Summary
証拠が蓄積され、その虚血プレコンディショニング（PC） - 脳の非損傷虚課題は - その後の損傷虚血への過渡保護を与える。我々はC57BL6 / Jマウスで一過性局所脳虚血（中大脳動脈閉塞、MCAOによって誘発）に早期に虚血耐性を（IT）を誘導するためのプレコンディショニング刺激として二国間の総頸動脈閉塞（BCCAO）を設立。
Abstract
証拠が蓄積され、その虚血プレコンディショニング - 脳への非損傷虚課題は - その後の損傷虚血への過渡保護を与える。我々はC57BL6 / Jマウスにおける一過局所脳虚血への早期虚血耐性を誘導するコンディショニング刺激として二国間の総頸動脈の動脈閉塞を確立しています。このビデオでは、我々はこの研究のために使用される方法のデモンストレーションを行います。
Introduction
虚血性脳卒中は、高い死亡率と莫大な社会経済的負担を1と疾患である。最近の数十年間を通して集中的な実験や臨床科学の努力にもかかわらず、急性虚血性脳卒中患者のための治療の選択肢は、2つは非常に限られたまま。それとは対照的に、先進国の高齢者の割合の増加は劇的に今後数十年間3で虚血性脳卒中患者の発生率と有病率が増加します。したがって、虚血性脳卒中患者における新たな治療戦略のための差し迫った必要性がある。
一つのアプローチは、有害な刺激に対処するために、脳の内因性の適応のメカニズムの更なる理解を得ることである。この脳由来神経も虚血プレコンディショニング（PC）または虚血耐性（IT）として知られており、脳に適用非損傷侵害刺激は、一時的な耐性を誘導する現象について説明しているその後の有害虚血4に対して。 IT早い、PC数時間後に数分以内に発生し、4を発生する数時間の待ち時間を必要とする、ITを遅らせ：ITは、2つの異なる時間ウィンドウで発生します。
これまでのところ、脳内のITの研究は、ITが遅れに焦点を当てている。ましては、ITの早期のメカニズムに知られています。本研究の目的は、適切なPCの刺激として、ITを遅らせ誘導する確立刺激誘導することで二国間の総頸動脈閉塞（BCCAO）を確立することである一過性局所脳虚血（中大脳動脈閉塞によって誘発される、MCAO）に対するITの早期C57BL6で/ Jマウス。
外科的処置（BCCAOとMCAO）の両方で、レーザードップラーフローメトリー（LDF）による脳血流のモニタリング（CBF）を行なった。
BCCAOを麻酔し、自発的に呼吸したマウスで行った。両方の総頸動脈（CCA）が暴露されたおよび60のために閉塞秒灌流の5分が続く。このBCCAO /再配列を2回繰り返した。手術後、マウスはすぐに回復し、機能障害の兆候を示さなかった。排除するために、上記のBCCAOプロトコルは、脳内の遅延細胞死には至らなかった、我々はBCCAO後TdTを媒介たdUTP-ビオチンニック末端標識（TUNEL）染色72時間（または偽手術）を実行した別のグループ。
MCAO 5-7げっ歯類では局所脳虚血の誘導のために広く確立されたモデルです。外科的処置は、標準操作手順（SOP）8を用いて行った。左CCAを露出させた後、シリコンで覆われたモノフィラメントことにより、前大脳動脈（ACA）までウィリスの円内に内頸動脈（ICA）を介して前進および遠位CCA、中大脳動脈の原点（に導入したMCA）が定義された期間のために閉塞していた。本研究では、我々通常、線条体及び大脳皮質の脳領域が関与するMCA領域における虚血性病変をもたらすMCAOの使用45分、。
我々の研究では、早期にITは、PCの刺激としてBCCAOを使用することの時間プロファイルを分析した。我々のデータは、BCCAO MCAOとの間の最適な時間遅延は、ITが30分であることを早期に誘導するために、示された。
このビデオでは、我々は両方の外科手術、 すなわち BCCAOとMCAOのデモンストレーションを行います。
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Protocol
この資料に記載されているすべての手順はLandesamtエリーゼのためにお大事にウントSoziales、ベルリン、ドイツのガイドラインおよび規制に準拠して行った。
