Summary
Eine Methode, um submitochondrialen Vesikel in F1FO ATP-Synthase-Komplexe aus Rattenhirn angereichert isolieren beschrieben. Diese Vesikel erlauben das Studium der Aktivität von F1FO ATPase-Komplex und dessen Modulation unter Verwendung der Technik der Patch-Clamp-Aufnahme.
Abstract
Mitochondrien sind in vielen wichtigen zellulären Funktionen wie Stoffwechsel, Überleben 1, Entwicklung und Calcium-Signalgebung 2 beteiligt. Zwei der wichtigsten mitochondrialen Funktionen sind auf die effiziente Produktion von ATP, die Energie Währung der Zelle, die durch oxidative Phosphorylierung und die Vermittlung von Signalen für den programmierten Zelltod 3 bezogen.
Das Enzym in erster Linie verantwortlich für die Produktion von ATP ist die F1FO-ATP-Synthase, auch als ATP-Synthase 4-5. In den letzten Jahren hat sich die Rolle der Mitochondrien in apoptotischen und nekrotischen Zelltod erhebliche Aufmerksamkeit erhalten. In apoptotischen Zelltod, geben Bcl-2-Proteine wie Bax äußeren Mitochondrienmembran, Oligomerisierung und Permeabilisierung der äußeren Membran, die Freigabe pro-apoptotische Faktoren in das Cytosol 6. In der klassischen nekrotischen Zelltod, wie die durch Ischämie oder Exzitotoxizität in Neuronen eine größ produzierte, schlecht reguliert Erhöhung Matrix Calcium trägt zur Öffnung der inneren Membran Poren, die mitochondriale Permeabilität Übergang Pore oder mPTP. Diese depolarisiert die innere Membran und verursacht osmotischen Verschiebungen, einen Beitrag zur äußeren Membran Ruptur, die Freisetzung von pro-apoptotischen Faktoren und Stoffwechselstörungen. Viele Proteine einschließlich Bcl-xL 7 interagieren F1FO ATP-Synthase, stetig seine Funktion. Bcl-xL interagiert direkt mit der beta-Untereinheit der ATP-Synthase F1FO, und diese Interaktion vermindert ein Leck Leitwert innerhalb der F1FOATPasecomplex, die Erhöhung der Netto-Transport von H + durch F1FO während F1FO ATPase Aktivität 8 und wodurch mitochondrialen Effizienz. Um die Aktivität und Modulation der ATP-Synthase studieren isolierten wir aus Nagergehirn submitochondrialen Vesikel (SMVS) enthält F1FO ATPase. Die SMVS behalten die strukturelle und funktionelle Integrität des F1FO ATPase nach Alavian et al. Hier beschreiben wir eine Methodedass wir erfolgreich für die Isolierung von SMVS aus Rattenhirn verwendet und wir Abgrenzung der Patch-Clamp-Technik, um Kanal-Aktivität zu analysieren (ion Leck Leitwert) der SMVS.
Protocol
1. Mitochondrien-Isolation (Angepasst von Braun MR et al. 9)
- Sacrifice die Ratte unter Verwendung von Methoden der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen.
- Schneiden Sie den Kopf des Tieres durch Enthauptung, schneiden Sie die Haut und setzen den Schädel.
- Öffnen Sie den Schädel sanft durch Schneiden mit einer Schere oder Zange. Entfernen Sie das Gehirn.
- Mince fein das Gehirn ohne Kleinhirn in Isolation Buffer (siehe Tabelle 1) und überträgt es auf eine 5-ml-Glas / Teflon-Homogenisator (siehe Geräteliste).
- Homogenisieren Gewebe sanft 10 mal (keine Blasen), ca. 5 min.
- Zentrifuge Probe bei 1.500 × g für 10 min bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge.
- Speichern Sie den Überstand (Mitochondrien und Synaptosome) und entsorgen Sie die Pellet (Kernmaterial und Zelltrümmer). Zentrifuge bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge.
- VerwerfenÜberstand und resuspendieren Pellet in 500 ul Isolation Buffer. Stören Synaptosome mit einem Zellaufschluss Schiffes (siehe Geräteliste). Anwenden eines Druck von 1200 psi für 10 min, gefolgt von schnellen Dekompression.
- Schicht der Mischung auf Ficoll-Gradienten (siehe Tabelle 2), in SW-50.1 Rotor und Zentrifuge bei 126.500 × g für 20 min bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge (siehe Geräteliste). Das Pellet wird das gereinigte Mitochondrien, ist die Ebene zwischen den unterschiedlichen Dichten von Ficoll ungestörten Synaptosomen.
- Waschen Pellet durch Zentrifugation in Isolation Puffer bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge.
2. Submitochondrialen Vesikel (SMV) Isolation (Angepasst von Chan et al. 10)
- Re-suspend in 200 ul Isolation Buffer mit einem gleichen Volumen von 1% Digitonin kombiniert Mitochondrien und damit auf Eis für 15 min sitzen.
- Fügen Sie mehr Isolation Buffer und Zentrifuge bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge. Tun Sie dies zweimal.
- Re-suspend Pellet in 200 ul Isolation Buffer und fügen 2 ul 10% Lubrol PX (C12E9). Mische und lasse auf Eis für 15 min sitzen.
- Layer-Mischung auf Isolation Buffer, in SW-50.1 Rotor und Zentrifuge bei 182.000 × g bei 4 ° C für 1 Stunde.
- Waschen Endpellet durch Zentrifugieren in einer Tischzentrifuge in Isolation Puffer bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C.
3. Elektrophysiologische Recording
- Eine typische Elektrophysiologie rig einen Verstärker, einen PC mit einer Digidata 1440A Analog-zu-Digital-Wandler-Schnittstelle in Verbindung mit pClamp10.0 Software Manipulatoren, ein Mikroskop, eine Schwingungsisolation Tabelle Faraday-Käfig ausgestattet.
- Borosilikatglas Kapillaren werden in einem Flaming / Brown Feinpipettenziehvorrichtung Modell P-87 eingesetzt. Eine Pipette-Abzieher Programm wird optimierterzeugen Pipetten mit Widerständen zwischen 80 bis 100 MOhm.
- SMVS in einer physiologischen intrazellulären Lösung (ATP wird zu einem geeigneten Zeitpunkt während der Aufzeichnung hinzugefügt) (Tabelle 3) angeordnet ist. Patch-Clamp-Pipetten mit der gleichen Lösung (ohne ATP) gefüllt. Aufnahmen werden durch Bildung eines Giga-Ohm-Dichtung auf SMVS bei Raumtemperatur durchgeführt. Vesikel werden visualisiert durch Phasenkontrast-Mikroskopie mit einer Nikon oder Zeiss inversen Mikroskop.
- Das Membranpotential bei Spannungen im Bereich von -100 mV bis +100 mV für die Dauer von 10 Sekunden aufrechterhalten. Aufnahmen werden bei 5 kHz über die Verstärkerschaltung filtriert. Niveau von streunenden elektrische oder unspezifische Rauschen von weniger als 1 pA sind wünschenswert für eine erfolgreiche Aufnahme.
- Die Daten werden mit 10,0 Clampfit Software beispielsweise in Frequenz und Amplitude der Einkanal Ereignisse zu bestimmen analysiert. Spannung Abhängigkeit wird durch Auftragen einer Strom-Spannungs-Beziehung bestimmt.
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Representative Results
Der erste Schritt der Protokoll ermöglicht für die Isolierung von Mitochondrien gereinigt, wie durch Western-Blot in Fig. 1 gezeigt. In Abbildung 2 ist ein Beispiel für einen brain-derived submitochondrialen Vesikel Patch Aufnahme gezeigt. Mit der inside-out Patch Konfiguration zeigen wir Kanalaktivität moduliert durch ATP. Die Steuerung (CTL) die Aufnahme (links) zeigt Multi-Kanal-Aktivität Leitfähigkeit mit einem Spitzenwert Leitfähigkeit von 600 pS im Durchschnitt. das wurde unmittelbar nach der Zugabe von 1 mM ATP in das Bad reduziert. Die Gesamtwirkung des ATP ist es, die Leitfähigkeit der SMVS Patches in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise zu verringern. Um die Effizienz der F1FO ATPase Messung nach der Isolierung, maßen wir die Bewegung der H +-Ionen in die SMVS in Antwort auf ATP-Hydrolyse, wie in 3 gezeigt, die Messung der Abnahme der Fluoreszenzintensität des SMV-ausgenommen H +-Indikator ACMA. ATP-sensitive H +-Ionen-Sequestrierung in SMVS nach verbessert hinzufügenition von ATP. Dieser Test kann verwendet werden, um die Effizienz der H +-Ionen Sequestrierung messen. Weniger effizient SMVS wird H +-Ionen langsamer oder auf einen kleineren Spitzenwert ansammeln. Zum Beispiel H +-Ionen Sequestrierung gedämpft durch die Zugabe von Bcl-xL-Inhibitoren und FCCP (Alavian et al., 2011).
