Summary
エピトープ特異的T細胞の低周波の集団を区別し、フローサイトメトリーによって、それらを分析するためのMHCテトラマーと磁性マイクロビーズ：このプロトコルは、ペプチドの使用について説明します。この方法は、から対象の内因性T細胞集団の直接調査を可能に
Abstract
in vivo実験モデルでと適応免疫を勉強研究者のための基本的な必要性は、それらのT細胞抗原受容体（TCR）の特異性に基づいてT細胞を識別する能力である。 T細胞のバルク集団が特定の抗原およびエピトープ特異的T細胞をin vitro で刺激されている多くの間接的な方法が利用可能です、増殖、サイトカイン産生や活性化マーカー1の発現などの機能的応答の測定によって識別されます。しかし、これらの方法では、唯一の多くの可能な機能の一つを示すエピトープ特異的T細胞を同定し、そして、彼らは素朴な前駆周波数でエピトープ特異的T細胞を検出するのに十分な小文字は区別されません。人気のある選択肢は、TCRトランスジェニック養子移入モデルであるTCRトランスジェニックマウス由来モノクローナルT細胞はEASIできるエピトープ特異的T細胞の大前駆体細胞集団を作成するために組織適合ホストに播種するLyはコンジェニックマーカー抗体2,3の使用で追跡。パワフルながら、この方法では、4,5の単一エピトープに対して特異性を有するT細胞の非生理的な周波数に関連付けられている実験的な成果物に苦しんでいる。また、本システムは、ポリクローナル集団内のエピトープ特異的T細胞クローンの機能的な異質性を調査するために使用することはできません。
MHC（pMHC複合）錯体：適応免疫を研究するための理想的な方法は、単にその同族ペプチドに結合することにより、TCRの特異性を区別する方法を用いて内因性のT細胞レパートリーからのエピトープ特異的T細胞の直接検出を関与させるべきである。 pMHC複合テトラマーおよびフローサイトメトリーの使用は、この6を達成しますが、のみ、次の抗原誘発クローン増殖を発見したエピトープ特異的T細胞の高頻度の個体群の検出に限定されています。このプロトコルでは、pMHC複合テトラマーの使用を調整する方法を説明し、マグネチック細胞濃縮技術は、マウスリンパ組織3,7から超低周波エピトープ特異的T細胞の検出を可能にします。この手法では、1は、包括的に免疫応答の全ての段階で、マウスにおける内因性T細胞の全体のエピトープ特異的集団を追跡することができます。
Protocol
1。リンパ組織からの細胞の単離
- の小さな正方形を含む60mmの培養皿に、氷冷cEHAA（EHAA +10％FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、2mM L-グルタミン、55 mM 2 - メルカプトエタノール）または他の同等のT細胞培地1mlを追加氷の上に100μmのナイロンメッシュと場所。
- マウスを安楽死させる。
- 脾臓、できるだけ多くの簡単にアクセスできるリンパ節を切除する。これらは少なくとも鼠径部、腋窩、上腕、頸部、および腸間膜リンパ節を含める必要があります。培養皿にナイロンメッシュの上に置きます。
- ナイロンメッシュ上のリンパ組織はリンパ球を解放するために、閉じた1.5 mlのマイクロチューブのフラットトップを使って、 優しくマッシュ。懸濁液中に細胞を動作するように上下cEHAAとピペットの別の1ミリリットルを追加します。 15 mlのポリプロピレン製遠心分離管の上に配置されたナイロンメッシュの別の部分を介して細胞を移す。氷冷cEHAA、POの別の1ミリリットルと皿とメッシュをすすぐ同じチューブにボリュームをoling。 4ミリリットルの最終細胞懸濁液の容積を達成するために繰り返します。
- 15ミリリットルの最終容量に冷たいソーター酸緩衝液（PBS + 2％FBS、0.05％アジ化ナトリウム）を追加し、300×gで5分間遠心分離管を、4℃