プレ外科処置
1。モノフィラメントの調製
- 管腔内フィラメントを調製するための、8-0ナイロンモノフィラメント縫合糸を用い、13ミリメートルそれぞれの長さに切断した。
- モノフィラメントのコーティングについては、Xantopren M粘膜、（ヘレウスKulzer GmbH社、ハーナウ、ドイツ）は、活性剤溶液（ベーター、ユニバーサルプラス、ヘレウスKulzer GmbH社、ハーナウ、ドイツ）のドロップを追加することでアクティブに使用された。
- それは完全にそれで覆われていたまで、モノフィラメントをゆっくりシリコーンを通して引っ張られました。そうすることによって、モノフィラメントを均一にシリコーンで被覆される。活性化コーティング材料を迅速しっかりとドライになりますので、あまりにも長い間待っていることは避けてください。
- シリコーンは、固化を開始する前に、それは一枚の紙の上に引いて、フィラメントから過度のシリコーンを取り除くことをお勧めします。そうすることによって、シリコーン層は200μmの厚さに近似間引くことができる。
- シリコーンで覆われたモノフィラメントのベースは、それが一晩乾燥させるために、粘土に立ち往生した。
コメント：理想的には、唯一の滅菌又は少なくとも消毒モノフィラメントは、手術部位で無菌性を確保するために使用されるべきである。モノフィラメントの品質が9を悪化させる可能性があるので、実際には、手作りのモノフィラメントの滅菌または消毒は非常に困難である。従って、代わりに、市販の滅菌モノフィラメントを使用することが好ましいかもしれない。
2。手術器具のと動物の作製
- すべての外科用器具は、70％のエチルアルコール中に維持した。さらに、事前のそれぞれの新しい外科手術には、すべての手術器具は慎重に洗浄したndは70％エチルアルコールを用いて消毒する。
- 手術領域を徹底的に横断する前に、すべての動物において70％のエチルアルコールを使用して消毒した。消毒部位は完全に切開を行う前に乾燥させた。これはmicroabrasionsとその後の皮膚の炎症9の原因と毛皮の追加のクリッピングは実行されませんでした。
外科手術
3。 LDFプローブとLDFモニタリングの位置付け
- 麻酔導入のために、マウスをイソフルラン70％N 2 O、2.5％が気化器を使用して、30％の酸素からなるガス混合物に曝露した。麻酔を維持するため、イソフルラン濃度を1.5％に減少した。マウスは、外科手術全体マスクを呼吸を介して自発的に呼吸していた。
- 直腸温度プローブを挿入し、マウスは頭頂頭を露出する定位フレームに固定した。手術中に、マウスが上に載っていた37.0の一定のコア温度を確保するサーモスタット制御の加熱パッド、±0.5℃の矢状正中切開（約1センチメートルの長さ）は頭頂頭蓋骨を露出させて行った。
- 頭蓋骨の左側には、慎重に解剖され、光ファイバプローブは、瞬間接着剤を使用してブレグマから頭蓋骨2ミリメートル尾から5mm横に直接固定されました。その後、創傷縁部を注意深く脳低体温並びに感染症を回避するために適合させた。
- マウスは首の腹側を露出するために振り向いた。光ファイバプローブは、プローブ·アダプタ（;ヤルフェッ、スウェーデンマスタープローブ418-1、Perimed）を接続を介して、LDFデバイス（PeriFLUXシステム5000、Perimed、ヤルフェッ、スウェーデン）に接続した。
コメント：周りにマウスを回している間、光ファイバプローブは、それが頭蓋骨から途切れることを回避するために慎重に曲げなければならない。
- LDF装置は、ラップトップのCOMに接続したコンピューター。 LDF値の連続記録は、Windows用PeriSoft（バージョン2.50、ヤルフェッ、スウェーデン）を使用して開始された。 図1 BCCAO及び再灌流中10 LDF記録から得られた平均CBFコースを示しています。
4。二国間の総頚動脈閉塞
- 3.1で説明したように麻酔を維持した。マウスは、その裏面上に置いた。動物のしっぽや足を粘着テープを使って加熱パッドに固定した。サジタル腹側正中切開（〜1センチメートル長さ）を行なった。
