlactaat. Houd de voorwand van de incisie met een rechte micro forceps in de linkerhand en een verlenging van de manchet met een gebogen micro forceps in de rechterhand. Plaats de manchet in de ontvanger poortader diep, en zet het vast met eenomtrek 6-0 zijden draad (figuur 12c-f).
- Laat de klemmen van de poortader en SHVC, en dan reperfuse de lever. Verwijder de 5-ml spuit uit de achterkant van de rat en de concentratie van isofluraan tot 0,8 vol%.
- Voor de reconstructie van de arteria hepatica door een stent techniek 16 (figuur 13):
- Houd eerst de draad van de ontvanger correct leverslagader door een mug forceps van de linkerkant, en trek deze naar de lever navel, en klem dan de ontvanger CHA van de rechterzijde in de buurt van de alvleesklier (Figuur 13a).
- Met een rechte micro forceps, een kleine incisie in de splitsing van de Y-structuur aan het eind van de ontvanger CHA een trechtervormige opening maken. Houd de stent geplaatst in de graft CHA met een gebogen micro forceps. Na ieder lumen met heparine-oplossing Natrium (100 IU / ml), schuift de stent in de recipient CHA en zet hem vast met een 6-0 zijden draad. Bind een uiteinde van deze draad de ontvanger CHA en 4 mm schroefdraad op de graft CHA elkaar zodat beide CHA dichter bij elkaar verminderde spanning van de anastomose-site (Figuur 13b). Daarna laat u de klem.
- Voor de anastomose van de IHVC door een continue hechting (figuur 14):
Anastomose op dezelfde manier als voor de SHVC, maar gebruiken meer steken met fijnere bite (figuur 14a-d). Afbinden van de hechtingen in het laatste steek kan worden geëlimineerd of binding kan worden bereikt met een groeifactor van de anastomose strictuur door te strak binden voorkomen. Na declamping, verhoging van de concentratie van de anesthesie tot 1,0 vol%. Als de anastomose ziet stenotische, verwijden de anastomose plaats door aan de bilaterale verblijf hechtingen of de verbreding van de voorste rij voorzichtig naar de anastomose te breiden. - Dien 0,5 ml van 8,4% natriumbicarbonaat solution met 1,0 ml Ringerlactaat oplossing intraveneus toegediend.
- Breng een kleine fragmenten van TachoSil aan de verwijderde lever oppervlak af te dichten om het bloeden en biliaire lekkage te voorkomen.
- Voor de reconstructie van de galwegen een stent techniek:
- Houd de draad van de ontvanger galwegen door een mug forceps van de linkerkant. Bevestig de mug tang in de klei, en trek de punt van de tang in de richting van de lever navel.
- Maak een kleine incisie in de galwegen op het passende niveau, zodat de gereconstrueerde galgang zou niet te lang. Plaats de stent geplaatst in de graft galgang in de ontvanger kanaal met veel aandacht voor een twist te voorkomen, en zet het vast met een 6-0 zijden draad. Binden deze draad de ontvanger kanaal en de 4-mm schroefdraad op het transplantaat kanaal elkaar zodat beide kanalen dichter bij elkaar verminderde spanning van de anastomose site.
- Bij de voltooiing van de wederopbouw procedures, injecteren 1 ml 5% glucose-oplossing intraveneus (Figuur 15).
- Bevestig een adequate hemostase, en dan de abdominale incisie te sluiten door middel van continue 4-0 Vicryl hechtingen in twee lagen.
6. Postoperatieve behandeling en follow-up
Direct na de operatie, behandeling van de ontvanger rat met een subcutane injectie van cefuroxim natrium (16 mg / kg) en buprenorfine (0,1 mg / kg) in totaal 1,5 ml van een fysiologische zoutoplossing. Laat de rat te herstellen gedurende 60 min in een speciale intensive care unit kooi met warme lucht (30-35 ° C) en een zuurstof. Injecteer buprenorfine (0,1 mg / kg) subcutaan als analgeticum elke 12 uur gedurende 3 dagen. Daarna verplaatst de rat een normale kooi en bieden ad libitum toegang tot water en voedsel.
