Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Долгосрочные, Высокое разрешение конфокальной микроскопии Lapse время Published: December 31, 2012 doi: 10.3791/4426
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Biology, University of Washington, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Washington, 3PRESTO, Japan Science and Technology Agency

Summary

Мы описываем протокол, используя камеру слайды и средств массовой информации для иммобилизации завода семядоли для конфокальной микроскопии эпидермиса в течение нескольких дней развития, документирования устьичного дифференциации. Флуорофор-меченных белков можно проследить динамически выражения и внутриклеточной локализации, повышения понимания их возможной роли в процессе деления клеток и их тип дифференциации.

Abstract

Изображений в динамике естественных клеточных поведение всей последовательности развития может стать мощной техникой для понимания механики ткани рисунка. Во время развития животных, ключевой клеточной пролиферации и структурирование события происходят очень быстро. Например, в Caenorhabditis Элеганс всех клеточных делений, необходимых для личиночной плана тела будут завершены в течение шести часов после оплодотворения, с семи митотических циклов 1; шестнадцать или более митозов эмбриогенеза дрозофилы происходит менее чем за 24 часа 2. В отличие от клеточных делений во время развития растения медленно, как правило, на порядок дня 3,4,5. Это накладывает уникальный вызов и потребность в долгосрочных живого изображения для документирования динамического поведения деления и дифференцировки клеток событий во время завод органогенеза. Arabidopsis эпидермис является отличной системой модель для исследования сигнализации, судьбы клеток и развитие растений. В семядолей, эта ткань состоит из воздуха и воды, устойчивый тротуаров клетки вперемешку с равномерно распределенной устьиц, клапаны, которые открываются и закрываются, чтобы контролировать обмен газов и потери воды. Правильное расстояние между этими устьица имеет решающее значение для их функция, и их развитие следует последовательность асимметричное деление и дифференцировку клеток шаги для создания организованного эпидермиса (рис. 1).

Этот протокол позволяет наблюдать клеток и белков в эпидермисе в течение нескольких дней развития. Этот срок позволяет точной документации стволовых клеточных делений и дифференцировки клеток эпидермиса, в том числе устьиц и эпидермальных клеток тротуар. Флуоресцентные белки могут быть слиты с белками, представляющие интерес для оценки их динамики в процессе клеточного деления и дифференциации процессов. Эта техника позволяет нам понять, локализация нового белка, полярный 6, во время распространения этапе устьичного-линия клеток в гоэлектронной Arabidopsis семядоли эпидермис, где он экспрессируется в клетках предшествующих событий асимметричным разделением и переходит к характерным области клетки коры незадолго до разделения происходит. Изображения могут быть зарегистрированы и упорядочить видео легко производятся с использованием программных средств для визуализации динамической локализации белков и клеточных типов, как они меняются с течением времени.

Protocol

1. Семенной стерилизации

  1. Подготовка семян стерилизации раствор: 33% бытового отбеливателя, 0,1% Triton X-100.
  2. Место проведения семена желаемого флуоресцентные конструкции репортер (ы) и генотип (ы) в 1,7 мл трубки и применяют 1 мл стерилизации решение. Инкубируйте на nutator в течение 15 мин.
  3. В стерильных капот, использование пипетки для удаления стерилизации раствор из трубки, оставляя семена позади. Промыть 1 мл стерильной воды. Повторите четыре раза.
  4. Инкубировать при температуре 4 ° С в течение двух или более дней.

2. Подготовка палаты Слайд-Медиа

  1. Смешайте 20 мл 0,5% раствора Bacto Агар (не чисто агарозы) в воде в 200 мл колбу, и микроволновую печь до полного растворения. Будьте осторожны при кипячении раствора.
  2. Охладите раствор примерно до 60 ° C.
  3. Сбор 1 мл агара раствор с пипетки и медленно распространяется на защитное стекло внутри слайда камеры (Lab-Tek II Chambered # 1.5 немецкой системы покровного стекла). Решение Wакие слишком горячей или применяется слишком быстро может расплавить клей или трещины стекла.
  4. Сразу добавим второй мл агара решение. Агар СМИ должны теперь полностью покрывают нижней части слайда камеры. Это минимальные средства массовой информации достаточно, чтобы поддерживать развитие растений семядоли, которая содержит питательные вещества хранятся в течение четырех-пяти дней, сохраняя влагу и позволяет диффузии газов.
  5. Прохладный слайд на настольном с камеры покрыты. Если колба покрыта плотно, решение может быть сохранен и нагревают для использования в будущем.