- 両方の唾液腺を注意深く分離し、基本的なCCAのを視覚化するために動員された。
- 両方のCCAのは慎重にこれらの構造を損なうことなく、それぞれの迷走神経とそれに付随する静脈から分離した。迷走神経の操作は重要な心臓ARRの発生の可能性を秘めている副交感神経系の一時的または永続的な機能不全につながる可能性があるhythmiaあるいは不可逆的な心停止。したがって、迷走神経の任意の操作を回避するために重要である。緩い5-0絹縫合糸ループは、各CCAのまわりました。
- 小さなシリコンチューブ（直径2ミリメートル）はCCAと両側に絹縫合糸の間に挿入した。縫合糸が締められたときに、このチューブは、（ 図4）動脈壁の損傷を避けるためにCCA年代のスプリントとして使用した。
- 両方のCCAは、シルク縫合糸を締めて、一分間閉塞された。 LDF信号が基準信号の<10％に減少されただけのマウスは、研究に含まれていた。両方のCCAの再開後、5分再灌流期間が開始されました。 LDFによる完全な再灌流を確保しました。不完全な再灌流（CBF すなわち <90％の回収率ベースラインCBFと比較して）を持つ動物は除外した。 BCCAOの1分間再灌流の5分のシーケンスが合計BCCAO duratiのために二度繰り返した3分。 図1の上BCCAO再灌流時に10 LDF記録から得られた平均CBFコースを示しています。手順の中で、それは首が生理食塩水を用いたウェット巻き続けることをお勧めします。
- 最後の再灌流後、すべてのチューブと縫合糸と同様に頭蓋骨に取り付ける光ファイバプローブを除去し、傷を縫合されたとリドカイン軟膏（Xylocain 2％、アストラゼネカ社、ヴェーデル、ドイツ）がために、必要に応じて繰り返して傷に適用された鎮痛管理。
- 彼らは完全に意識を取り戻していたまで、マウスは予備加熱（30℃）の回収ボックス（MediHEAT.は株式会社ブラフ、カンブリア州、英国PecoServives）に移した。その後、マウスをその動物のケージに戻した。
5。中大脳動脈閉塞
- マウスは、直腸温度プローブを挿入し、マウスを頚部の腹側を露出させる加熱パッド上に配置された、再麻酔した。その後、彼らはワットEREはBCCAOのセクションで説明し固定した。
- 長い7-0絹縫合糸を使用して恒久的な合字は左近CCAを中心としましたし、スレッドを穏やか蚊クランプ（ 図4）を用いて尾側に引っ張られました。
- もう永久リガチャーは左外頚動脈（ECA）とスレッドが（ 図4）動物の右側の方に引っ張られたのまわりました。
- 左ICA周囲の結合組織を注意深く動員され、舌下神経を穏やかにICAの遠もちろん良い概要を取得するために解除された。左に左のICA曲がる翼口蓋動脈（PPA）は右側（ 図4）の近位ICAのコースを次ながら。
コメント：尾方向に右折した識別される別の動脈があります。これは可変CCAの分岐から、またはPRのいずれかから発信さ後頭動脈であり、ECAのoximal一部（ 図4）。
- 緩い縫合糸ループを5-0絹糸を使用して、近位ICAのまわりました。
- 小さ な微小血管クランプを使用して、ICAを一時的に5-0ルーズ縫合糸ループ（ 図4）に対して遠位に閉塞した。
- 小切開だけ微小血管はさみ（ 図4）を使用して、CCAの分岐前にCCAの遠位部で行われました。
- 予め選択されたシリコーンで覆われたモノフィラメントは、小さな切開部を介してCCA内に導入し、微小血管クランプ（ 図4）で停止するまで、ICAに押し込まれた。
- それは（ 図4）停止するまでモノフィラメントがICAに深く進められつつmicroclampは慎重、ICAから削除されました。コメント：あなたは、ペンのようにそれを保持しないように、この時点では、左手で鉗子を反転。これにより、より簡単に鉗子でフィラメントをつかむのに役立ちます。血管クランプアプリケータは右手で開催されるべきである。それはほぼ切開側からの出血を防ぐために、ICAの周りに緩い5-0縫合糸を締めなければならない場合があります。