Representative Results
Alle ontvangende ratten (n = 20) overleefden zonder duidelijke complicaties tot geplande euthanasie voor bloedbemonstering op 1, 3, 24 en 168 uur (7 dagen) na portal reperfusie (n = 5 op elk tijdstip). De bloedmonsters werden uit de IHVC door een directe lek met een 27-gauge naald. Na het centrifugeren bij 5340 g gedurende 10 min werden de serummonsters verkregen en geanalyseerd op alanine aminotransferase (ALT), die de mate van hepatocellulaire schade na transplantatie weerspiegelen. Het tijdsverloop van veranderingen in serum ALT niveaus is weergegeven in figuur 16. De ALT-niveaus een piek bij 24 uur (gemiddeld ± standaarddeviatie: 212,6 ± 67,9 IE / L) en vervolgens binnen de normale grenzen af op 168 uur (33,6 ± 6,8 IE / L).
Figuur 1. Een manchet voor de poortader (PV) van een 14-gauge katheter en stents voor de leverslagader (HA) en galwegen (BD) van 24-gauge catheters.
Figuur 2. Schema van de verwijdering van de lever van de donor ratten BD, galgang,. HA, leverslagader, IHVC, infrahepatic vena cava, PV, poortader, SHVC, suprahepatic vena cava.
Figuur 3. Donor werking. een. de rat wordt op een verwarmingskussen met een magnetische fixator veersysteem. Het abdomen wordt geopend door incisie met bilaterale extensions. B. Inbrengen van de stent in de galwegen. C. Perfusie van de lever via de poortader. Afkortingen verklarened in figuur 2.
Figuur 4. Bevestiging van een manchet om de poortader. a, b. DeBakey Bulldog De klem die de portale veneuze stam grijpt wordt over de metalen kom. De beker is gemonteerd in de plastic doos gevuld met gemalen ijs. C. De poortader wordt gebracht door middel van de manchet. D. De wand van de vena porta is eversie over de manchet met de stomp van de milt ader buiten de manchet op de 7 uur positie en een uitbreiding van de manchet op de 12 uur positie. e. De poortader is beveiligd met een omtrek 6-0 zijden draad op de manchet. De zwarte pijlen geven de stomp van de milt ader.
Figuur 5. Ex vivoinbrengen van een stent in de leverslagader. een. de lever wordt door klemmen beide randen van het membraan en de leverslagader wordt getrokken rechtstreeks houdt de draad geligeerd de slagader. b. de voorwand van de kleine incisie in de leverslagader wordt gehouden met een rechte micro forceps . c, d. de stent wordt ingebracht in de leverslagader en vastgezet met een 6-0 zijden draad.
Figuur 6. Het schema van ex vivo 50% leverresectie. Lobben in grijze kleur worden verwijderd. ACL, anterior Spiegelse kwab, PCL-, achterste Spiegelse kwab, LLL, linker laterale kwab, LML, linker gedeelte van de mediaan kwab, RML, rechter gedeelte van het mediane lob, SRL, superieure rechter laterale kwab, IRL, inferieure rechter laterale kwab.
Figuur 7. Ex vivo 50% leverresectie. een. Ligatie van de pedikel van de achterste caudate kwab. b. Ligatie van de pedikel van het linker deel van de mediaan kwab. c. de lever voor 50% resectie. d. de lever na 50% resectie.
Figuur 8. Ex vivo plastie van de suprahepatic vena cava. een. de lever wordt door klemmen beide randen van het membraan met de mug forceps. b. Blijf hechtingen met 7-0 polypropyleen zijn bevestigd aan beide hoeken.
Figuur 9. Schema van het transplantaat implantatie in de ontvanger rat. De reconstructie procedures worden uitgevoerd voor de supra-en infrahepatic vena cava (SHVC en IHVC) met een 7-0 doorlopende hechting, de poortader (PV) door een manchet techniek en de lever slagader (HA) en galwegen (BD) met een stent techniek.