- 慎重に液体が滴がチューブの両側に残っていないことを確認し、上清を吸引除去する。約2倍のペレット自体のそれに等しい最終容量へのFcブロック（ソーターバッファ+ 2.4G2抗体）で細胞ペレットを再懸濁します。例えば、ナイーブマウスの脾臓およびリンパ節は通常、約100μlの細胞ペレットを生成します。この場合は、200μlにボリュームを持って来るためのFcブロックの100μlを添加する。細胞凝集度が大きいが発生した場合は、ピペットチップを用いて、この時点で細胞塊を除去します。
2。四量体染色
- 10 NM（または経験的に最適化された濃度）の最終濃度にPEまたはAPC標識pMHC複合テトラマーを追加します。
- ミックスとインキュベーション室温で1時間TE（または経験的に最適化された時間と温度）。
- 15ミリリットルの容積に冷たいソーター·バッファを追加し、300×gで、4℃で5分間、チューブを遠心氷の上または°C今から4でサンプルを保管してください。
- 慎重に液体が滴がチューブの両側に残っていないことを確認し、上清を吸引除去する。 200μlの最終容量にソーター·バッファ内の細胞ペレットを再懸濁します。二量体の濃縮は、150μlの最終容量に再懸濁します。
3。磁気濃縮
- ミルテニー抗PEまたは抗APCマイクロビーズの50μlを添加する。二量体の濃縮のために、両方の50μlを添加する。
- 4で混ぜ合わせ、20分間インキュベート℃、
- 15ミリリットルの容積に冷たいソーター·バッファを追加し、300×gで、4℃で5分間、チューブを遠心
- 待っている間、またはMidiMACS QuadroMACS磁石にミルテニーLSの磁気カラムを設定します。上の開いている15mlのポリプロピレン遠心管を置き列の真下ラック。
- それは15 mlのチューブに排出できるように、列の先頭にソーター緩衝液3mlを加える。
- 列の上に100μmのナイロンメッシュ正方形を置きます。
- 細胞が回転し終わったら、慎重に上清を吸引し、ソーター緩衝液3mlでペレットを再懸濁します。
- カラムの上にナイロンメッシュを介して細胞懸濁液を移す。
- 細胞懸濁液が完全にカラムに排水されている場合、プロセス内でメッシュをすすぎ、ソータバッファの別の3mlでオリジナルのチューブを洗浄し、カラムにナイロンメッシュを介してバッファを転送します。ナイロンメッシュを破棄します。
- バッファが完全にカラムに排水している場合、その列にソーター·バッファの別の3ミリリットルを追加します。
- 3×3 mlの洗浄の合計に対して、ステップ10を繰り返します。
- 新しい15 mlのポリプロピレン製遠心管を介して磁石と場所からカラムを取り外します。
- tにソーター緩衝液5mlを追加彼列。
- すぐに列の上部にプランジャーを挿入し、一つの連続した動きで、チューブにカラムOUTバッファを強制的に、プランジャーのすべての方法を下に押します。
- 300×gで5分間溶出結合画分およびフロースルー非結合画分、4℃を含むチューブを遠心
- 慎重に液体が滴がチューブの両側に残っていないことを確認しながら、結合画分から上清を吸引除去する。正確に95μlの最終容量にソーター·バッファ内の細胞ペレットを再懸濁します。 2ミリリットルの最終容量に非結合画分を吸引除去し、再懸濁します。
4。フローサイトメトリー
- 各画分については、5μlを削除し、5ミリリットルのFACS管で計数ビーズを200μl（ソーター·バッファ内の20万個/ mlの濃度に調整）に追加します。 4で取っておく°後の分析のためのC。時間を節約するために、ビーズは、実験開始前にラベルしたチューブにあらかじめ等分することができます。
- 午前の準備ASTERは、セル（ 表1）の表面マーカーを染色する抗体のミックス。時間を節約するために、これは実験の開始前に行うことができます。
- 結合分画は、チューブ内の細胞の約90μlに直接抗体カクテルの用量を追加します。非結合画分の分析が必要な場合は、5ミリリットルのFACSチューブに細胞の90μlを転送し、抗体カクテルの用量を追加します。
- フローサイトメーター用の単一色補正のコントロールパネルを設定します。使用する各蛍光色素の場合は、対応する蛍光色素に結合した抗CD4抗体の1μlを5ミリリットルのFACSチューブ内に残った非結合分画細胞の50μlを混合します。同様に染色されていないコントロールを設定することを忘れないでください。
