سرطان الخلايا الليفية المرتبطين بها (سي أي إف إس) تسهيل بدء الورم، والنمو والتقدم من خلال الإشارات التي تشجع انتشار الأسلحة النووية، الأوعية الدموية، والتهاب. نحن هنا وصف طريقة لعزل السكان نقية من الخلايا الليفية الطبيعية وسي أي إف إس من الماوس الطازجة والأنسجة البشرية عن طريق الفرز الخلية، وذلك باستخدام PDGFRα كعلامة السطح.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الخلايا الليفية عادي والسرطان يرتبط بها من الأنسجة الطازجة من الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
سرطان الخلايا الليفية المرتبطة (سي أي إف إس) هي نوع من الخلايا أبرز داخل الورم سدى من العديد من أنواع السرطان، سرطان الثدي في وجه الخصوص، وكثيرا ما يرتبط وجودهم بارز مع 1،2 بسوء التشخيص. سي أي إف إس هي حيوانية تنشيط الخلايا الليفية اللحمية، وكثير منها تعبر عن علامة الأرومة الليفية العضلية α-SMA 3. سي أي إف إس الأنسجة الليفية تنبع من المحلية وكذلك من خلايا نخاع العظام المستمدة من المعينين داخل الورم تطوير واعتماد النمط الظاهري CAF تحت تأثير الورم المكروية 4. عرضت سي أي إف إس لتسهيل بدء الورم، والنمو والتقدم من خلال الإشارات التي تشجع انتشار الخلايا السرطانية، الأوعية الدموية، وغزو 5-8. أثبتنا أن سي أي إف إس تعزيز نمو الورم عن طريق الوساطة الورم المعززة للالتهاب، بدءا من المراحل المبكرة ما قبل الورمية 9. رغم وجود أدلة متزايدة من سي أي إف إس تلعب دورا رئيسيا في تسهيل نمو الورم،وكانت دراسة سي أي إف إس تحديا الجارية نظرا لعدم وجود علامات محددة CAF وعدم التجانس العظمى من هذه الخلايا، مع العديد من الأنواع الفرعية تتعايش في المكروية ورم 10. وعلاوة على ذلك، ودراسة الخلايا الليفية في المختبر يعوقها حقيقة أن في كثير من الأحيان يتم تبديل الشخصي التعبير الجيني في مجال زراعة الأنسجة 11،12. لمعالجة هذه المشكلة والسماح منحازة التنميط التعبير الجيني من الخلايا الليفية الماوس من الطازجة والأنسجة البشرية، وضعنا طريقة يعتمد على البروتوكولات السابقة للفرز الخلايا مضان المنشط (FACS) 13،14. نهجنا تعتمد على استخدام PDGFRα كعلامة سطح الخلايا الليفية لعزل من الماوس الطازجة والأنسجة البشرية. وأعرب تماما من قبل كل من الخلايا الليفية PDGFRα العادية ومقاهي 9،15. هذا الأسلوب يسمح للسكان العزل نقية من الخلايا الليفية الطبيعية وسي أي إف إس، بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على α-SMA + تنشيط myofibroblasts. يمكن أن تكون معزولة الخلايا الليفية ثمتستخدم لتوصيف ومقارنة لتطور التعبير الجيني التي تحدث في أثناء سي أي إف إس تكون الأورام. في الواقع، نحن وغيرنا عن التنميط التعبير عن الخلايا الليفية معزولة من قبل الخلية فرز 16. تم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح لعزل السكان وإنشاء ملف عالي التخصيب من الخلايا الليفية من أنسجة الجلد، الثديية والبنكرياس والرئة. وعلاوة على ذلك، لدينا أسلوب يسمح أيضا زراعة الخلايا فرزها، من أجل إجراء تجارب الفنية وتجنب التلوث من قبل خلايا الورم، والتي غالبا ما تكون عقبة كبيرة عندما تحاول سي أي إف إس الثقافة.
البروتوكول
1. تشريح الأنسجة الثديية أو الجلد من الفئران
- قبل تشريح الأنسجة المطلوب من الفئران، وإعداد اللوازم والكواشف بعد:
اللوازم:
- أدوات جراحة (غسلها بالمنظفات وتراجع بعد ذلك في الايثانول 70٪).
- الستايروفوم سطح للراحة خلال الماوس على تشريح.
- دبابيس أو الإبر لعقد الفئران خلال تشريح.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام PDGFRα كعلامة لنتائج الخلايا الليفية في عزلة السكان عالي التخصيب من الخلايا الليفية الأنسجة. كان مستوى نقاء 99٪ بعد الفرز، كما كميا بعد تحليل نوع (الشكل 2A). تقدير النسبة المئوية للتلوث غير الليفية الخلايا عن طريق التعبير النسبية للجينات الخلية التحكم الخاصة (الشكل 2B) ويظهر عادة 0،1-0،6٪ تلوث. هذا المستوى من النقاء يسمح عالية الجودة التنميط transcriptome من الخلايا الليفية معزولة 9.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بينما التجارب التي أجريت في زراعة الأنسجة يمكن أن يكون بالمعلومات واقتراح المبادئ الوظيفية التي يمكن التحقق منها في الجسم الحي، ومن المعروف أن تحدث تغييرات كبيرة في التعبير الجيني للخلايا في الثقافة 11،12. وضعنا من أجل تجنب خطوة زراعة الأنسجة عند التنميط التعبير الجيني في الخلايا الليفية، وهو البروتوكول الذي يسمح عزلة طبيعية، الخلايا الليفية بالسرطان المرتبطة وكذلك من الماوس طازجة أو الأنسجة البشرية. تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح مع أنسجة الجلد والبنكرياس والثد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور اسحق Oschry والدكتور آصف أوريت ساغي، لمساعدتهم مع FACS الفرز. وأيد هذا البحث من المنح لNE من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) تحت اتفاقية المنحة رقم [276890]، من جمعية السرطان إسرائيل (# 20110078)، وصندوق إسرائيل من بحوث السرطان (بحوث شهادة جائزة التنمية).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف شركة كتالوج عدد التعليقات (اختياري) | |||
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | البيولوجي للصناعات | 02-023-1A | |
| كولاجيناز II | ورثينجتون | LS4176 | |
| كولاجيناز IV | ورثينجتون | LS4188 | |
| ديوكسي ريبونيوكلياز | ورثينجتون | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| مصفاة الخلية 70 ميكرومتر | SPL | 93070 | |
| تنقية مكافحة الماوس CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| عن طريق المسبار (7AAD) | البريد العلوم البيولوجية | 00-6993-50 | |
| مكافحة الماوس CD140a-PE (PDGFRa) | البريد العلوم البيولوجية | 12-1401-81 | |
| مكافحة الماوس F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM ث / س الفينول الأحمر | Gibco | 31053 | |
| نوع الكولاجين I | BD العلوم البيولوجية | 354236 |
المراجع
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