Figuur 10. Ontvanger operatie tot het verwijderen van de natieve lever. een. Het abdomen wordt geopend door een incisie. b. het recht bijnier ader geligeerd. c. de natieve lever uitgesneden. Afkortingen worden toegelicht in figuur 2.
Figuur 11. Anastomose van de suprahepatic vena cava. a, b. de perifere vasculaire klem voor de suprahepatic vena cava is bevestigd in een klomp klei oliebasis. Het verblijf hechtingen op beide hoeken worden onderhouden met zachte tractie superiolaterally om de anastomose te verbreden. C. Continue intraluminale hechtdraad van de achterste rij aan de gang. D. Continue hechtdraad van de voorste rij in de vooruitgang.
Figuur 12. Reconstructie van de poortader. a, b. De mug tang vastzetten van de poortader wordt vastgesteld in de op olie gebaseerde klei en trok in de richting van de lever navel. cfr. Plaatsen van de manchet in de poortader.
Figuur 13. Reconstructie van de leverslagader. a, b. g> inbrengen van een stent in de ontvanger gemeenschappelijke leverslagader (CHA) bij de vertakking van de juiste leverslagader (PHA) en gastroduodenale slagader (GDA).
Figuur 14. Anastomose van de infrahepatic vena cava. een. Het verblijf hechtingen op beide hoeken. b. Continue hechtdraad van de achterste rij. c. Continue hechtdraad van de voorste rij. d. Reperfusie van de infrahepatic vena cava. Afkortingen worden toegelicht in figuur 2.
Figuur 15. Alle reconstructie procedures zijn voltooid. Afkortingen worden toegelicht in figuur 2.
"Figuur 16" src = "/ files/ftp_upload/4376/4376fig16.jpg" />
Figuur 16 Postoperatieve tijdsverloop van veranderingen in de alanine aminotransferase (ALT)-spiegels (n = 20, n = 5 op elk tijdstip).. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden met foutstaven die standaard afwijkingen geven. De ALT-niveaus een piek bij 24 uur (212,6 ± 67,9 IE / L) en vervolgens binnen de normale grenzen af op 168 uur (33,6 ± 6,8 IE / L).
Discussion
Het eerste model van rat OLT werd door Lee et al.. 9 in 1973, waarbij alle vaten zoals de leverslagader werden gereconstrueerd door een handgenaaide methode en de extracorporale portosystemische shunt werd gebruikt. Dit model was technisch ingewikkeld en moeilijk uit te voeren. Het volgende model was een zonder lever arteriële reconstructie en de extracorporale shunt, ontwikkeld door dezelfde auteurs 10 in 1975. Vervolgens in 1979, Kamada et al.. Introduceerde de manchet anastomose techniek voor het model zonder lever rearterialization 11. Met deze wijzigingen, OLT in ratten een vereenvoudiging verkorte anhepatische tijd ontvanger operaties en is op grote schaal gebruikt als een aanvaard experimenteel model.
Toch is er sprake van aanzienlijke controverse sinds die tijd over de betekenis van de lever arterialization in de rat OLT 8, omdat de arterialization was een veeleisende taak, maar did geen invloed op de overleving na transplantatie. Talrijke studies op de hepatische arterialization met diverse reconstructietechnieken gemeld 8, zoals een aorta segment naar aorta anastomose 3,9,17, een manchet anastomose techniek 18,19,20, een telescopische techniek 5, een stent techniek 13, 16 en een huls anastomose techniek 12,21-23. Hoewel de techniek voor rat OLT nog niet gestandaardiseerd heden is de arterialized model steeds meer voorkeur in termen van fysiologische superioriteit 8,12,13,14. Onder de hierboven genoemde technieken, werd een stent techniek die was eenvoudig en snel uit te voeren die door Lehmann et al.. 16 in 2005. De studie toonde goede resultaten: geen occlusie werd waargenomen in de gereconstrueerde leverslagader in 8 uur, 24 uur en 6 maanden na reperfusie. Daarom heeft deze techniek op hepatische arterialization.