3. Семенной Dissection

  1. Убрать трубы стерильных семян от 4 ° C хранения.
  2. Поместите бумагой на сцене рассекает микроскопом и смочить водой. Отрегулируйте ткани, чтобы создать гладкую поверхность. Ткань используется для стабилизации семена для вскрытия.
  3. Внесите 20-30 семян из трубы на ткани, соблюдая осторожность, чтобы разместить их в поле рассекает сферу зрения.
  4. Использование резкое щипцы (Roboz, № 5 биологии наконечник), Осторожно удалите семена пальто из рассады внутри. И внешние и внутренние покровы должны быть удалены.
  5. При визуализации семядолей, это выгодно для удаления гипокотиль и корешков. Семядоли содержат достаточно питательных веществ, чтобы развиваться в течение нескольких дней в соответствии с настоящим Протоколом. Если нетронутыми, гипокотиля будет выпрямить и удлинить резко, двигаясь семядоли из поля промежуток времени зрения. Используйте скальпель, чтобы разрезать семядоли бесплатно гипокотиля.
  6. Держите расчлененный семядоли погружается в воду, в микропробирку или аналогичный.
  7. Повторите 3.4-3.6 нужное число семядолей будет достигнута. 15-20 успешным вскрытия рекомендуется перед монтажом.

4. Монтаж Семядоли в палате слайдов

  1. С помощью небольшой (18 мм 2) покровного стекла, вырезать через агар средств массовой информации и снять весь слой вверх из стекла базе камеры слайда.
  2. Внесите расчлененный семядоли с минимумом воды от проведениятрубка в камере слайд, под поднимаемым слой агара.
  3. Осторожно опустите агара на семядоли. Если избыточная вода присутствует, замочите его прочь с тканью, стараясь не нарушать семядоли. Образцы не должны больше двигаться легко, когда крепление завершена.
  4. Поместите крышку на слайде камеры и движение слайд столик микроскопа.

5. Длительная изображений

  1. Установите перевернутую конфокальной микроскопии для получения изображения желаемого флуорофора (ы). LSM700 параметров, используемых: для GFP, возбуждение при 488 нм и сбор с полосовой фильтр на 440-530 нм; для RFP, возбуждение при 555 нм и сбор с полосовой фильтр на 570-610 нм.
  2. Проверьте установлены образцы на наличие повреждений. Запрограммируйте мест нетронутыми, правильно установлен семядолей в микроскоп программного обеспечения. В дзен-2009: фокус на семядоли с 20-кратным цель и двигаться к цели центре камеры слайдов. При приобретении режим, изменить увеличить до 0,5 и размер кадра </ EM> до 48x48 пикселей. Выберите позиции флажок и сканирование обзор изображение ... кнопку под позиции, то увеличьте горизонтальный и вертикальный номера плитки до 30-35. Когда проверка будет завершена, нажмите кнопку позиций под размеры вкладки и место перекрестия на каждой семядоли, чтобы наблюдать.
  3. Установить серии Z охватывает семядоли эпидермис все samples.In Zen 2009: Нажмите Z-Stack флажок. Выберите каждую позицию по позиции списка и нажмите кнопку Переместить. Сосредоточьтесь на верхней плоскости семядоли эпидермис и нажмите кнопку Set Первая кнопка под Z-Stack. Фокус в самое нижнее положение, при котором эпидермис полезно видимых и нажмите на кнопку Set последний. Нажмите кнопку рядом с оптимальной, который показывает лучшие Z-толщина среза, чтобы установить. Проверьте каждый семядолей, чтобы подтвердить, что эти параметры охватывают все образцы; г параметры не могут быть установлены для индивидуумыidual должностей в дзен-2009.
  4. Установка временных рядов в нужное разрешение и длины. Интервалы 15-30 мин в течение трех дней являются эффективными для динамики белков в делении клеток эпидермиса. Этот интервал может быть изменен по мере необходимости. В дзен-2009: установите флажок временных рядов. Под временных рядов, установить циклы для количества изображений желаемого с помощью ползунка или введя в текстовое поле. Установить интервал до 30 и использовать выпадающее меню для выбора мин.
  5. Начало xyzt несколько позиций сканирования. Обратите внимание, что число позиций должно быть ограничено по результатам проверки спецификаций, если общее время сканирования больше, чем требуемый интервал, моменты времени не будет правильным. Не более шести одновременных позиций возможно при визуализации GFP и RFP на 59 г ломтиков в 30-минутный интервал использования нашей системы. В дзен-2009: Изменение размера кадра в нужное разрешение и нажмите кнопку Пуск эксперимент.

