Summary
Qui descriviamo una lettura molecolare di lungo termine dell'adattamento olfattivo
Abstract
Durante la stimolazione prolungata più neuroni sensoriali si adatterà la loro risposta diminuendo la loro sensibilità al segnale. La risposta di adattamento aiuta attenzione la forma e protegge anche le cellule provenienti da oltre-stimolazione. Adattamento nel circuito olfattivo di C. elegans è stato descritto da Colbert e Bargmann 1,2. Qui, gli autori hanno definito i parametri del paradigma adattamento olfattivo, che hanno usato per la progettazione di uno screening genetico di isolare mutanti difettosi nella loro capacità di adattarsi agli odori volatili rilevati dalle Amphid cellule alari di tipo C (AWC) neuroni sensoriali. Quando tipo selvatico C. elegans animali sono esposti a un interessante AWC-sentito odore 3 per 30 minuti che si adatterà la rispondenza alle l'odore e quindi ignorare l'odore adattando in un saggio di chemiotassi comportamentale per ~ 1 ora. Quando tipo selvatico C. elegans animali sono esposti a un interessante AWC-sentito odore di ~ 1 ora saranno quindi ignorare l'odore di adattare di achemotaxis test comportamentali per circa 3 ore. Queste due fasi di adattamento olfattivo in C. elegans sono stati descritti come breve termine l'adattamento olfattivo (indotta dopo 30 minuti di esposizione odore), ea lungo termine adattamento olfattivo (indotto dopo 60 minuti di esposizione odore). Più tardi lavorare da L'Etoile et al., 4 scoperto una proteina chinasi G (PKG) chiamato EGL-4 che è necessario sia per l'adattamento a breve e lungo termine nei neuroni olfattivo AWC. Il-4 EGL proteina contiene una sequenza di localizzazione nucleare che è necessario a lungo termine risposte di adattamento olfattive, ma non indispensabili per il breve termine, le risposte di adattamento olfattivo nel AWC 4. Taggando EGL-4 con una proteina fluorescente verde, è stato possibile visualizzare la localizzazione di EGL-4 nel AWC durante l'esposizione prolungata odore. L'utilizzo di questo completamente funzionale GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) molecola siamo stati in grado di sviluppare una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel AWC 5. Utilizzando questo mlettura olecular di adattamento olfattivo siamo stati in grado di eseguire entrambi gli schermi in avanti e all'indietro genetici per identificare gli animali mutanti che presentano i modelli difettosi localizzazione subcellulare di GFP :: EGL-4 nel AWC 6,7. Qui si descrive: 1) la costruzione di GFP :: EGL-4 animali che esprimono, 2) il protocollo per la coltivazione di animali a lungo termine saggi traslocazione odore indotta nucleari, e 3) il punteggio di lungo termine odore indotta traslocazione evento nucleare e il recupero (ri-sensibilizzazione) dal nucleare GFP :: EGL-4 Stato.
Protocol
1. Costruzione di GFP Tagged EGL-4 Animali Esprimere
- Clonare il traslazionale fusione GFP :: EGL-4 sotto il promotore per l'ODR-3 gene (uso 2678 bp direttamente a monte del codone di inizio): (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4. L'ODR-3 unità promotore espressione nelle coppie neurone amphid: AWA, AWB, AWC e debolmente in ASH.
- Iniettare il plasmide (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4 in di tipo selvatico (N2) gli animali a 50 ng / mL con i co-iniezione utilizzando le normali marcatori della linea germinale tecniche di trasformazione 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / pl), e (p) ODR-1 :: DsRed 10 (25 ng / pl). L'ODR-1 espressione promotore unità nel AWC e AWB amphid coppie di neuroni, e la-1 ofm espressione promotore unità negli coelomocytes.
- Sottoporre gli animali transgenici che esprimono le matrici extracromosomici descritti al punto 1.2 per la ultravioletti (UV) / trimethylpsoralen (TMP), il protocollo di integrazione11.
- Bleach sincronizzare gli animali 12 e coltivarli in Nematode crescita media (NGM) piastre contenenti OP50 E. coli alla fase L4. Lavare L4 animali in piatti NGM con M9 tampone per rimuovere OP50 E. coli batteri.