We Performa de hand genaaid anastomose voor de wederopbouw van de SHVC en IHVC. Deze methode de anastomose plaats met optimale fysiologische omstandigheden, waardoor de verminderde incidentie van trombose 8 en het beste microchirurgie simulatie en training voor chirurgen. Bovendien kan de anastomose mogelijk zelfs korte stompen vaartuig. Wat de anastomose van IHVC is deze methode geen lange IHVC de graft kant in vergelijking met de manchet anastomose techniek. Wanneer derhalve de donor nierader wordt ontleed om het transplantaat IHVC lang te maken is deze werkwijze voor transplantatie van een kleine graft met een lange IHVC, zoals een 30% graft die bestaat uit rechter laterale en caudate lobben met een korte intrahepatic noodzakelijk vena cava zonder SHVC 2.
Met betrekking tot de technieken van leverresectie bij ratten, met verschillende methoden op heden zijn gemeld, de twee belangrijkste technieken zijn de klassieke massa ligatuur technieken het vat gerichte techniek 24. We voeren de klassieke techniek ligatuur 50% leverresectie 15, maar onder een chirurgische microscoop om de procedure fijner te maken en om beschadiging van de resterende lobben en structuren te vermijden.
We beschreven de representatieve resultaten van de ontvanger ratten in ons model, de ratten overleefde tijdens de 7-dagen durende observatieperiode zonder duidelijke complicaties. Het model kan worden aangepast voor verschillende doeleinden van experimenten door te kiezen voor de verschillende instellingen, zoals langdurig koude opslag, langdurige warme ischemie die donatie na hartdood omvat, en het gebruik van kleinere lever transplantaties of enten van experimentele modellen van leverschade of ziekten.
In onze ervaring, zijn er drie belangrijke factoren in de procedures die de overleving na transplantatie, de meest betrouwbare parameter voor de resultaten van de rat OLT kan van invloed zijn: de hoeveelheid bloedverlies, de bedrijfstijd, especiaal klemmen tijd van de poortader en IHVC, en de toereikendheid van de wederopbouw van elk vaartuig, wat kan leiden tot stenose, trombose, of bloeden. In een stage van dit model, kan het grootste deel van de mislukkingen waarschijnlijk gerelateerd aan deze factoren. In deze video artikel zullen we stap-voor-stap instructies voor de chirurgische procedures voor onze rat model van partiële OLT met een verminderde arteriële reconstructie. Terwijl een rat model van OLT is ingewikkeld en vereist geavanceerde microchirurgische vaardigheden, dit artikel biedt veel praktische informatie, die moet dienen als een goede gids voor de opleiding en het leren van dit model. Leren dit model efficiënt is vooral van belang voor het inkorten van de leerperiode, vermindering van het aantal dieren en de kosten die nodig zijn voor de praktijk, en later reproduceren betrouwbare resultaten bij experimenten. Dit is in lijn met de 3 V's concept (vervanging, vermindering en verfijning) van dierproeven, die door Russell en Burch gepostuleerd in1959 25.
Disclosures
We hebben geen conflicterende belangen te onthullen. De ratten worden ondergebracht onder specifieke-pathogeen-vrije omstandigheden volgens de richtlijnen van de Federatie voor Proefdierkunde Associations (FELASA). Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse federale wet betreffende de bescherming van dieren en "Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren" (National Institutes of Health publicatie nr. 86 tot 23, herzien 1985).
Acknowledgments
De auteurs danken Pascal Paschenda en Mareike Schulz voor hun technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Light source | Schott | KL1500LCD | |
| Cotton swabs | NOBA Verbandmittel | 974202 | |
| Gauze swabs (5x5 cm) | Fuhrmann | 10002 | |
| povidone-iodine solution | Mundipharma | 6108022.00.01 | |
| Oil-based clay | Debika corporation | 090148 | |
| TachoSil | Takeda Pharmaceuticals International GmbH | EU/1/04/277/001-004 | Applied to resected liver surface |
| Scalpel blade No. 11 | Pfm medical | 200130011 | Preparation of cuff and stents |
| 14-gauge catheter | B. Braun | 4268210S | Cuff for PV |
| 18-gauge catheter | B. Braun | 4268130S | Perfusion via PV |
| 24-gauge catheter | B. Braun | 4269071S | Stent for BD and HA |
| 4-0 silk suture | Resorba | H3F | Liver resection |
| 6-0 silk suture | Resorba | H1F | |
| 7-0 Prolene (polypropylene) suture | Ethicon | 8701H | SHVC and IHVC |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V304H | Abdominal closure |
| 5-ml syringe | Terumo | SS+T05ES1 | Back pillow |
| Heating pad | Thermo | 190 x 260 mm | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools Inc. | 18200-01 18200-02 18200-03 18200-12 |
|
| Cold water bath | Huber | 740.000X | Graft preservation |
| Bipolar forceps | Söring | MBC-200 | |
| Mosquito forceps | BONIMED | 451-476-03 | Two pairs used |
| Adson micro forceps | Dimeda | 10.176.12 | |
| Curved micro forceps | AESCULAP | FD281R | |
| Straight micro forceps | Bonimed | 451-476-03 | |
| Curved micro scissors | Medicon | 05.15.83 | |
| Straight micro scissors | AESCULAP | FD12 | Fine incision |
| Scissors | AESCULAP | BC211W | |
| Micro needle holder | AESCULAP | FD241R | Reconstruction |
| Mayor-Hegar Needle holder | Mizuho Ikakogyo | 06-798-00 | Abdominal closure |
| DeBakey Bulldog clamp (straight) | ULRICH | CV3054 | |
| DeBakey Bulldog clamp (curved) | CODMAN | 37-1062 | |
| Satinsky clamp | Mizuhoika | 09-230-24 | |
| Peripheral vascular clamp | Teleflex Medical | 353494 | Recipient SHVC |
| Micro vessel clamp (disposable) | AROSurgical Instruments Corporation | TKM-1-60 g | PV, graft IHVC, and recipient HA |
| Micro vessel clamp (metal) | Fine Science Tools Inc. | 18052-01 | Recipient IHVC |
| Lactated Ringer solution | Fresenius Kabi | 6150917.00.00 | |
| Normal saline solution | DeltaSelect | 1299.99.99 | |
| HTK solution | Dr. Franz Köhler Chemie GmbH | 31268.00.00 | Preservation solution |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | 500 IU before graft perfusion |
| 8.4% sodium bicarbonate | Fresenius Kabi | 4399.97.99 | 0.5 ml after reperfusion |
| 5% Glucose solution | B. Braun | 6714567.06.00 | 1.0 ml after reperfusion |
| Cefuroxim sodium | Fresenius Kabi | 38985.01.00 | Antibiotic, 16 mg/kg |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Painkiller, 0.1 mg/kg |
| Intensive Care Unit Cage | Brinsea Products Ltd. | Vetario S10 | Postoperative care |
References
- Puhl, G., et al. Low viscosity histidine-tryptophan-ketoglutarate graft flush improves subsequent extended cold storage in University of Wisconsin solution in an extracorporeal rat liver perfusion and rat liver transplantation model. Liver Transpl. 12, 1841-1849 (2006).
- Yagi, S., et al. Improved Preservation and Microcirculation with POLYSOL After Partial Liver Transplantation in Rats. J Surg Res. 167, e375-e383 (2011).
- Engemann, R., Ulrichs, K., Thiede, A., Muller-Ruchholtz, W., Hamelmann, H. Value of a physiological liver transplant model in rats. Induction of specific graft tolerance in a fully allogeneic strain combination. Transplantation. 33, 566-568 (1982).