- ボルテックスし、4℃で30分間、すべてのサンプルをインキュベート℃に
- 300×gで5分間、4℃で各チューブと遠心分離機にソーター緩衝液5mlを追加
- 結合画分については、慎重に上清を吸引し、ソーターbufの200μlの細胞を再懸濁FER。 1.2ミリリットルのFACSマイクロチューブに細胞を移します。同じマイクロチューブにソーター·バッファーおよびプールの別の200μlで管を洗浄します。細胞塊が明らかである場合には、50μmのフィルターを介して細胞を渡す。
- 非結合画分と補償コントロール、またはデカントで上澄みを再懸濁し、2mlのソーターバッファを吸引するための。
- 単一色補正コントロールを使用して、フローサイトメーターを設定します。記録する追加パラメータとして、側方散乱幅（SSC-W）を選択します。
- 図1および図2に示すように、CD4 +またはCD8 + T細胞を同定するために連続したインクルージョンゲートのシーケンスを使用して染色したサンプルを分析します。結合画分については、最大2,000,000の合計の最大イベントにできるだけ多くの細胞を収集しています。非結合分画、1,000,000合計イベントを収集します。買収レートを1秒あたりのイベントで、または3000以下に保つ。
- 同じマシンの設定を使用して、数えるビーズサンプルを分析する。万合計イベントを収集します</ LI>
- FCSのファイルなど、すべてのデータを保存します。
5。データ解析
- FlowJoソフトウェアを使用してカウントビーズサンプル用のFCSデータファイルを分析します。前方にプロットFITCによって散乱および（ 図1および図2を参照）をカウントするビーズをaroungゲートを設定します。各試料で検出されたビーズをカウントの合計数を決定する。採取した細胞イベントの数を決定するために収集されたイベントの合計数から減算します。
- ボックス1で概説方程式を用いて、各サンプル中のすべてのセルの総数を計算します。
- ステンドバインドおよび非バインド分数サンプル用のFCSデータファイルを分析します。リンパ+サイド散布幅LO、ダンプ、CD3 +、CD4 +またはCD8 +、テトラマー、図1および図2に示すように、各試料中の+ T細胞。を識別するために、連続的なインクルージョンゲートのシーケンスを設定
- CD4を定義するために使用される包接ゲートの各々の周波数によって、サンプル中の細胞の総数を掛け+テトラマー+またはCD8 +テトラマー+細胞エピトープ特異的T細胞（ボックス1）の合計数を計算する。
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Representative Results
図2は、以前に関連するペプチド+ CFAで免疫したマウスについての代表的なデータを示しながら、 図1は 、ナイーブマウスからpMHCIIテトラマー濃縮脾臓及びリンパ節試料の代表的なフローサイトメトリープロットを描いている。シリアル·ゲーティングは、CD4の分析+ T細胞集団からの自家蛍光およびその他の不要なイベントを削除します。 CD8 + T細胞集団は、CD4のpMHCIIテトラマー染色+ T細胞のための有用な内部ネガティブコントロールとして機能します。ゲーティングはより難しくなり、濃縮から結合画分は、通常、非結合分画より自家細胞の有意に高い割合を含んでいることに注意してください。
ビーズ計数分析から決定するように、試料中のエピトープ特異的T細胞の絶対数は決定要因として、テトラマー+はこれらの細胞の割合は、濃縮されたサンプルの結合分画内のすべてのセルの合計数を乗じて算出しています細胞染色分析（ボックス1）からNED。
図1のナイーブマウスについては、サンプルの結合分画内のすべての細胞の濃度は（5589分の4411）（200,000）（0.200/0.005）= 6.31×10 6 / mlであった。サンプル内のすべてのセルの合計数です（6.31×10 6個 / ml）（0.095）= 6.00×10 5。最後に、エピトープ特異的CD4数の合計+ T細胞は、（6.00×10 5）（41.5％）（96.6％）（10.2％）（62.3％）（0.64％）= 98です。
図2で免疫したマウスでは、サンプルの結合分画内のすべての細胞の濃度は（3590分の6410）（200,000）（0.200/0.005）= 1.43×10 7 / mlであった。サンプル内のすべてのセルの合計数です（1.43×10 7 / ml）を（0.095）= 1.36×10 6。最後に、エピトープ特異的CD4数の合計+ T細胞は（1.36×10 6）（40.9％）（93.9％）（9.54パーセント）（72.0％）（42.7％）= 1.53×10 4 </ strong>]をクリックします。
エピトープ特異的T細胞の数が8に増加するにつれて濃縮の効率が低下するので、テトラマー+細胞エピトープ特異的T細胞の非常に高い周波数を含むサンプルの非結合画分で見られるかもしれません。このような場合には、非結合画分に存在するエピトープ特異的T細胞の数は別々に計算することができ、結合画分に検出された数に追加された。したがって、 図2に、サンプルの非結合画分内のすべての細胞の濃度は（969分の9031）（200,000）（0.200/0.005）= 7.46×10 7 / mlで、すべてのセルの合計数です（7.46 X 10 7 / ml）を（2.0）= 1.49×10 8、およびエピトープ特異的CD4数の合計+ T細胞は（1.49×10 8）（62.7％）（96.4％）（44.5％）（54.7％）（0.0409 ％）= 8.97×10 3。バインドとバインドされていない画分に数字を追加すると、1.53×10 4 + 8.97×10 3 = 2.43 xがある10 4合計エピトープ特異的CD4 +サンプル全体でのT細胞。エピトープ特異的細胞の増殖が十分に強固であれば確かに、濃縮プロセスをスキップすることができます。
| 蛍光色素 | 抗体 |
| パシフィックブルー | ダンプ（B220は、CD11b、CD11cは、F4/80） |
| 太平洋オレンジ | CD8 |
| FITC | CD3 |
| PE | pMHC複合テトラマーまたは表現型マーカー |
| PerCP | CD4 |
| APC | pMHC複合テトラマーまたは表現型マーカー |
| AlexaFluor 700 | CD44は |
表1推奨抗体染色戦略
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図1エピトープ特異的CD4のフローサイトメトリー分析+ pMHCIIテトラマーベース濃縮後にナイーブマウスのT細胞。代表的なプロットは、バインドされた（A）と結合していない（B）は分数のために示されている。ゲートの連続は+、サイドスキャッタwidthlo、ダンプ、CD3 +リンパイベント散乱を選択するように設定されています。これらのうち、CD4 +またはCD8 +のイベントがエピトープ特異的T細胞またはバックグラウンド染色の分析のためのゲート制御される。バインドされた（C）と結合していない（D）の画分から未染色細胞のアリコートを数える蛍光ビーズと混合して、別々に分析した。た拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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エピトープ特異的CD4 + pMHCIIテトラマーベース濃縮以下のペプチドで免疫したマウスのT細胞の図2フローサイトメトリー分析。代表的なプロットは、バインドされた（A）と結合していない（B）は分数のために示されている。ゲートの連続は+、サイドスキャッタwidthlo、ダンプ、CD3 +リンパイベント散乱を選択するように設定されています。これらのうち、CD4 +またはCD8 +のイベントがエピトープ特異的T細胞またはバックグラウンド染色の分析のためのゲート制御される。バインドされた（C）と結合していない（D）の画分から未染色細胞のアリコートを数える蛍光ビーズと混合して、別々に分析した。た拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
ボックス1のエピトープ特異的T細胞数の計算