- Rimuovere tampone M9 e aggiungere 50-100 ml di 30 mg / ml soluzione TMP lavoro sul verme pellet nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Avvolgere la provetta 1,5 ml in un foglio di bloccare la luce ambiente, e agitare delicatamente su un mixer per 15 minuti nella pellicola protettiva provetta 1,5 ml microcentrifuga. Trasferire i vermi nel TMP / worm soluzione ad un grande piatto NGM testa di serie.
- Esporre i vermi sulla piastra NGM ai raggi UV 350 μJ (X100) utilizzando un Stratalinker 2400. Quindi aggiungere i vermi ad una piastra contenente OP50 NGM e incubare al buio per 5 ore.
- Scegli 50 vermi transgenici a circa 10 piastre di teste di serie (2-5 vermi ogni piastra). Trasferimento P0 è a piatti nuovi ogni 24 ore per 3 giorni.
- Scegli 250 F1 clonale unnimals (1 animale per piastra). Clone out 2-4 animali F2 da F1 ogni piatto. Controllare animali F3 per cercare una linea di trasmissione 100% cercando in (p) ofm-1 :: pattern di espressione GFP sotto un microscopio da dissezione fluorescente.
- Outcross la riga finale integrato (s) con gli animali di tipo selvatico N2 5 volte. Si farà riferimento alla linea finale integrato di pyIs500, e la GFP-tagged EGL-4 molecola come GFP :: EGL-4.
2. La coltivazione e la manutenzione degli animali da saggi traslocazione nucleare
- Coltivate le pyIs500 animali a 25 ° C su piastre standard di 10 centimetri NGM (vedi sotto per ricetta) seminato con OP50 E. coli 13 (Figura 1).
- Il giorno 1, scegliere 4-5 L4 pyIs500 animali da piastre coltivate a 25 ° C su cinque distinti 10 centimetri OP50 E. coli seminato piastre e incubare a 25 ° C (cioè, L4 4-5 animali per piastra).
- Il giorno 4, lavare adulto populations di pyIs500 animali al largo delle piastre NGM di grandi dimensioni utilizzando S-basale del buffer (vedi sotto per ricetta). Utilizzare pipette in vetro usa e getta per trasferire gli animali, in quanto si attaccano al lato della puntali in plastica.
3. A lungo termine indotta Odore saggi traslocazione nucleare
- Lavare le pyIs500 animali 3 volte in S-basale per rimuovere i batteri. Non centrifugare animali tra un lavaggio, ma piuttosto permettere agli animali di stabilirsi per gravità in un fermo 1,5 ml microcentrifuga tubo. E 'fondamentale per garantire tutti i batteri viene rimosso, e che i paté NGM sono esenti da contaminazione, i batteri residui influenzerà negativamente l'esito del test traslocazione. Inoltre, abbiamo trovato che la sterilizzazione in autoclave le provette da 1,5 ml microcentrifuga produce una proprietà "appiccicoso" sulle pareti interne del tubo che causa gli animali di aderire alle pareti, ed utilizzare quindi non autoclave provette da 1,5 ml microcentrifuga.
- Mentre gli animali si stanno stabilendo tra un lavaggio, portare tegli adattamento soluzione. Aggiungere 100 ml di S-basale buffer su un cilindro graduato da 100 ml laurea. Aggiungi adattamento odore della S-basale e sigillare il cilindro con una striscia di parafilm. Se si esegue l'adattamento benzaldeide aggiungere 7,5 ml di benzaldeide a 100 ml di S-Basal, per l'adattamento butanone aggiungere 11 ml di 2-butaone a 100 ml di S-Basal. Capovolgere delicatamente (non agitare) il cilindro laurea contenente S-basali e l'odore 30 volte per creare una emulsione uniforme.
