A configuração de Baixo Custo para audiometria comportamental em roedores

Summary

Um método rápido e barato para a determinação do comportamento de ouvir parâmetros como limiares auditivos, deficiência auditiva ou percepções fantasmas (zumbido subjetivo) é descrito. Ele utiliza pré-pulso de inibição da resposta de alarme acústico e pode ser facilmente implementado num computador pessoal, utilizando um programável AD / DA-conversor e um sensor piezo.

Abstract

Em pesquisas com animais auditivo é fundamental para ter informações precisas sobre os parâmetros básicos de audição dos sujeitos animais que estão envolvidos nos experimentos. Tais parâmetros podem ser características de resposta fisiológica da via auditiva, por exemplo, através de audiometria de tronco cerebral (BERA). Mas estes métodos permitem extrapolações apenas indiretos e incerto sobre a percepção auditiva que corresponde a esses parâmetros fisiológicos. Para avaliar o nível de percepção da audição, métodos comportamentais tem que ser utilizado. Um problema potencial com o emprego de métodos de comportamento para a descrição de percepção em modelos animais é o facto de a maioria destes métodos envolvem algum tipo de aprendizagem paradigma dos sujeitos antes podem ser testados comportamentalmente, por exemplo, animais podem ter de aprender a pressionar uma alavanca em resposta a um som. Como estes percepção aprender paradigmas de mudança em si ^1,2, consequentemente irá influenciar qualquer resultado sobre a percepção obtida comestes métodos e, portanto, têm de ser interpretados com cautela. As exceções são paradigmas que fazem uso de respostas reflexas, porque aqui não há paradigmas de aprendizagem tem que ser realizada antes do teste de percepção. Uma resposta como reflexo é a resposta de sobressalto acústico (ASR), que pode ser altamente reprodutível provocou inesperados com sons altos em animais ingênuos. Este, por sua vez ASR pode ser influenciada pela anterior sons, dependendo da perceptibilidade deste estímulo precedente: Soa bem acima limiar auditivo irá inibir completamente a amplitude da ASR; soa perto de limiar será apenas ligeiramente inibir a ASR. Este fenómeno é chamado de pré-pulso de inibição (PPI) ^3,4, e a quantidade de PPI no ASR gradualmente depende da perceptibilidade do pré-pulso. PPI da ASR é, portanto, bem adequado para determinar audiogramas comportamentais em ingênuos, não treinados animais, para determinar deficiências auditivas ou mesmo para detectar possíveis percepções subjetivas zumbido nestesanimais. Neste artigo é demonstrar a utilização deste método em um modelo de roedor (ver também ref. ^5), o gerbilo da Mongólia (Meriones unguiculatus), que é um modelo bem conhecido para a pesquisa de espécies resposta de sobressalto dentro da gama de audição humana normal (por exemplo, ^6).

Protocol

1. Instalação Montagem e programação de software

1. Instale um D / A placa em um computador pessoal (por exemplo: NI PCI 6229, a National Instruments) e conectá-lo a uma fuga de caixa (por exemplo: BNC-2110, a National Instruments), ambos devem suportar pelo menos uma entrada e um canal de saída com uma taxa de amostragem de, pelo menos, 44,1 kHz cada.
2. Conecte a saída da fuga caixa-via cabo BNC a um amplificador de som (por exemplo: AMP75 amplificador de potência de banda larga, Thomas Wulf).
3. Instalar uma webcam infravermelho (por exemplo: Pro Câmera IP Grande, Grandtec Electronics) para a vigilância animal na escuridão.
4. Instalar um ambiente de desenvolvimento integrado (por exemplo: Matlab) para implementar um programa definido pelo fluxograma apresentado na Figura 1. Uma versão em execução no Matlab 2007b pode ser obtido, gratuitamente, a partir do autor correspondente.
5. Dentro de uma câmara à prova de som de um altifalante instalar sobre uma mesa. Conecte o alto-falante to o amplificador de som.
6. Instalar um sensor piezo (por exemplo sensor força FSG15N1A, Honeywell) em cima de uma placa isolante, apoiá-lo com poder e conectá-lo via cabo BNC à entrada da fuga box; sinal de terra do sensor.
7. Construir uma câmara de medição a partir de um tubo de vidro acrílico ajustado para o tamanho do roedor para medir (por exemplo gerbils: comprimento 15 cm, diâmetro interior 4,3 cm de diâmetro externo 4,8 cm). Fixar uma grelha com uma largura de malha de 0,5 mm para a frente do tubo e uma porta almofadada com um mecanismo de bloqueio (por exemplo, um gancho) para a parte traseira. A fixação pode ser feita com cola quente, para a única porta de dobradiça e o prendedor para o gancho é fixado ao tubo.
8. Anexar pés de espuma de plástico que se encaixam as dimensões do tubo de medição na placa do sensor de isolamento. Pés devem apoiar o tubo ao longo da extremidade frontal e traseira e levante o tubo para o nível do sensor. Certifique-se de que não há contato entre o sensor de luz piezo e da câmara de medição. Fixar a placa do sensor com a câmara de medição centrado na frente do falante e colocar um microfone para controle de som próximo a ele (por exemplo, B & Type K 2669 / B & K Tipo 4190 ligado ao amplificador de medição B & K Tipo 2610, todos: Bruel e Kjaer) no nível da cabeça dos animais, de modo que ele não está a interferir com o tubo.
9. Note que a qualidade de seus dados audiométricos dependerá da qualidade do seu sistema de som. Em qualquer caso, usar o microfone e amplificador de medição para determinar a função de transferência de freqüência de seu sistema antes de suas primeiras experiências e incluem uma rotina em seu software para corrigir esta função de transferência de frequência para fazer a saída espectral de seu apartamento alto-falante.
10. Alinhe a webcam com a configuração para que se possa monitorar o comportamento do animal.

2. Determinação do comportamento de limiares auditivos (audiogramas)

1. Levar o animal de sua gaiola para casa e colocá-lo de cabeça no tubo; cperder a porta.
2. Colocar o tubo sobre os pés de espuma e o sensor. Desligue toda a luz e feche a porta para a câmara. A câmara de ar em si não é condicionado, mas tem a temperatura, humidade e outras variáveis ​​de ambiente do laboratório circundante. A mudança de ar por ventiladores não é aconselhável devido ao ruído induzido mas o volume da câmara está a apoiar o oxigénio para o animal durante muitas horas. Aguarde 15 minutos para permitir que o animal se acostumar com a configuração. O tempo de aclimatação é benéfico para o animal, pois ele pode se acalmar em seu próprio ritmo e se acostumar com o tubo. Por outro lado, não se vê qualquer diferença no comportamento durante o tempo de aclimatação durante vários sessão, o que indica que uma sessão extra para familiarizar o animal com o tubo e a câmara antes da experiência não é necessária.
3. Inicie o programa e definir os parâmetros para a estimulação (cf. também ref ^5.): Estímulos consistem em tons puros com diferentes frecias. O estímulo de sobressalto deve ser apresentado com um nível de pressão sonora suficientemente elevado para induzir uma resposta reprodutível de sobressalto. Em nosso laboratório utilizamos intensidades de 105 dB SPL (estímulo duração de 6 ms incluindo 2 ms aumento cosseno-quadrado e rampas de queda) para obter respostas de sobressalto em gerbilos da Mongólia. Os estímulos de teste que precedem os estímulos são apresentados sobressalto em diferentes frequências e intensidades no intervalo a ser testado, geralmente a partir de baixo limiar auditivo para níveis bem acima do limiar, com frequências que cobrem toda a gama audível da espécie. Freqüência e duração do susto e do estímulo de teste são combinadas em cada ensaio, o intervalo entre interstimulus sobressalto e estímulo de teste é definido para 100 ms. Utilizar pelo menos 15 repetições com intervalos interstimulus randomizados de 10 ± 2,5 seg para cada combinação de frequência e intensidade dos estímulos de teste (cf. Figura 2A, à esquerda). Estímulos de teste subsequentes podem ser apresentadas em qualquer randomizados ou não-ranfim randomizado. Se você estiver usando uma abordagem não-randomizado (por exemplo, um nível de estímulo teste fixada para todas as freqüências testadas) permitir que 5 min de recuperação entre as séries de estímulos diferentes. Note-se que o limiar determinado absoluta dependerá da aleatorização dos estímulos, mas possíveis deslocamentos relativos de limiar não (por exemplo, após trauma acústico, cf. Ref. ^5).
4. Antes de analisar os dados, remover ensaios inválidos de conjunto de dados (por exemplo, ensaios em que o animal se movia antes do estímulo; sobressalto. Cf Figura 2B).
5. Dentro de uma janela de tempo do primeiro 50 ms após o estímulo de sobressalto, calcular a amplitude de resposta (pico a pico entre o primeiro máximo para o primeiro mínimo de resposta) e latência de resposta (tempo desde o início do estímulo até ao início da resposta) de cada ensaio individual .
6. Montar um Boltzmann-função com os dados de resposta completa amplitude definidos de uma freqüência classificados para prestimulus intensidade para todos singl válidoensaios e. O ponto de 50% dos ⁷ Boltzmann-função indica o limiar auditivo para esta freqüência de estimulação.

3. Trauma acústico e Quantificação de Deficiência Auditiva

1. Prepare cetamina-xilazina anestesia com uma mistura de cloridrato de cetamina: 96 mg / kg (Ketamina ratiopharm Ratiopharm); cloridrato de xilazina: 4 mg / kg (Rompun 2%, Bayer), sulfato de atropina 1 mg / kg (Atropinsulfat, B. Braun Melsungen AG) e de solução de NaCl fisiológica (Berlin-Chemie AG, Berlim), com uma proporção de 9:1:2:8.
2. Injectar o animal com 3 ml / kg de anestesia por via subcutânea. Aguarde até que o animal é anestesiado profundamente (cerca de 5 min, verificar reflexos, por exemplo, usar o reflexo de retirada do pedal). Para manter a anestesia, durante as medições, continuamente injectar a solução de anestésico a um ritmo de 3 ml / kg / hr usando uma bomba de seringa. Controlar os sinais vitais com equipamento adequado (por exemplo, respirando através de câmera) e manter a quente animal por placing-lo em uma almofada de aquecimento.
3. Induzem um trauma acústico, por exemplo, usando um tom alto pura: 2 kHz por exemplo, em 115 dB SPL durante 75 minutos.
4. Após o fim do trauma parar a bomba de seringa e deixar o animal desperto em uma gaiola de despertar numa almofada de aquecimento para um local silencioso. Verifique regularmente durante a fase de despertar, se os sinais vitais estão estáveis. Colocar o animal em sua gaiola para casa apenas quando ele está completamente acordado. Deixe o animal recuperar da anestesia (em menos de 2 dias) e de descanso, na sua gaiola de origem.
5. Executar 2,1-2,6 novamente. Comparar os limiares auditivos antes e depois do trauma acústico, calculando o percentual de perda de audição em cada freqüência. Após o final de todas as experiências de forma indolor eutanásia do animal.

4. Teste para Percepção Fantasma Acústico (Subjetiva zumbido)

1. Realizar estas medições antes e depois do trauma acústico.
2. Siga 2,1-2,2 se o animal já não está na configuração.
3. A number de paradigmas de estimulação pode ser utilizado para testar os roedores para o zumbido subjectiva. A proporção de todas estas abordagens é para testar a saliência de uma lacuna silenciosa dentro de um ruído de fundo. Se a folga é percebido pelos animais, ele pode ser usado como um estímulo de teste para reduzir a resposta de sobressalto forma análoga ao processo descrito em 2. Se o animal sofre de zumbido (que é susceptível de se desenvolver após trauma acústico), este zumbido será percebido dentro da abertura silenciosa e, por conseguinte, faz com que a abertura inferior saliente. O efeito da diferença da resposta de sobressalto consequentemente vai ser mais fraco em comparação com os animais do zumbido controles saudáveis ​​(PPI reduzida, cf. ^8). Esta percepção é testada com dois protocolos ligeiramente diferentes.
4. No paradigma zumbido primeiro subjetiva apresentado aqui (. Figura 2A, centro, cf ⁹⁾ utilize os seguintes parâmetros para a estimulação: intensidade de som de sobressalto 105 dB SPL com freqüências de 1 a 16 kHz em passos de 1 oitava, Stimulnos comprimento de 6 ms incluindo 2 ms aumento cosseno-quadrado e rampas de queda. Apresentar um ruído de fundo branco de 50 dB SPL durante a experiência, com ou sem um intervalo ms 15 que precede o estímulo de sobressalto em 100 ms; presente em pelo menos 15 ensaios para cada frequência e intervalo condicionado. Se estiver usando uma abordagem não-randomizado, permitir que 5 min de recuperação entre os conjuntos de estímulos diferentes. Utilização de diferentes freqüências de estímulo sobressalto vai dar uma estimativa aproximada da frequência do zumbido percebido.
5. Como paradigma zumbido segunda subjetiva (Figura 2, à direita) você pode usar os seguintes parâmetros de estimulação: intensidade do som de sobressalto 105 dB SPL, clique duas vezes estímulo com 0,1 ms de duração por clique e 0,1 ms entre os cliques, o segundo clique com o sentido invertido em comparação com o primeiro. Apresentar uma passagem de banda de ruído de fundo de filtrado 50 dB SPL, com uma largura de filtro gaussiano 0,5 oitavas e frequências centrais variam de 1 a 16 kHz em incrementos de uma oitava. Apresentar esta ei ruídother com ou sem um intervalo ms 15 que precede o estímulo de sobressalto em 100 ms; presente em pelo menos 15 ensaios para cada frequência e intervalo condicionado. Se estiver usando uma abordagem não-randomizado, permitir que 5 min de recuperação entre os conjuntos de estímulos diferentes. Utilização de frequências centrais diferentes do ruído de fundo banda vai dar uma estimativa aproximada da frequência do zumbido percebido.
6. Siga 2,4-2,5; normalizar todos os dados adquiridos com um conjunto de dados de referência fixados para cada freqüência testada e cada condição de trauma, ou seja, antes e depois de um trauma acústico.. Esta referência é a amplitude da resposta ao estímulo de tom puro sem qualquer sobressalto prestimulus (cf. 2.3). A frequência é determinada tanto pelo tom puro ou a frequência central da passagem de banda do ruído filtrado. Calcula-se a resposta média de cada referência e normalizar cada amplitude de resposta calculado dividindo-se através da sua referência.
7. Calcular PPI dividindo as amplitudes de resposta normalizados da conditio lacunan através da média da condição nenhuma diferença normalizada de cada frequência testadas.
8. Calcule a variação PPI após o trauma em porcentagem para cada freqüência testada.

As respostas de alarme de animais são fáceis de gerar e analisar. Figura 2B apresenta uma visão geral de um resultado típico de um animal estimulado com um tom puro de 105 dB SPL sem qualquer prestimulus por 15 vezes. A maioria dos estudos são ensaios válidos e inválidos são fáceis de reconhecer (ensaios marcados por quadrado vermelho). As amplitudes de resposta e latências são calculados apenas a partir de ensaios válidos.

Uma mudança comportamental limiar típico é dado na Figura 3A. O audiograma de um animal exemplar adquirido com o método descrito no ponto 2 é dada antes (azul) e após (vermelho) um trauma acústico a 2 kHz (área amarela). A perda de audição clara é mostrado especificamente a 2 kHz. As respostas relacionadas com a percepção subjectiva zumbido pode servisto na Figura 3B, as amplitudes de resposta normalizados do mesmo animal tal como acima são mostrados exemplarmente para estimulações uma oitava abaixo e acima do trauma, tal como descrito em 4.5. A comparação das respostas a estímulos com e sem lacunas antes (azul) e depois do trauma (vermelho) permite a interpretação de uma possível percept zumbido. Abaixo da frequência de trauma sem alteração do padrão de resposta pode ser encontrada acima enquanto o trauma do efeito da diferença desapareceu após o trauma, o que indica uma mispercept a esta frequência.

Figura 1. Diagrama de fluxo do programa utilizado para adquirir os limiares comportamentais e dados subjetivos zumbido. Note-se que esta é apenas uma versão simplificada do código do programa. Abreviaturas: GUI - interface gráfica do usuário; ISI - intervalo de estímulo inter.