| Endkonzentration | |
| Saccharose | 250 mm |
| Hepes | 20 mm |
| EDTA | 1 mm |
| BSA | 0,5% |
Tabelle 1. Isolation Buffer.
| Ficoll | 22 ml 20%> |
| Saccharose | 12 ml 1 M |
| EDTA | 18,75 ul 0,1 M |
| Tris-HCl | 375 ul 1 M (pH 7,4) |
| Top Layer 7,5% Ficoll | |
| Ficoll Lager | 10 ml |
| Isolation Buffer | 6 ml |
| Untere Schicht 10% Ficoll | |
| Ficoll Lager | 15,5 ml |
| Isolation Buffer | 2,5 ml |
Tabelle 2. Ficoll Lager.
| KCl | 120 mM |
| NaCl | 8 mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| Hepes | 10 mM |
| pH | 7.3 |
Tabelle 3. Interne Solution.
Abbildung 1. Repräsentative Immunoblot Lysat von Cytosol und Mitochondrien gereinigt. Das obere Feld zeigt einen Immunoblot unter Verwendung eines Antikörpers gegen den cytosolischen Protein Gapdh. Das untere Feld zeigt einen Immunoblot unter Verwendung eines Antikörpers gegen das mitochondriale innner Membranprotein CoxIV.
Abbildung 2. Zwei repräsentative Patch-Clamp-Aufnahme vor und nach Zugabe von 1 mM ATP. Halten Potential +70 mV. Die gestrichelte Linie stellt 0 pA. Jede Spur wird für 10 sec aufgezeichnet und es gibt 10 sec zwischen Spuren.
Abbildung 3. Beispiel Spuren Fluoreszenzintensität vondie ACMA Anzeige der Zeit in der Gegenwart von SMVS und in Abwesenheit (schwarze Kreise) und in Gegenwart (rote Linie) von ATP.
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Discussion
Die hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen die Gewinnung von reinem Mitochondrien am Ende von Schritt 1 und submitochondrialen Vesikel (SMVS) nach Schritt 2 aus ganzen Gehirn ohne Unterschied der Zelle durch dieses Verfahren phenotypes.SMVspurified im wesentlichen frei von Verunreinigung durch andere subzelluläre Organellen, wie in Abbildung 1 und unserer bisherigen Arbeit (Alavian KN et al. 8) und behalten ihre strukturelle und funktionelle Integrität vor dem Einfrieren. Nach Einfrieren und Auftauen, isoliert Mitochondrien oder SMVS für Aufnahmen und biochemische Assays verwendet, aber nicht für Atemwegs-Studien.
Diese Methode kann darüber hinaus zur Isolierung von Mitochondrien Leber mit denselben Schritten werden. Da die Mitochondrien und SMVS um Cluster zu bilden, wenn sie in der elektrophysiologischen Aufnahme Kammer ausplattiert neigen, Aufmerksamkeit sollte dem Laden der Probe gegeben werden, da eine übermäßige Verklumpung oder übermäßige Verdünnung kann verringern die Möglichkeitenty von Dichtung Bildung. Darüber hinaus sollte die Aufmerksamkeit auf einige technische Details, bevor die Isolation gegeben werden. Es ist wichtig, saubere Werkzeuge zu verwenden und diese auf Eis zu halten. Alle Verfahren sollten auf Eis durchgeführt werden und alle Zentrifugen auf 4 ° C. Vorbereiten des Ficollgradienten richtig ist entscheidend für eine erfolgreiche Experiment. Erstellen einer perfekten Trennung zwischen den beiden Konzentrationen von Ficoll erhöht die Reinheit der subzellulären Fraktionen.
Eine Einschränkung dieser Technik wird durch die endgültige Menge an Protein, die klein sein kann, wenn Probe aus einer bestimmten Region des Gehirns zum Beispiel Mitochondrien aus Substantia nigra pars compacta oder Striatum gewünscht wird verhängt. Pooling Proben von mehreren Tieren kann notwendig sein, die Gesamtmenge an Protein geerntet verbessern.
Mitochondrien oder SMVS bei 1 mg / ml aliquotiert und bei -80 ° C und sie stabil sind für Aufnahmen für mehrere Monate, aber es ist preferable nicht wieder einfrieren die mitochondriale Probe nach dem Auftauen. Vesikel durch dieses Verfahren gereinigt sind nützlich, um die ATP-Synthase zu studieren, mit unterschiedlichen Ansätzen wie Patch-Clamp-Aufzeichnung, biochemische Techniken und andere funktionelle Studien. Mit dieser Vorbereitung kann man analysieren die Auswirkungen von Medikamenten oder kleinen Molekülen auf F1FO ATPase-Aktivität und Struktur.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
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