- Dopo l'ultimo lavaggio in S-basale, permettere agli animali di risolvere e rimuovere tutto il liquido. Etichettare una provetta "+ ve" o "adattare" e l'altro tubo "-ve" o "unadapt". Poi aggiungere 1 ml della miscela di adattamento alla provetta adattamento (+ ve), e aggiungere 1 ml di S-basale al tubo disadattato microcentrifuga di comando (-ve). Cercate di mantenere il numero di animali tra 100 e 200 in ciascun tubo. Con una certa pratica, è possibile stimare il numero approssimativo di animali in un pellet ad occhio.
- Inserire un 1,5 ml microcentrifuga tubo tappo di protezionead ogni provetta (impedisce coperchi da aperto popping) e posizionare i tubi su un rotatore per 80 min. Abbiamo trovato che l'esposizione odore tra 60 min e 80 min produce risultati simili (sia risultato a lungo termine risposte di adattamento). Tuttavia, l'80 minuti di esposizione offre risultati più coerenti nelle nostre mani. Quindi tutti i nostri saggi a lungo termine di adattamento sono standardizzati utilizzando un odore di esposizione 80 min (Figura 2).
- Dopo 80 minuti, lavare gli animali 3 volte in S-basale. Consentire agli animali di risolvere per gravità tra ogni lavaggio.
4. A breve termine Odore indotte saggi traslocazione nucleare
- In caso di breve termine dell'adattamento odore, utilizzare lo stesso protocollo per lungo termine saggi traslocazione odore indotte (Fasi 3,1-3,4), ma invece di incubazione delle pyIs500 animali nell'adattare odori per 80 min, utilizzare una esposizione 30 min . La quantificazione di odore indotte saggi traslocazione nucleare descritta di seguito (Passaggio 5) è lo stesso per lungo e breve term esposizioni.
5. Segnare l'Odore indotto degli eventi nucleari Traslocazione
- Fai 2% pastiglie agarosio contenenti 5 mM sodio azide (NaN 3) sciogliendo elettroforesi su gel di agarosio in dH 2 0. Mettere una goccia di agarosio fuso contenente NaN 3 su un vetrino per microscopio. Porre immediatamente un altro vetrino da microscopio di vetro sulla prima diapositiva per appiattire la goccia di agarosio fuso. Lasciare agire per 30 secondi, e poi delicatamente prendere in giro a parte la vetrini lasciando un vetrino da microscopio con un tampone piatto agarosio di circa 1 mm.
- Dopo l'ultimo lavaggio in S-basale, permettere ai vermi di stabilirsi nel tubo 1,5 ml microcentrifuga e rimuovere tutto il liquido. Quindi aggiungere gli animali goccia a goccia sui pad agarosio di vetrini da microscopio diversi. E 'importante mantenere il numero di animali per ogni diapositiva a tra 50 e 100. Troppi animali per vetrino si complicano punteggio e spesso creano un bagliore spargendo dopo blu-luce di eccitazione. Liquido in eccesso puòessere cattivi dai pad agarosio con un piccolo Kim-wipe. Collocare un bicchiere 0,5 millimetri copertura antiscivolo sul tampone e lasciare riposare per 2 min per consentire l'NaN 3 per immobilizzare gli animali. Nota, gli animali possono essere recuperato presso le diapositive dopo aver segnato. Gli animali si riprenderà dal 3 NaN anestetico dopo ~ 1 ora in caso di cessione di una piastra NGM seminato in una goccia di tampone M9.
- A questo punto è indispensabile che ogni sperimentatore elaborare una chiave per tenere traccia che scorrono è sperimentale (+ ve) diapositiva e che scorrono è il controllo (-ve) slitta, e passare le diapositive ad un'altra persona che ciecamente segnerà il GFP: EGL-4 modello di localizzazione. Ciò permette di controllare per ogni pregiudizio sperimentatore.
- Punteggio compreso tra 50 e 100 capi per vetrino utilizzando un microscopio a fluorescenza in posizione verticale con gli obiettivi di ingrandimento 10X, 40X e 63X e GFP / RFP filtri. In primo luogo, individuare gli animali a 10 ingrandimenti con campo chiaro illuminazione. In secondo luogo, individuare il neurone AWC spegnendo il bright-campo di illuminazione e utilizzando il filtro RFP. I (p) ODR-1 :: unità DsRed espressione in AWB e neuroni AWC. I neuroni hanno AWC distintivi corpi cellulari di forma ovale rispetto AWB corpi cellulari che sono più piccoli e di forma circolare (Figura 2).
- Una volta che il corpo cellulare AWC è stato localizzato, passare al filtro GFP e registrare la localizzazione di GFP: EGL-4 come nucleare o citoplasmatico. Utilizzando un contatore permette di mantenere lo sperimentatore guardare nell'oculare mentre segnando la diapositiva. Nota: 5,1-5,5 passaggi vengono ripetuti almeno 3 volte in giorni diversi per ottenere dati statisticamente significativi (figure 1-2).
6. Il monitoraggio GFP-tagged EGL-4 durante il recupero da lungo termine adattamento Odore
- Passo dopo 3,5, dividere le popolazioni di animali pyIs500 in aliquote multiple e punteggio per GFP nucleare rispetto citoplasmatica :: EGL-4 nel AWC punto al tempo zero (cioè, dopo 80 minuti di esposizione) ed multiple punti temporali successivi (Figura 3).
- Trasferire sia il controllo (-ve) e sperimentali (+ ve) animali con pipette in vetro usa e getta su piastre NGM.
- Consentire agli animali di recuperare per varie lunghezze di tempo e di riesaminare la localizzazione di GFP :: EGL-4in AWC ad ogni tempo, come nei passaggi 5,1-5,5.
7. Materiale
Piastre NGM: Per 1 L aggiungere a 1 L DDH 2 0: 21 g Bacto-agar, 3 g Cloruro di sodio (NaCl), 2,5 g Bacto-peptone. Autoclave Media. Dopo la sterilizzazione in autoclave, raffreddare l'agar fino a quando la temperatura indica 54 ° C. Aggiungere le seguenti soluzioni: 25 ml 1M tampone fosfato di potassio, 1 ml 1 M di solfato di magnesio (MgSO4), 1 ml 1 M di cloruro di calcio (CaCl 2); 1 colesterolo ml in etanolo (5 mg / ml di brodo).
1 M bibasico K 2 HPO 4 174,2 g / mol: Per 500 ml: In 400 ml DDH 2 O, sciogliere 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Regolare il volume a 500 L con DDH 2 O. Filtrare sterilizzare con un 500 ml Unità di filtro sterile.
1 M monobasico di KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Per 1 L: In 800 ml DDH 2 O, sciogliere 136,1 g monobasico di KH 2 PO 4. Regolare il volume a 1 L con DDH 2 O. Filtrare sterilizzare con un 500 ml Unità di filtro sterile.
1 M fosfato di potassio (K 3 PO 4) pH 6.0: Per 1 L: In una unità 1 L filtro sterile, aggiungere 868 ml di 1 M monobasico di KH 2 PO 4. Permettere all'unità di filtrare, poi aggiungere 132 ml di 1 M bibasico K 2 HPO 4. Permettere all'unità di filtrare tutto il liquido. Rimuovere l'unità di filtro e aggiustare il pH a 6,0. Conservare a temperatura ambiente.
S-basale: Per 1 L: aggiungere 50 ml 1M K 3 PO 4 tampone, pH ~ 6.0, e 20 ml di NaCl 5M aq. Riempire a 1 L conDDH 2 O. Autoclave soluzione.
M9: Per 1 L: 3 g KH 2 PO 4, 6 g di Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O. Riempire a 1 L con DDH 2 0. Sterilizzare in autoclave.
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Representative Results
Un esempio del modello di localizzazione GFP :: EGL-4in l'AWC prima e dopo esposizione prolungata odore è mostrato in Figura 2. Prima dell'esposizione prolungata odore, GFP :: EGL-4 è localizzato al citosol della AWC (Figura 2B), e dopo 80 minuti di esposizione GFP odore :: EGL-4 è localizzata nel nucleo della AWC (Figura 2D). A livello comportamentale, gli animali con citosolica GFP :: EGL-4 in AWC sono attratti da una sorgente puntiforme di odore (Figura 2C rappresenta graficamente i risultati rappresentativi di saggi di chemiotassi di animali adattate - notare l'indice di chemiotassi 3 è prossimo a 1). Gli animali che presentano nucleare GFP :: EGL-4 nel AWC non sono attratti da una sorgente puntiforme di adattare l'odore (grafici 2E Figura risultati rappresentativi di saggi di chemiotassi di animali adattati - notare l'indice di chemiotassi è vicino a zero). Per generare i dati statisticamente significativi da odori indotti saggi traslocazione nucleare,gli esperimenti devono essere eseguite almeno 3 volte e in giorni diversi. Per una descrizione dettagliata del saggio di chemiotassi può essere utile riferirsi Jové articolo 2490 14.
Una volta EGL-4 entra nel nucleo dei neuroni AWC provoca cambiamenti stabili e duraturi nella fisiologia AWC che persistono anche quando EGL-4 non è più nel nucleo (Figura 3). Dopo 80 min di esposizione animali odore ignorerà una sorgente puntiforme di dell'odore di adattamento (Figura 3 pannello superiore, barra luminosa a sinistra), e questo adattamento persisteranno anche dopo 120 minuti di recupero (Figura 3 pannello superiore, barra luminosa a destra). Dopo 80 min di esposizione GFP odore: EGL-4 si osserva nel nucleo della AWC (Figura 3 pannello inferiore, bar luce sinistra). Questa voce nucleare è necessaria e sufficiente per indurre a lungo termine adattamento in AWC 5. Dopo 120 minuti di recupero, questi animali non esporre nucleare GFP :: EGL-4 (Figura 3 pannello inferiore, barra luminosa a destra) ma continua a ignorare una sorgente puntiforme della benzaldeide odore adattamento a livello comportamentale.
Figura 1. Panoramica del protocollo a lungo termine saggi traslocazione odore indotta nucleari. In primo luogo, gli animali esprimenti GFP :: EGL-4 (pyIs500 animali) vengono coltivate a 25 ° C su piastre NGM seminate con OP50 E. coli. In secondo luogo, gli animali sono esposti a una miscela odore adattamento (gruppo sperimentale) o S-Basal buffer (gruppo di controllo). In terzo luogo, gli animali sono segnati ciecamente contando il numero di animali che presentano nucleare GFP :: EGL-4 nel AWC e il numero di animali che presentano citoplasmatica GFP :: EGL-4 nel AWC.
Figura 2. et al. 6 figura 2B. Prima di esposizione prolungata odore, GFP :: EGL-4 è localizzato al citosol della AWC. Figura 2C. A livello comportamentale, gli animali con citosolica GFP :: EGL-4 in AWC sono attratti da un punto di acidoce di odore. Questo grafico è stato generato dai risultati di saggi di chemiotassi rappresentativi di animali adattate. Nota: l'indice di chemiotassi è vicino a 1. Figura 2D. Dopo 80 minuti di esposizione GFP odore :: EGL-4 è localizzato il nucleo del AWC. Figura 2E. Animali espositrici nucleare GFP :: EGL-4 nel AWC non sono attratti ad una sorgente puntiforme di adattare l'odore. Questo grafico è stato generato dai risultati di saggi di chemiotassi rappresentativi di animali adattati. Nota L'indice chemiotassi è vicino a zero.
Figura 3. Una volta EGL-4 entra nel nucleo dei neuroni AWC provoca cambiamenti stabili e duraturi nella fisiologia AWC che persistono anche quando EGL-4 non è più nel nucleo. Gli animali esposti a odore (80 min) sono autorizzati a recuperare dalla esposizione a lungo termine odore e ha ottenuto per citoplasmatica contro nuclearelocalizzazione di GFP :: EGL-4. (Pannello superiore) Dopo 120 minuti di recupero gli animali che sono stati esposti a odori per 80 min sono ancora adattati a livello comportamentale. (Pannello inferiore) Dopo animali min 120 di recupero che sono stati esposti a odore per 80 min non esporre nucleare GFP :: EGL-4. Così, nucleare EGL-4 richiama stabili durevoli cambiamenti nella fisiologia della AWC che persistono dopo EGL-4 non è più nel nucleo. Figura viene modificato con il permesso di Lee et al. 5. Figura 3 pannello superiore. Dopo 80 min di esposizione animali odore ignorerà una sorgente puntiforme di adattare l'odore, e questo adattamento persisteranno anche dopo 120 minuti di recupero. Figura 3 pannello inferiore. Dopo 80 min di GFP odore esposizione :: EGL-4 si osserva nel nucleo della AWC. Questa voce nucleare è necessaria e sufficiente per indurre a lungo termine adattamento nel AWC. Dopo 120 minuti di recupero, questi animali non esporre nucleare GFP :: EGL-4 ma ancora ignora un punto soldoRCE della benzaldeide odore adattamento a livello comportamentale.