Figura 2. Auditivas resposta de sobressalto (ASR) estímulos. A Esquemas de três diferentes protocolos de estimulação utilizada. Painel esquerdo: pulso pré-inibição (PPI) da ASR, medido sem qualquer estímulo puro tom de teste antes (verde) o tom de sobressalto (vermelho), o prazo de resposta é representado em azul. Painel central: gap / paradigma ruído com apresentação do estímulo puro tom de sobressalto de freqüências diferentes em um fundo de ruído branco. Painel direito: gap / ruído de paradigma com apresentação do estímulo clique em sobressalto banda filtrada fundo de frequências centrais diferentes respostas auditivas B exemplares sobressalto de 15 ensaios gravados com o paradigma limite sem qualquer prestimulus em uma freqüência de estimulação kHz.. Três ensaios são contados inválidos (quadrados vermelhos) como o animal se movia já antes do início da estimulação.

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Figura 3. Resultados exemplares de ASR em um animal. Um limiar Behavioral antes (azul) e após (vermelho) a trauma acústico, 2 kHz (área amarela). Os limiares são calculados a partir das respostas ao protocolo ASR PPI modulada usando a função-Boltzmann ponto de viragem como valor de limiar. Note-se que a perda auditiva em duas quantidades kHz para mais de 66%, enquanto farer longe da freqüência de um trauma, muitas vezes pode ver até mesmo melhora dos limiares auditivos B amplitudes de resposta normalizada (círculos abertos:. Ensaios individuais, círculos preenchidos: meios, bigodes: desvio padrão) durante a estimulação com o intervalo / ruído de clique ASR protocolo (4,5) para 1 e 4 kHz frequências centrais. As respostas são classificadas para os ensaios sem e com abertura no ruído antes e depois do trauma a 2 kHz. Apenas a 4 kHz o efeito da diferença desaparece após o trauma que indica uma percepção subjectiva zumbido em torno destafreqüência.

Discussion

Nós apresentamos uma instalação fácil e barato de construir para medições audiométricos em roedores com base em pré-pulso de inibição de respostas de alarme acústicos que podem ser utilizados para determinar os limiares auditivos comportamentais (= audiogramas ¹⁰⁾ e perceptos auditivas fantasma como zumbido subjetivo ^11. Especialmente as medições posteriores estão no foco de vários relatórios recentes ^8,12,13,14 e pode ser vista como um pré-requisito para as investigações electrofisiológicas dos mecanismos neuronais subjacentes a esta doença. Usando este método, é possível diferenciar qual os animais se desenvolver um zumbido subjetivo percepcionar após o trauma acústico e aqueles que não o fizeram, e depois continuar a investigar estes indivíduos, por exemplo, com registros eletrofisiológicos no córtex auditivo primário.

Um passo fundamental na análise dos dados de sobressalto após trauma acústico é a normalização dos dados para a amplitude de sobressalto que podemaximamente ser atingida sem precedentes estímulo teste: Isto é particularmente importante para distinguir reduzidos respostas de alarme com base na perda de audição reduzida PPI em animais zumbido: Os efeitos do trauma acústico estão mudando ao longo do tempo, como o animal se recupera parcialmente a partir dele, mas cerca de 50 % da perda de audição é permanente. Em contraste com os relatórios referidos acima, em que os limiares de audibilidade são testadas, mas não utilizados para a calibração, tentou-se minimizar os efeitos dos limiares de audibilidade diferentes de cada uma das frequências e o efeito do trauma acústico si através da normalização de cada amplitude de resposta com uma referência. Além disso, usamos dois tipos diferentes de protocolos para avaliar qualquer percepção do zumbido, com o primeiro (4,4) a trabalhar melhor para os animais testados em escalas de tempo mais longos de uma semana após o trauma e se o segundo "clássico" (4,5), trabalhando melhor para os animais testados dentro uma semana após o trauma.

Uma limitação deste método é clearly que não se pode avaliar os efeitos agudos de um trauma acústico. Pelo menos dois dias entre a anestesia e a primeira medição pós-deve ser escolhida, tal como o animal tem de recuperar a partir dele. Para obter uma estimativa da perda de audição aguda imediatamente após o trauma, a audiometria de tronco cerebral (BERA) pode ser usado.