- モノフィラメント先端の正確な位置は、それがICAにはなくPPAに進出されたかどうかをチェックするために同定された。モノフィラメントの先端が近位PPAに導入した場合、フィラメントは優しくICA / PPA分岐直前に引き戻されました。そっと右側に近ICA少し引きながらそれは、再びICAにモノフィラメントを進めることを試みた。そうすることによって、遠位ICAの自然経過は、簡単にICAにアクセスすることをシミュレートした。
- モノフィラメントがほぼ完全にICAに進入した後、近位ICA周りルーズ5-0縫合糸ループを適所にフィラメントを保持するために締め付けられた。その後、すべての絹糸が短縮され、皮膚の傷を縫合した。
- 手術中の流体損失replenたそれは完全な意識を取り戻しまで、その後、生理食塩水の腹腔1.0mlを注入することによってished、マウスは予熱された回収ボックスに移した。
- 再灌流のために、マウスは再麻酔し、モノフィラメントは慎重に近ICAの周りに5-0絹縫合糸を緩めた後、削除されました。その後、5-0縫合糸は、出血を防ぐために慎重に再び締めした。
- 完全な止血を確認した後、首の傷口を縫合した。
- 痛みの軽減の必要に応じて、リドカイン軟膏を繰り返し皮膚に局所的に適用し、それを完全に意識を取り戻した回収ボックスまで、マウスを予備加熱（30℃）に移した。
- 成功MCAO手続きのための最初のヒントとして、動物の旋回回りを観察した。機能障害の重症度をマウス10用に変更Bedersonスコアを用いて定量した。この修正Bedersonスコアによると、神経学的スコアは我々0（正常な運動機能）、1（マウスは尾によって解除された胴体と対側前肢の屈曲）、2（マウスを平らな面に尾で開催されたときに反対側に旋回が、通常次のように等級を再安静時の姿勢）、3（安静時の反対側に傾いて）、および4（無自発運動活性または死んだ）。
6。 BCCAO偽手術
BCCAO偽手順については、マウスは、唾液腺が動員されたとCCAのが暴露された、本物のBCCAO PCの手続きの期間麻酔した。それは頸動脈や迷走神経への直接操作は偽の手順の間に避けられることが重要です。 CCAの操作は、内皮細胞から血管作動性化合物の放出につながるまたは動脈内腔の中に地元の血栓症を誘発することができ、その内皮層を損傷する可能性があります。その結果、血栓塞栓症は、偽手術後に発生することがあります。これは、番目の主要な交絡因子となる電子手続き。一方、迷走神経の操作はかなりの不整脈、あるいは不可逆的な心停止の発生の可能性を秘めている副交感神経系の一時的または永続的な機能不全につながる可能性があります。したがって、BCCAO中に迷走神経の任意の操作を回避するために重要である。
手術後
7。音量測定の梗塞
梗塞の大きさの評価のために、マウスはMCAO後72時間生存した。その後動物は深く麻酔し、脳を除去し、梗塞体積測定用ヘマトキシリン（Papanicolauのプロトコルを使用して）と、メチルブタンでスナップ凍結切片や染色した。脳切片を、画像解析装置（MCIDコア7.0 Rev.2.0に、GEヘルスケアナイアガラ社）を用いて決定し、Lin らの方法に従って浮腫について補正した600μmの間隔で梗塞容積で収集した。7,11
8。試験対象患者基準
我々は3つのBCCAOエピソードの各々の間に90％以上でLDF-測定CBFの減少を持っていた唯一の動物が含まれていた。理想的には、LDFの監視はBCCAO中の両方大脳半球で実行する必要があります。実用性のために、我々は、後でMCAOにさらされる左半球でLDFの監視を行った。このアプローチは、6,12前に記載されている。各BCCAOエピソード後の再灌流は、（ベースライン値にすなわち復帰）完了する必要がありました。持続マウスを麻酔下に保持された時間を低減する理由から、我々は、MCAO手術の際CBFを監視していなかった。しかし動物の別のグループでのパイロット研究では、MCAOの手術中LDFによるCBFを監視した。マウスのこのグループでは、一貫してCCA閉塞前のベースラインと比較して90％によってCBFの減少を測定した。さらに、モノフィラメントCBFを除去した後、それぞれの> 90％にまで回復したCCA閉塞後の基準値。これらLDF基準は一貫梗塞ボリューム7文学と結果には確立されている。我々は唯一のMCAO後に麻酔から回復した後、少なくとも1のBedersonスコアを持っていた動物が含まれていた。さらに、MCAO、どれが頭蓋内出血の兆候を示さなかった後72時間生存した唯一の動物が研究に含まれていた。