エピトープ特異的T細胞の絶対数は、最高の蛍光カウントビーズを用いて計算されます。未染色のアリコート各サンプルからの細胞は、既知濃度に設定ビーズを数えるの規定された容積と混合した後、フローサイトメトリーによって分析される。サンプル中の細胞の濃度は蛍光計数ビーズの既知濃度とその頻度の比較から推測することができます。
サンプル中の細胞の総数は、総試料体積と細胞濃度を乗じて算出される。
サンプル中のエピトープ特異的T細胞の総数は、単にテトラマー陽性細胞の割合を乗じたサンプル内のすべてのセルの合計数です。
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Discussion
このプロトコルによって提示pMHC複合テトラマー基づく細胞濃縮法は、内因性のT細胞レパートリーからエピトープ特異的T細胞を研究するための強力なツールです。 pMHC複合テトラマーの使用は、同族のpMHC複合リガンドと結合するTCRの能力に直接基づくエピトープ特異的T細胞の検出を可能にします。濃縮は、抗原特異的T細胞の非常にまれな集団が彼らの遺伝子構造または前駆周波数の任意の操作なしで、T細胞の内因性レパートリーから検出することができるように感度のレベルを提供します。結果として、この手法は、調査員が直接、免疫応答の全ての段階を通じて、素朴なレベルから in vivo実験系からの内因性抗原特異的T細胞集団を追跡することができます。
このプロトコルは、二次リンパ器官からのエピトープ特異的CD4 + T細胞を濃縮するpMHC複合クラスII（pMHCII）四量体の使用に最適化されていマウスのだ。しかしながら、この技術はまた、pMHC複合クラスI（pMHCI）テトラマーおよびCD8 + T細胞9に適用可能である。 CD4とは異なり、CD8コレセプターのは、TCR-MHC相互作用を安定化させる上で重要な役割を果たしており、これはpMHCIテトラマー染色10のための実用的な意味を持つことができます。最も顕著なのは、CD8抗体の使用は、CD8-四量体の結合を阻害しないクローンに限定すべきである、と彼らはテトラマー染色後の細胞に加えられるべきである。確かに、いくつかのpMHCIテトラマーは、CD8 + T細胞への非特異的結合11,12を軽減するために変異MHCI抗CD8結合部位で設計されています。
四量体の濃度、インキュベーション時間、インキュベーション温度は大幅テトラマー染色の効率に影響を与えることができる、との条件が高いテトラマーシグナル、低バックグラウンド信号は、低量体の内在化し、細胞生理学の変更を最小限の最適な組み合わせを実現するために最適化する必要があります。理想的には、これらの条件は、bべきeは、経験的に一意の各試薬のために決定。我々の手には、しかし、最終濃度10nMと室温で1時間のインキュベーションが最もpMHCIまたはpMHCIIテトラマーのための良い汎用の条件を提供しています。一般的に、pMHCIテトラマーはpMHCIIテトラマーよりも容易に染みいるように見える、染色はしばしば、わずか30分間、4℃で行うことができます。
この手順の規模は、単一のサンプル中のマウスのほぼすべての二次リンパ器官の分析に適しています。したがって、各サンプルは、マウスの全体の循環末梢T細胞レパートリーのかなり包括的な分析を表しています。エピトープ特異的T細胞は、胸腺13,14を含む他の関連組織から濃縮することができる。 4から5週齢のマウスからthymiiを分析する場合、エピトープ特異的シングルポジティブ胸腺細胞は、末梢ナイーブT細胞と同様の数値で検出することができる。エピトープ特異ダブルポジティブ胸腺細胞、しかし、TCR発現のその低レベルのため、検出が非常に困難です。
このプロトコルは、血液または他の組織15-17にエピトープ特異的ヒトCD4 +またはCD8 + T細胞を検出するように構成することができます。エピトープ特異的T細胞の頻度はそう、マウスとヒト17の間およそ50の分析は同じです-血の100mlは、プールされた脾臓とマウス18のリンパ節としてエピトープ特異的T細胞の匹敵する数字をもたらすでしょう。
四量体ベースの濃縮後の細胞のフローサイトメトリー解析における主要な課題は背景から真の細胞事象を区別しています。これは主に、多くの自家細胞はまた、非特異的プロセス中に濃縮されているという事実によるものです。慎重にゲーテッド出ていない場合、これらの自家細胞は偽テトラマー陽性細胞として現れることがあり、特に珍しいナイーブT細胞pの場合には、分析の精度を脱ぎ捨てるopulations。我々のプロトコルは、CD3 +イベント+が離れてダンプ系統からの最初のイベントゲートされ、その後、CD4 +のイベントが先にCD8 +イベントからゲートされているインチツーステップゲーティング戦略を採用していますプロセスでは、任意のFACSプロットの対角線の中心に沿って存在する傾向にある自家細胞は、2反復の手順で分析のゲーテッド外です。自家イベントを効果的に除去するには、多くの蛍光色のコストがかかりますので、我々は非常には、少なくとも6蛍光パラメータの可能なフローサイトメーターの使用をお勧めします。
最もpMHC複合テトラマーは、PEやAPC、これらの蛍光色素の明るさに起因する、とAnti-PEに結合していると抗APC磁性マイクロビーズは、彼らと濃縮を可能にするために容易に利用可能である。しかし、他の蛍光色素も限り対応する磁性マイクロビーズが使用可能であるとしても使用できます。確かに、異なる蛍光色素標識を持つ複数のテトラマーは、対応する抗体結合マイクと一緒に使用することができるrobeads同時に同じサンプルから複数のエピトープ特異的T細胞集団を豊かにする。我々は、PEとAPC標識テトラマー（ 表1）の使用に最適化されて、非常に基本的な抗体蛍光色素のセットアップを概説しているが、他の多くの効果的な組み合わせは、表現型マーカーの研究の柔軟性を高めることが可能です。
彼らはpMHCIIリガンド（およびエピトープ特異的CD8 + T細胞の濃縮のための逆）にバインドしてはいけませんので、CD8 + T細胞集団は、内部ネガティブコントロールとして使用することができます。 pMHCIIエピトープへのクロス制限特異性をもつ善意テトラマー陽性CD8 + T細胞が非常に小さい周波数19に存在するかもしれませんが、サンプル中の四量体+ CD8 +細胞の頻度は、背景テトラマー染色のレベルの良好な評価を提供します。非常に強力な免疫応答時に時折、これらの細胞は、拡張された周波数で存在するかもしれません。必要に応じて、TCRトランスジェニックT細胞のウィットhまたは関連エピトープ特異性の有無に関わらず、追加のポジティブコントロールとネガティブコントロールとして使用することができます。未知の理由のために、いくつかのTCRトランスジェニック細胞およびハイブリドーマはその関連テトラマーでよく染色されないことに注意してください。
我々のプロトコルでは、細胞数の計算を支援するために、蛍光カウントビーズの使用を含む。細胞数も血球計を使用して手動で達成することができるが、我々は、はるかに大きいの実験精度でビーズの結果を数えるの使用は、複数の研究者が関与している場合は特にことがわかります。このプロトコルで処理された細胞の数が少ないとボリュームがあるため、実験誤差の最小化は、高い優先順位でなければなりません。
テトラマー染色は、細胞の固定と透過処理と互換性があり、いくつかの研究では、正常にテトラマーベースの細胞濃縮20,21以下の細胞の細胞内サイトカインや転写因子の発現を解析した。しかし、追加の作業は、サンプル内の追加セル損失に貢献しています。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、このプロトコルの開発で助けジェンキンスラボのアンドレ漢とローレンス·イェン技術上の支援のため、メンバーに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | ||
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 | |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
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