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Discussion
L'odore indotta ingresso nucleare di GFP-tagged EGL-4 molecola qui descritta fornisce una lettura solida molecolare di adattamento olfattivo in C. elegans. L'odore indotte saggi traslocazione nucleare sono semplici e richiedono solo pochi giorni di tempo di preparazione. Il pyIs500 animale che abbiamo costruito per questi test, esprime un marcatore che illumina il neurone AWC oltre ad esprimere la GFP-tagged EGL-4 proteine. Pertanto, riteniamo che uno sperimentatore con poca o nessuna esperienza di lavoro con questa classe di neurone può molto rapidamente (forse dopo aver esaminato una dozzina di animali) cominciano a sentirsi a proprio agio identificare la cella corretta e il punteggio per il nucleare contro citoplasmatica EGL-4. Può essere utile per il lettore di riferimento Jové articolo 835 che descrive l'analisi GFP in C. elegans 15.
Per garantire che i dati generato è di alta qualità, suggeriamo le seguenti linee guida:1) tutti i punteggio deve essere fatto alla cieca; 2) piastre di coltura contenenti alcuna traccia di contaminazione (funghi e batteri) non possono essere utilizzati; 3) worm che fame sperimentato durante la coltivazione non devono mai essere utilizzati, e 4) miscele di adattamento devono essere fresco su il giorno di sperimentazione.
Tutti i sistemi sensoriali mostrano esempi di plasticità neuronale. La trasmissione di segnali al nucleo è una caratteristica altamente conservata di forme stabili di plasticità neuronale 16. Sviluppando una lettura molecolare di plasticità olfattiva che rappresenta una traslocazione nucleare di PKG in neuroni stimolati, forniamo una piattaforma per dissezione rapida e dettagliata di plasticità neuronale all'interno di un modello in vivo. Utilizzando il nostro lettura molecolare di adattamento olfattivo abbiamo iniziato a descrivere alcuni degli eventi che determinano l'adattamento olfattivo in C. elegans 5,6,7. Tuttavia, questo è solo un inizio, e studiando questo processo in funzione di unge, il sesso, l'infezione, o la dieta possiamo scoprire temi importanti di plasticità neuronale a livello di circuito e sistemi.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Scott Hamilton, ed i membri del laboratorio di O'Halloran per la lettura attenta di questo manoscritto. Ringraziamo anche il nostro anonimo recensore per eccellenti suggerimenti e commenti penetranti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | DF0140-07-4 | NGM plates |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S671-10 | NGM plates |
| Bacto Peptone | Difco | DF0118-07-2 | NGM plates |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S375-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Kimwipes - Small | Kimberly-Clark | LS2770 | |
| Ethanol 100% | Gold Shield Chemical Co. | 43196-115 | diluting odors for chemotaxis assays |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C8106-500G | NGM plates |
| Magnesium Sulphate | MP Biomedicals | 150136-500G | NGM plates |
| Sodium Azide 99% | Fisher Scientific | ICN10289180 | Anesthetic |
| Agarose - UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Agarose pads |
| Benzaldehyde | Sigma-Aldrich | B1334-100G | AWC odor |
| Butanone, ACS Grade | Sigma-Aldrich | 360473-500ML | AWC odor |
| Microcentrifuge Tubes - 1.5 ml Colored | Denville | LS8147 | |
| Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4" | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | UV integration |
| Filter Vacuum Bottle - 500 ml | Nalgene | 09-740-25B |
References
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