Method Article

Долгосрочные, Высокое разрешение конфокальной микроскопии Lapse время Arabidopsis семядолей Эпидермиса во время прорастания

DOI:

10.3791/4426

December 31st, 2012

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем протокол, используя камеру слайды и средств массовой информации для иммобилизации завода семядоли для конфокальной микроскопии эпидермиса в течение нескольких дней развития, документирования устьичного дифференциации. Флуорофор-меченных белков можно проследить динамически выражения и внутриклеточной локализации, повышения понимания их возможной роли в процессе деления клеток и их тип дифференциации.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изображений в динамике естественных клеточных поведение всей последовательности развития может стать мощной техникой для понимания механики ткани рисунка. Во время развития животных, ключевой клеточной пролиферации и структурирование события происходят очень быстро. Например, в Caenorhabditis Элеганс всех клеточных делений, необходимых для личиночной плана тела будут завершены в течение шести часов после оплодотворения, с семи митотических циклов 1; шестнадцать или более митозов эмбриогенеза дрозофилы происходит менее чем за 24 часа 2. В отличие от клеточных делений во время развития растения медленно, как правило, на порядок дня 3,4,5. Это накладывает уникальный вызов и потребность в долгосрочных живого изображения для документирования динамического поведения деления и дифференцировки клеток событий во время завод органогенеза. Arabidopsis эпидермис является отличной системой модель для исследования сигнализации, судьбы клеток и развитие растений. В семядолей, эта ткань состоит из воздуха и воды, устойчивый тротуаров клетки вперемешку с равномерно распределенной устьиц, клапаны, которые открываются и закрываются, чтобы контролировать обмен газов и потери воды. Правильное расстояние между этими устьица имеет решающее значение для их функция, и их развитие следует последовательность асимметричное деление и дифференцировку клеток шаги для создания организованного эпидермиса (рис. 1).

Этот протокол позволяет наблюдать клеток и белков в эпидермисе в течение нескольких дней развития. Этот срок позволяет точной документации стволовых клеточных делений и дифференцировки клеток эпидермиса, в том числе устьиц и эпидермальных клеток тротуар. Флуоресцентные белки могут быть слиты с белками, представляющие интерес для оценки их динамики в процессе клеточного деления и дифференциации процессов. Эта техника позволяет нам понять, локализация нового белка, полярный 6, во время распространения этапе устьичного-линия клеток в гоэлектронной Arabidopsis семядоли эпидермис, где он экспрессируется в клетках предшествующих событий асимметричным разделением и переходит к характерным области клетки коры незадолго до разделения происходит. Изображения могут быть зарегистрированы и упорядочить видео легко производятся с использованием программных средств для визуализации динамической локализации белков и клеточных типов, как они меняются с течением времени.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Семенной стерилизации

  1. Подготовка семян стерилизации раствор: 33% бытового отбеливателя, 0,1% Triton X-100.
  2. Место проведения семена желаемого флуоресцентные конструкции репортер (ы) и генотип (ы) в 1,7 мл трубки и применяют 1 мл стерилизации решение. Инкубируйте на nutator в течение 15 мин.
  3. В стерильных капот, использование пипетки для удаления стерилизации раствор из трубки, оставляя семена позади. Промыть 1 мл стерильной воды. Повторите четыре раза.
  4. Инкубировать при температуре 4 ° С в течение двух или более дней.

2. Подготовка палаты Слайд-Медиа

  1. Смешайте 20 мл 0,5% раствора Ba....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Набор информативных моментов времени собрано с помощью этого метода показана на рисунке 3. Клеточные мембраны помечены RFP (ч. РБ) и GFP сливается с POLAR белка под его родном промотора (POLAR :: POLAR-GFP) 6 В 30-минутной шкалой времени, мы видим, деление клеток, наряду с изменениями в локализации белков перед ними. Асимметричные клеточных делений в устьичного формы линии стволовых клеток, как устьичного предшественники называли meristemoids, которые сохраняют способность к дальнейш.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это покадровой конфокальной методика позволяет продольных исследований флуоресцентно отмеченных экспрессии белка и локализации в отдельных клетках Arabidopsis эпидермиса семядолей, которые, в случае полярных и других динамично меняющейся белков имеет решающее значение для правильного понимания их функции. Ранее, устойчивый промежуток времени визуализации была использована для изучения Arabidopsis корень грибковой инфекции 11 и меристемы рост 5,12, но с добавлением семядоли эпидерм.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Аманда Rychel за помощь в развитии промежуток времени протокол и Линн Pillitteri для построения POLAR :: POLAR-EGFP. Мы также признательны за предоставление ABRC ч. РБ построить. Этот протокол был разработан в рамках поддержки PRESTO награду от Японии науки, технологий и Агентством. Исследования POLAR была также поддержана Вашингтонского университета роялти исследовательского фонда (RRF-4098) и Национальный научный фонд (MCB-0855659). KMP является NSF Высшее научный сотрудник (DGE-0718124), а кут HHMI-GBMF следователя.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
Bacto Агар BD 214010
Один-камера слайд Nunc (Thermo Scientific) 155360 Или две камеры (155379)
Лазерной сканирующей конфокальной микроскопии Zeiss LSM700 Zen 2009 программное обеспечение
20-кратный объектив Zeiss 420650-9901 NA 0.8, Plan-Apochromat
Препаровальная лупа Benz (национальных) 431TBL Горит снизу
# 5 щипцы, биологии чаевые Roboz хирургических инструментов RS-4978 Очень тонкий советыявляются критическими

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64(1983).
  2. Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. Bate, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Arabidopsis CotyledonConfocal Time LapseEpidermal DevelopmentGermination ImagingProtein LocalizationCell Division DynamicsStomatal LineageFluorescent Protein FusionZ Series AcquisitionMulti Position Scan

Related Articles