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Representative Results
両方のCCAのが（ 図1）閉塞されたときに我々のBCCAOプロトコルが（> 90％）即時かつ深遠CBFの削減となりました。 CCAの再開は、LDF（ 図1）によって監視として再灌流を完了するために導いている。 PC後、動物は、機能障害の兆候を示さなかった。さらに、死亡率がありませんでした。 TUNEL染色、動物の別のグループにBCCAO後72時間を行ったがBCCAO（データは示されていない）した後に脳内で遅延された細胞死の兆候を示さなかった。
IT（ 図2）のための早期のBCCAO MCAOとの間の最適な時間遅延の時間的プロフィールを分析する際には、シャム群（n = 10）と比較して梗塞容積の有意な減少（65％、nは10による還元）を発見BCCAO 30分MCAO前に実行されたとき。 BCCAOがMCAO（nは= 10）の前に2時間と24時間を行った場合さらに、梗塞のボリュームが減少した。 24時間は、IT 6の第2（遅延）時間ウィンドウを表します。 >
したがって、初期のITは、PCの刺激としてBCCAOを使用するための最適なタイムウィンドウが一時的局所脳虚血（MCAO）の誘導の30分前であると結論付けることができる。
図1。 BCCAOと再灌流（N = 10）の間にLDFによって測定された平均CBF値のコース。
図2。 BCCAO N = 10/group後MCAOの異なる時間遅延での梗塞体積の時間プロファイルは、グラフが表示され、平均値±標準偏差、偽から* P <0.05、偽から** P <0.01（一方向ANOVAとボンフェローニのPOSTHOCテスト）。
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図3。 BCCAO -前処理（）とBCCAO /偽の後に45分MCAO 30分にかけた偽手術動物（B）、由来代表ヘマトキシリン染色脳切片。脳はMCAO後72時間を削除し、処理した。
図4。 BCCAOとMCAOに対して実行手順を含め、左頸動脈の血管解剖のスキーム。
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Discussion
我々の研究では、BCCAOの3つのシーケンスは、それぞれ1分間持続し、5分間の再灌流に続いて、IT早いを誘導するのに十分な虚血PCの刺激であることが示されている。
さらに、我々は、使用される前処理プロトコルは、特筆すべき術後合併症、脳、無死亡におけるアポトーシスの徴候で安全とマイナー侵襲的な処置であることを実証した。いくつかの異なった前処理プロトコルがすでに6-7,12記載されている。その他プレコンディショニング刺激13-14としてBCCAOの6分を使用している。しかし、3回BCCAOの1分検出可能な虚血性脳損傷せずにITの早期時間ウィンドウ内の保護効果をもたらしたという事実のために、我々は、このプロトコルを使用することを決めた。
一貫した結果、麻酔および外科手術の期間と同様に、動物の重み、脳の温度などの他の変数のために手術中、術後流体補充、術後疼痛管理と同様に、前と術後ケージ濃縮は15標準化されるべきである。低体温自体がプレコンディショニング効果を持つため、BCCAO効果16と干渉することができるので、特に注意が麻酔の完全期間を通して、マウスの正常体温の条件のメンテナンスを必要とします。目を覚まして、自由に移動するげっ歯類では、コア温度は、ほぼ対応する脳の温度が17より高い摂氏0.5〜1程度である。目を覚まして、自由に移動するげっ歯類で休んで脳の温度は18摂氏約36.5度である。我々は我々の実験では、脳の温度を測定しなかったので、37.0にマウス 'コア温度を調整±0.5度、上記の安静時の脳の温度が似ている脳の温度を達成する摂氏。
理論的には、揮発性麻酔薬のそれを使用それはイソフルラン自体がITを誘導できることが実証されているため、自己は、追加の交絡因子とすることができる。しかし、イソフルラン麻酔は現在の研究19-21で説明する手順ではそうではありませんでした数時間のために繰り返し投与した場合にのみ関係PC刺激になります。さらに、我々はまた、イソフルラン麻酔の潜在的な交絡効果を制御するために偽手術動物を分析した。
MCAOの誘導に使用されるモノフィラメントのサイズおよび形状は重要な役割を果たしている。鈍いフィラメント22を加熱するために比べて均等にシリコーンフィラメントはMCAOの成功率を改善し、そのようなくも膜下出血などの合併症の速度を低下させるので、好ましい被覆されるべきである。別の重要なポイントは、フィラメントの長さである。 9〜11ミリメートルの間の最適なフィラメントの長さは15に報告されている。我々の切開がCCA分岐部の近位に行われたという事実のために、我々は、モノフィラメントがlenを使用し13ミリメートル、約200μmの厚さのGTH。
一緒になって、モノフィラメントのコーティングとその長さのタイプと品質がMCAの十分な閉塞を確実にするためにと前交通動脈を介した重要なクロスフローを避けるために重要です。かなりの梗塞体積の不要な減少でウィリス結果のサークルの右側からクロスフロー、それによって結果が23のばらつきが増加します。さらに結果のばらつきを低減するために意図して、追加の手続き標準化は、LDFベースCBFのMCAO中のモニタリングおよび再灌流、市販の工業製、標準化されたモノフィラメントの使用を含む。市販のモノフィラメントを用いて、それらの無菌性を確保することができる。
さらに、BCCAOまたはMCAO中に> 90％CBFの減少を持っていない、または動脈の再開百鬼夜行後> 90％再灌流を持たない動物LDは研究から除外される。このアプローチは、さらに主に大脳側副血行路における共通の変異の結果として起こる梗塞量のばらつきを低減するのに役立ちます。
要約すると、BCCAOは早いと遅延時間窓におけるITの効果を調査するために設立され、容易に適用可能なモデルです。 ITの現象を研究することは、脳内の内因性の保護のメカニズムの理解を深めるのに役立ちます。観点では、これは急性虚血性脳卒中患者に対する代替治療の機会を開発するために役立つ可能性があります。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Light source for microscope | Zeiss | SteREO CL 1500 ECO | |
| Heating pad with rectal probe | FST | 21061-10 | |
| Stereotactic frame | David Kopf | Model 930 | |
| Scissors | FST | 91460-11 | |
| Dumont forceps #5 | FST | 11251-10 | |
| Dumont forceps #7 | FST | 11271-30 | |
| Mircovascular clamp | FST | 00398-02 | |
| Clamp applicator | FST | 00072-14 | |
| Springscissors | FST | 15372-62 | |
| Needle holder | FST | 12010-14 | |
| Needles | Feuerstein, Suprama | BER 562-20 | |
| 5-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | ||
| 7-0 silk suture | Feuerstein,Suprama | ||
| 8-0 silk suture | Feuerstein, Suprama |
References
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