6. Редактирование видео

  1. С конфокальной файл данных, сделать максимальную интенсивность г-проекции каждый раз / позиция комбинации и экспорт в виде файлов изображений в формате без потерь, таких как TIFF. Имена файлов должны быть в одной серии в положение (например, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002 и т.д., не POLAR-GFP_0001_pos1) для программного обеспечения, чтобы объединить их в фильме. В дзен-2009: использование копий: Подгруппа по вкладке Обработка разделить позиции в отдельные файлы, то максимальная интенсивность проекции. И, наконец, экспортировать как TIFF (Файл: экспорт, полный окна разрешение изображения - серия).
  2. Используйте ФИДЖИ 7,8 для выравнивания последовательных изображений, выполнив bUnwarpJ макро-9 (Плагины: Дата регистрации: bUnwarpJ). Измените режим регистрации на Mono. Все Advanced Options можно использовать значения по умолчанию. Для длинных последовательностей промежуток времени, загрузить и установить макрос "Аффинные + В соответствии Упругие 2D Регистрация изображения", который будет применяться bUnwarpJ к серии изображений автоматически, и у открытыхнаших данных с использованием файла: Импорт: последовательность изображений, чтобы использовать его. Снимите MOPS достопримечательностями добычи и перспективе.
  3. Используйте Фиджи / ImageJ или Quicktime Pro, чтобы открыть последовательность соответствие изображения и сохранить в нужном формате видео (AVI является хорошим выбором).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Набор информативных моментов времени собрано с помощью этого метода показана на рисунке 3. Клеточные мембраны помечены RFP (ч. РБ) и GFP сливается с POLAR белка под его родном промотора (POLAR :: POLAR-GFP) 6 В 30-минутной шкалой времени, мы видим, деление клеток, наряду с изменениями в локализации белков перед ними. Асимметричные клеточных делений в устьичного формы линии стволовых клеток, как устьичного предшественники называли meristemoids, которые сохраняют способность к дальнейшему асимметричных делений, и их клетки сестра, называется устьичного линии земли клетки (SLGCs). SLGCs не предполагают устьичного судьбу предшественников, они часто трансдифференцироваться на тротуаре клеток, но может возобновиться асимметричным разделением возможности для производства другой meristemoid расстоянии от первого, как лист расширяется. Все эти судьбы находят свое отражение в выражении и локализации POLAR :: POLAR-GFP (рис. 3, видео 1).

jove_content "FO: Keep-together.within-страница =" Всегда "> Рисунок 1
Рисунок 1. Схема устьичного развития. Protodermal клетки попадают в устьичного линии, как meristemoid материнские клетки (MMC) в шаг контролируется основным спираль-петля-спираль транскрипционных факторов дара речи (СПЧ), Scream (ГСО), а SCRM2. КММ делятся асимметрично, чтобы произвести meristemoid (M) и устьичного клетки землю линии (SLGC); этот шаг может происходить несколько раз и обеспечивает один механизм, с помощью которого устьица расположены на расстоянии друг от друга. Ячейка состоянии перехода meristemoid в камеру охранник матери (GMC) идентичность, направленная специально на bHLH MUTE, а также SCRM / 2. Окончательный симметричного деления GMC и его дифференциации на две зрелые клетки охранника (GC) требует bHLH FAMA с SCRM / 2 10.ig1large.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема расчленения семян и монтажные процедуры. Семена стерилизуют и выдерживают при температуре 4 ° С, семена пальто и гипокотилях удалены, а семядоли установлен под агар средств массовой информации в камере слайд для работы с изображениями на перевернутом конфокальной микроскопии.

Рисунок 3
Рисунок 3. Замедленной изображений демонстрирует POLAR :: POLAR-GFP дистальной локализации предшествующего асимметричное деление клеток. Серия: POLAR-GFP первоначально появляется равномерно распределены, то примерно за два часа до асимметриического подразделения (наконечники стрел) POLAR-GFP отделяет от места начального meristemoid. Серия B: После первого асимметричного деления (стрелки), POLAR-GFP исчезает в обеих ячейках, что подразумевает быстрый переход к охраняют материнской клетки (GMC) состояние meristemoid. GMC (звездочка) делится симметрично и дифференцируется с образованием устьичного клетки охранника, в то время как сестра восстанавливает клетки POLAR-GFP выражение, предположительно, предвещая позже асимметричное деление.