- Sumimoto, R., Shinomiya, T., Yamaguchi, A. Influence of hepatic arterial blood flow in rats with liver transplants. Examination of donor liver-derived serum class I MHC antigen in rats with liver transplants with or without hepatic arterial reconstruction. Transplantation. 51, 1138-1139 (1991).
- Chaland, P., et al. Orthotopic liver transplantation with hepatic artery anastomoses. Hemodynamics and response to hemorrhage in conscious rats. Transplantation. 49, 675-678 (1990).
- Imamura, H., Rocheleau, B., Cote, J., Huet, P. M. Long-term consequence of rat orthotopic liver transplantation with and without hepatic arterial reconstruction: a clinical, pathological, and hemodynamic study. Hepatology. 26, 198-205 (1997).
- Zhong, Z., Theruvath, T. P., Currin, R. T., Waldmeier, P. C., Lemasters, J. J. NIM811, a mitochondrial permeability transition inhibitor, prevents mitochondrial depolarization in small-for-size rat liver grafts. Am. J. Transplant. 7, 1103-1111 (2007).
- Spiegel, H. U., Palmes, D. Surgical techniques of orthotopic rat liver transplantation. J. Invest. Surg. 11, 83-96 (1998).
- Lee, S., Charters, A. C., Chandler, J. G., Orloff, M. J. A technique for orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation. 16, 664-669 (1973).
- Lee, S., Charters, A. C. 3rd, Orloff, M. J. Simplified technic for orthotopic liver transplantation in the rat. Am. J. Surg. 130, 38-40 (1975).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Howden, B., Jablonski, P., Grossman, H., Marshall, V. C. The importance of the hepatic artery in rat liver transplantation. Transplantation. 47, 428-431 (1989).
- Gao, W., Lemasters, J. J., Thurman, R. G. Development of a new method for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation. Reduction of liver injury and improvement of surgical outcome by arterialization. Transplantation. 56, 19-24 (1993).
- Zhao, D., Zimmermann, A., Wheatley, A. M. Morphometry of the liver after liver transplantation in the rat: significance of an intact arterial supply. Hepatology. 17, 310-317 (1993).
- Omura, T., Ascher, N. L., Emond, J. C. Fifty-percent partial liver transplantation in the rat. Transplantation. 62, 292-293 (1996).
- Lehmann, T. G., Bunzendahl, H., Langrehr, J. M., Neuhaus, P. Arterial reconstruction in rat liver transplantation--development of a new tubing technique of the common hepatic artery. Transpl. Int. 18, 56-64 (2005).
- Reck, T., et al. Impact of arterialization on hepatic oxygen supply, tissue energy phosphates, and outcome after liver transplantation in the rat. Transplantation. 62, 582-587 (1996).
- Hasuike, Y., et al. A simple method for orthotopic liver transplantation with arterial reconstruction in rats. Transplantation. 45, 830-832 (1988).
- Steffen, R., Ferguson, D. M., Krom, R. A. A new method for orthotopic rat liver transplantation with arterial cuff anastomosis to the recipient common hepatic artery. Transplantation. 48, 166-168 (1989).
- Knoop, M., Bachmann, S., Keck, H., Steffen, R., Neuhaus, P. Experience with cuff rearterialization in 600 orthotopic liver grafts in the rat. Am. J. Surg. 167, 360-363 (1994).
- Hickman, R., Engelbrecht, G. H., Duminy, F. J. A technique for liver transplantation in the rat. Transplantation. 48, 1080 (1989).
- Liu, T., Freise, C. E., Ferrell, L., Ascher, N. L., Roberts, J. P. A modified vascular "sleeve" anastomosis for rearterialization in orthotopic liver transplantation in rats. Transplantation. 54, 179-180 (1992).
- Li, J., et al. Modified sleeve anastomosis for reconstruction of the hepatic artery in rat liver transplantation. Microsurgery. 22, 62-68 (2002).
- Martins, P. N., Theruvath, T. P., Neuhaus, P. Rodent models of partial hepatectomies. Liver Int. 28, 3-11 (2008).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co. Ltd. London. reprinted by UFAW (1992).