Видео 1. Обтекаемый, зарегистрированного видео POLAR :: POLAR-GFP локализации при усилении и расстояние одного устьичного клетки-предшественницы. Первоначально POLAR-GFP появляется равномерно в клетке; на 39 часа после прорастания, он поляризует сильно, как раз перед разделением (40.0h) размещения меньшего meristemoid на противоположном конце клетки. Чем больше клетка на право также восстанавливает устьичного идентичности линии, и на 45 часа POLAR-GFP локализации движется рядом с предшественником устьичного. Деление на 47 часов создает новый meristemoid (справа), ориентированных в сторону от существующих meristemoid (слева) от первого. В итоге два устьиц, разделенных одной ячейкой. (Изображения отсутствуют в видео не собирались и не представляют существенных изменений.) Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Это покадровой конфокальной методика позволяет продольных исследований флуоресцентно отмеченных экспрессии белка и локализации в отдельных клетках Arabidopsis эпидермиса семядолей, которые, в случае полярных и других динамично меняющейся белков имеет решающее значение для правильного понимания их функции. Ранее, устойчивый промежуток времени визуализации была использована для изучения Arabidopsis корень грибковой инфекции 11 и меристемы рост 5,12, но с добавлением семядоли эпидермис расширяет универсальность этого метода и позволяет использовать его для дополнительных белков, в частности, содействие расширению области развития устьичного .

Основным недостатком протокола является то, что в настоящее время ограничены семядоли, которые содержат питательные вещества, необходимые для раннего развития. Кроме того, семядоли развития является не совсем идентично претерпели в воздухе, поскольку гель средней ограничивают газообмен. Сканирование ла-воздействия сер комнате свет и являются достаточными для фотоморфогенеза, вызывая расширение семядолей и хлоропластов созревания, но устьиц может иногда развиваться в соседних пар из-за низкой концентрации СО 2. Эта тенденция может быть уменьшена, используя только тонкий слой средства массовой информации и минимальные монтажные воды, как указано в этом протоколе.

Флуорофора выбор также важна для успеха с этой техникой. Оба GFP и RFP работают хорошо, и позволяют двойной маркировки для визуализации периферии клетки или белки оценку совместной локализации. Пользовательские фильтры значительно снизить автофлуоресценции и позволяют чувствительны обнаружения флуоресцентные метки белков, даже когда хлорофилл присутствует. Однако, даже фильтруется CFP автофлуоресценции в прорастающих семядолях достаточно сильна, чтобы исключить видимость почти всех сигнала с помощью LSM700. Для приборов со спектральным возможность unmixing, широкий выбор флуорофоров может быть осуществимо.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим Аманда Rychel за помощь в развитии промежуток времени протокол и Линн Pillitteri для построения POLAR :: POLAR-EGFP. Мы также признательны за предоставление ABRC ч. РБ построить. Этот протокол был разработан в рамках поддержки PRESTO награду от Японии науки, технологий и Агентством. Исследования POLAR была также поддержана Вашингтонского университета роялти исследовательского фонда (RRF-4098) и Национальный научный фонд (MCB-0855659). KMP является NSF Высшее научный сотрудник (DGE-0718124), а кут HHMI-GBMF следователя.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Agar BD 214010
One-chamber slide Nunc (Thermo Scientific) 155360 Or two-chamber (155379)
Laser scanning confocal microscope Zeiss LSM700 Zen 2009 software
20x objective lens Zeiss 420650-9901 NA 0.8, Plan-APOCHROMAT
Dissecting microscope Benz (National) 431TBL Illuminates from below
#5 forceps, biology tip Roboz Surgical Instrument RS-4978 Very fine tips are critical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64 (1983).
  2. Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1993).
  3. Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449 (1995).
  4. Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).
  5. Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).
  6. Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).
  7. Fiji Is Just ImageJ. , Fiji. Available from: http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji (2008).
  8. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).
  9. Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. ánchez, Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. rtiz-, C,, Kybic, J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, Springer. Heidelberg, Berlin. 85-95 (2006).
  10. Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).
  11. Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).
  12. Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619 (2006).

Tags

Биология растений выпуск 70 молекулярной биологии биологии развития клеточной биологии ботаники растение живое изображение эпидермис устьица конфокальный промежуток времени, Семядоли
Долгосрочные, Высокое разрешение конфокальной микроскопии Lapse время<em&gt; Arabidopsis семядолей</em&gt; Эпидермиса во время прорастания
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peterson, K. M., Torii, K. U.… More

Peterson, K. M., Torii, K. U. Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination. J. Vis. Exp. (70), e4426, doi:10.3791/4426 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter