Summary
Questo studio descrive le procedure di creazione di un nuovo assone neuronale e (astro) glia co-coltura piattaforma. In questo sistema di co-coltura, la manipolazione di interazione diretta tra un singolo assone (e singole cellule gliali) diventa possibile, consentendo l'analisi meccanicistica del neurone reciproco segnalazione gliali.
Abstract
Neurone propria interazione glia è fondamentale per funzione fisiologica del sistema nervoso centrale (CNS). La comunicazione bidirezionale è sofisticato mediata da specifiche vie di segnalazione tra neuroni e glia 1,2. Identificazione e caratterizzazione di queste vie di segnalazione è essenziale per la comprensione di come l'interazione neurone a glia forme CNS fisiologia. In precedenza, le colture di neuroni e glia misti sono stati ampiamente utilizzati per il test e la caratterizzazione di vie di segnalazione tra neuroni e glia. Quello che abbiamo imparato da questi preparativi e altri strumenti in vivo, tuttavia, ha suggerito che la segnalazione reciproci tra neuroni e glia sono presentati spesso in settori specifici all'interno dei neuroni (cioè, assoni, dendriti, o soma) 3. Per questo è importante per sviluppare un nuovo sistema di cultura che permette la separazione dei compartimenti neuronali ed esamina in particolare l'interazione tra glia e neuronali assoni / dendriti. Inoltre, il sistema convenzionale coltura mista non è in grado di differenziare i fattori solubili e segnali in membrana di contatto tra neuroni e glia. Inoltre, la grande quantità di neuroni e cellule gliali del convenzionale sistema di co-coltura manca la risoluzione necessaria per osservare l'interazione tra un singolo assone e cellule gliali.
In questo studio, si descrive un assone romanzo e glia sistema di co-coltura con l'uso di una piattaforma microfluidica cultura (MCP). In questo sistema di co-coltura, neuroni e cellule gliali sono coltivati in due camere separate che sono collegati attraverso molteplici canali centrali. In questa piattaforma microfluidica cultura, solo i processi neuronali (soprattutto assoni) può entrare nel lato gliali attraverso i canali centrali. In combinazione con potente etichettatura proteina fluorescente, questo sistema permette esame diretto di percorsi di segnalazione tra interazioni assonali / dendritiche e gliali, tales assone-mediata regolazione trascrizionale nelle cellule gliali, glia-mediata traffico recettore in terminali neuronali e glia-mediata della crescita degli assoni. Il diametro ridotto della camera vieta anche significativamente il flusso del neurone arricchito medio nella camera gliale, facilitando sondaggio della diretta membrana-proteina tra assoni / dendriti e superfici gliali.
Protocol
1. Assemblea della Camera Cultura Microfluidic (MCP)
- MCP (Figura 1) sono progettati per cavità si aprono culture compartimenti di diversi tipi di cellule 4. Ha tipicamente due compartimenti che sono collegati attraverso i canali centrale (3 mm di diametro). Montaggio di MCP con fondo di vetro piatti è necessario per la preparazione di culture e l'analisi di immagini successive.
- Primo, cappotto sterili fondo di vetro piatti con Polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) sciolto in tetraborato di sodio (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8,5) e sono state incubate per una notte a 37 ° C.
- Il giorno seguente, il fondo di vetro rivestite piastre sono state lavate tre volte con DDH 2 O ed essiccato sotto cappa sterile fumi. I fondo di vetro piatti erano poi ulteriormente rivestito con laminina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) ed essiccati sotto luce UV per 1 ora. Piatti rivestiti sono pronti all'uso o può essere conservato a -20 ° C fino all'uso. Questi un rivestimentori necessari per neuroni e astrociti placcatura in co-coltura.
- Per assemblare la piattaforma cultura, piattaforme cultura microfluidici sono stati collocati in cima alle fondo di vetro rivestite con piatti centrali canali di connessione sul suo lato inferiore per formare una tenuta ermetica. Neurone regolare o terreni di coltura sono stati aggiunti astrociti (dalle zone di placcatura di cella) su entrambi i lati (figura 1) nella assemblato MCP e incubate per 2-4 ore a 37 ° C, per garantire l'assenza di fughe tra MCP e il vetro- piatto fondo. Abbiamo testato con il mezzo prima che le cellule placcatura per garantire non ci sono perdite. L'assemblea di MCP sul vetro a fondo piatto deve essere preparata estemporaneamente prima dell'uso.
2. Preparazione della Cultura neuronale e induzione degli assoni neuronali in assemblato MCP
- Corticali colture di cellule neuronali sono stati preparati da embrionali 14-16 giorni di età cervello dei topi. Il mezzo di coltura neurone è composto medie Neurobasal, 2% B27 neurobasaL integratore, 2 mM glutammina aggiungendo 1% di 100x glutamax, e 1% di penicillina-streptomysin. Seguendo dissezione del cervello di topo, le meningi stato rimosso dalla corteccia sotto il microscopio da dissezione. Il tessuto è stato quindi macinata con una lama di rasoio per fare piccoli blocchi di tessuto al fine di aumentare la superficie esposta alla tripsina. Blocchi di tessuto sono state tripsinizzate (Sigma-Aldrich, 0,05% di tripsina) per 10 min in un bagno di acqua a 37 ° C, e quindi dissociato delicatamente per triturazione con un incendio lucidato pipetta Pasteur. Cellule dissociate sono state filtrate attraverso un filtro 70 micron a raccogliere chiaro sospensione cellulare neuronale.
- Neuroni (2-3 x 10 6 / ml, 150 ml) sono state piastrate su aree placcatura cella sulla destra (Figura 1) del MCP assemblato in modo che i neuroni possono attaccare nella zona di ritenzione cellulare (Figura 1). Neuroni preparate sono state piastrate in mezzo di placcatura neurone che viene integrata con il 5% di siero bovino fetale (Hyclone) nella regular neurone terreno di coltura. Perché solo i neuroni che fissano nella zona ritenzione delle cellule sono in grado di crescere assoni nell'altro lato della assemblato MCP attraverso canali centrali, è importante densità piastra elevato di neuroni nell'area placcatura cella per garantire pochi neuroni sono collegati al cella area di ritenzione. Una immagine rappresentativa di alta densità di assoni neuronali è mostrato nella figura 2A.
- Il giorno seguente, il mezzo placcatura neurone è stato sostituito dalla media regolare cultura neurone. Medie cambiando è stata compiuta da aspirando accuratamente il terreno dalla superficie cellulare placcatura della camera, ma non dalla zona di ritenzione della cella assemblata MCP, per evitare bolle d'aria nella zona di ritenzione cellulare ei canali centrali di collegamento. Le bolle d'aria si inibiscono gravemente la conseguenza assone e la successiva entrata in canali centrali del MCP. Cellule gliali fattore neurotrofico derivato (GDNF, 10-20 ng / ml) è stato aggiunto anche dall'altro (sinistro)della camera il giorno stesso per facilitare l'induzione della crescita degli assoni 5 dal lato neuronale e trasversale attraverso canali centrali assemblato MCP (Figura 2A). Discreta quantità di crescita dei neuriti spontanea senza GDNF si osserva anche dal lato neuronale e trasversale attraverso i canali centrali della assemblato MCP. Assoni che entrano nel canale centrale sono spesso osservati 2-3 giorni dopo la placcatura. Una volta che gli assoni entra nel canale centrale, di solito immettere lato entro un giorno. Assoni sono normalmente intatto per almeno una settimana dopo aver inserito l'altro lato.
3. L'aggiunta di astrociti in coltura per MCP per stabilire una co-cultura a compartimenti stagni del sistema
Colture primarie di astrociti sono stati preparati da P1-3 cervello di topo cucciolo. La procedura di dissociazione cervello è simile alla procedura di isolamento cellulare neuronale descritto sopra. Astrociti sono stati piastrati in piatto 10 cm che sono stati pre-Rivestito con Polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml). Il mezzo di coltura astrociti (DMEM, 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomysin) è stato cambiato ogni giorno per i due giorni successivi per rimuovere i detriti. Dopo di che, il mezzo è stato cambiato ogni tre giorni.
- Astrociti diventano 90% confluenti e formano un monostrato dopo 7 giorni. Astrociti confluenti sono state tripsinizzate e 150 pl di ri-sospese astrociti (1x10 6 / ml) sono stati ri-piastrate nell'area cella fasciame del lato sinistro della assemblato MCP quando assoni stanno per entrare o appena entrato nel lato sinistro l'assemblato MCP. Gli astrociti sono stati di solito 4-5 giorni dopo piastrate i neuroni erano placcato. GDNF è stato rimosso prima della re-placcatura dei astrociti nel lato sinistro della MCP. Re placcati astrociti sono stati attaccati nella zona di ritenzione cellulare, come mostrato dalla immunostaining GFAP (Figura 1). Solo flusso minimo di mezzo tra entrambi i lati delle camere (determinata dalla fluorescenza dsì) è stato trovato nel MCP, come precedentemente illustrato 4,6.
- Astrociti diventano 90% confluenti e formano un monostrato dopo 7 giorni. Astrociti confluenti sono state tripsinizzate e 150 pl di ri-sospese astrociti (1 x 10 6 / ml) sono stati ri-piastrate nell'area cella fasciame del lato sinistro della assemblato MCP quando assoni stanno per entrare o sono entrate in sinistra lato del MCP assemblato. Gli astrociti sono stati di solito 4-5 giorni dopo piastrate i neuroni erano placcato. GDNF è stato rimosso prima della re-placcatura dei astrociti nel lato sinistro della MCP. Re placcati astrociti sono stati attaccati nella zona di ritenzione cellulare, come mostrato dalla immunostaining GFAP (Figura 1). Solo flusso minimo di mezzo tra entrambi i lati delle camere (determinata da coloranti fluorescenti) è stato trovato nel MCP, come precedentemente illustrato 4,6.
- Dopo la ri-placcatura dei astrociti, assoni che sono entrate nel lato sinistro della assemblato MCP interagisce direttamente con il astrocytes di contatto diretto assonale o il rilascio di fattori solubili. Immunocolorazione astrogliale GLT1 membrana plasmatica trasportatore e glutammato neuronale βIII-tubulina è stata eseguita per visualizzare l'interazione tra gli assoni e astrociti, come mostrato nella Figura 2D-F.
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Representative Results
Time-lapse imaging di analisi assone indotta da attivazione del promotore GLT1 negli astrociti
Il neurone compartimenti e astrociti co-coltura sistema consente solo i processi neuronali, in particolare gli assoni, di interagire selettivamente con astrociti. Seguendo la costituzione ottimale di assoni e astrociti (o altre cellule gliali) co-coltura in assemblata MCP, diversi tipi di assone-glia interazioni possono essere studiate come; assone indotta attivazione di attivazione astrogliale gene promotore, astrociti indotta guida assonale , assone indotta astrogliale Ca 2 + risposta e assone indotta sintesi della mielina negli oligodendrociti. Tutte queste applicazioni sfruttare la disponibilità di potenti reporter fluorescenti disponibili per le cellule gliali o coloranti caricati a queste cellule.
Qui descriviamo assone indotta da attivazione trascrizionale del promotore astrogliale trasportatore 1 (GLT1) glutammato utilizzando batterica artificiale cromoalcuni (BAC) GLT1 eGFP topi transgenici e questo compartimenti stagni co-coltura di sistema. Nelle GLT1 BAC eGFP topi transgenici, un reporter eGFP fluorescenza veniva sovraespressa sotto il controllo del promotore GLT1 genomico 7. L'espressione del reporter eGFP correla con endogena GLT1 espressione della proteina di attivazione promotore ed attività funzionale 7 consentendo quindi una valutazione dell'attività GLT1 promotore in astrociti singoli in situ. Astrogliali espressione GLT1 dipende in larga misura la stimolazione neuronale 6,8. Astrociti primari esprimono livelli minimi di GLT1, tuttavia, GLT1 livelli di espressione (sia mRNA e proteine) sono fortemente indotta in astrociti che sono co-coltura con neuroni 9. La prova è mostrato dalla significativamente aumentata GLT1 immunoreattività nei compartimenti sistema di co-coltura (Figura 3). In neurone convenzionale e astrociti co-colture, alta densità di neuroni rendono meno ideale per osservare laeffetto di assoni neuronali sulla attivazione trascrizionale di GLT1 promotore.
Per monitorare l'assone-dipendente attivazione promotore GLT1, sono stati coltivati neuroni di tipo selvatico nel lato destro della assemblato MCP e gli assoni sono state indotte a seguito dell'applicazione del GDNF sul lato sinistro della assemblato MCP. Astrociti derivati dai topi eGFP GLT1 BAC sono state coltivate nel lato sinistro della assemblato MCP dopo gli assoni sono state indotte e appena entrato nel lato sinistro della assemblato MCP. Un totale di 6 giorni (24 ore a 140 ore) time-lapse immagini sono state raccolte per monitorare il cambiamento eGFP intensità di fluorescenza in tempo reale e la crescita assonale nel MCP. Come mostrato nella Figura 4A, molto fluorescenza minima espressione eGFP in astrociti stata osservata 24 ore dopo la placcatura dei astrociti. Significativo aumento di intensità eGFP è stata osservata 48 ore dopo la co-coltura (da 24 ore a 68 ore) quando gli assoni sono ben nel lato astrociti e interazionet direttamente contatto con gli astrociti (Figura 4 aC). D'altra parte, eGFP intensità di fluorescenza è stata gradualmente diminuita volta assoni sono retratti e degenerato da kainite (200 pM) morte neuronale indotta sulla neuronale (destra) della assemblato MCP (Figura 4D-F). Il cambiamento dinamico di intensità eGFP fluorescenza in risposta agli assoni chiaramente dimostrato che astrogliale GLT1 promotore attività è modulata dall'interazione assone.
Figura 1. Schema del neurone microfluidica e astrociti co-coltura piattaforma. Piattaforma cultura Microfluidic (MCP) ha due scomparti che sono collegati attraverso i canali centrali. Cellule possono essere placcati dalla zona placcatura cella su ogni lato e assoni neuronali sono indotte dalla zona di ritenzione cellulare e passano attraverso i canali centrali a enter l'altro lato (inserire la barretta a scala 50 micron).
Figura 2. Induzione degli assoni neuronali e l'interazione degli assoni con astrociti in MCP MCP. (A) ad alta densità di neuroni nella zona della cella di ritenzione del assemblato MCP, rivelato da βIII-tubulina immunocolorazione. Scala bar: 50 pm (B) Visualizzazione ingrandita della assoni che attraversano i canali centrali e che entrano nel lato del MCP. Scala bar: 100 pm (C) cono di crescita assonale rivelata dal BIII-tubulina colorazione quando assoni entrano nel lato della MCP. Scala bar: 100 micron (D) fasci di assoni che si sviluppano attraverso il canale centrale ed entrare nella parte del MCP. (E) Gli astrociti rivelato dal immunocolorazione GLT1 nel lato gliale del MCP. (F) visualizza immagine unita contatto tra assoni e GLT1 astrociti positivi. Scala bar: 50 micron.
Figura 3. Neuron-dipendente induzione di GLT1 espressione in astrociti primari GLT1 immunoreattività in (A) colture primarie di astrociti, bar Scala:. Micron 50 (B) colture primarie neuronali, e (C) neurone primario e astrociti co-colture. Bar Scala: I neuroni sono rappresentati da immunocolorazione di βIII-tubulina. Significativo aumento di GLT1 immunoreattività è stata osservata in neuroni e astrociti co-colture.
Figura 4. Time-lapse immagini di assone indotta GLT1 attivazione promotore in MCP con BAC GLT1 eGFP astrociti e neuroni di tipo selvatico. Cambiamenti dinamici di intensità eGFP e la crescita degli assoni sono stati raccolti attraverso un 6d time-lapse dopo placcatura astrociti. (A) 24h (B) 48h (C) 68h (D) (E 92H) 112H (F) 140h. Inserimento di unXON (evidenziato dalle frecce gialle) nel lato astrociti è stato osservato da 48h a 92h che correlano con una maggiore intensità di fluorescenza eGFP. Diminuire di intensità di fluorescenza eGFP verificato da 112h a 140h dopo kainite (200 uM) è stato applicato sul lato neuronale a 92h per indurre la morte delle cellule neuronali e degenerazione dell'assone. Scala bar: 50 micron.
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Discussion
Il neurone MCP based e astrociti co-coltura sistema consente di dissezione neurone dettagliata astroglia vie di segnalazione permettendo solo gli assoni passare i canali centrali e interagire con le cellule astrogliali. Questo co-coltura sistema può essere comodamente impostato con neurone convenzionale e procedure di coltura astrociti. Abbiamo anche descritto un applicazione pratica di questo sistema di co-coltura con l'impiego di un reporter eGFP based per dimostrare assone-dipendente attivazione promotore GLT1 negli astrociti.
Questo MCP basata su neuroni e astroglia di co-coltura sistema offre numerosi vantaggi rispetto ai tradizionali metodi di co-coltura: 1) capacità di visualizzare e identificare l'interazione esplicita morfologica tra assoni singoli e astrociti in tempo reale in microscopia ad alta risoluzione 2) un pozzo microambiente controllato indipendente da applicare manipolazione farmacologica per la cella effetto specifico 3) analisi di attivazione promotoree l'espressione della proteina indotta esclusivamente / up-regolato in astrociti che sono modulati per contatto assoni. Poiché le procedure di coltura primaria di microglia 10 e 11 oligodendrociti sono stati ben stabiliti, il co-cultura MCP sistema può essere applicato anche al neurone a neurone microglia e oligodendrociti co-colture. Nel frattempo, abbiamo anche riconoscere che questo sistema di co-coltura è inteso per l'analisi dell'immagine sensibile a livello di singola cellula, che è complementare ai metodi convenzionali di analisi di grandi quantità di cellule, come RNA o proteina analisi. Inoltre, il nostro sistema semplifica l'interazione enorme tra neuroni e cellule gliali in vivo di interazione tra esemplificando singola cellula e assoni. Tutti questi devono essere considerati quando si interpretano i risultati di questo sistema di co-coltura. Nel sistema nervoso centrale, le interazioni tra assoni e le diverse cellule gliali sono ampiamente presenti e sono di fondamentale importanza sia per neurone efunzioni gliali 12,13. Lo sviluppo di questo sistema di co-coltura permetterà di imaging basata su dissezione di queste interazioni.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dott. Jeffrey Rothstein per la fornitura di BAC GLT1 topi eGFP e GLT1 anticorpi; Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) per la fornitura di servizi di base preziosi, New facoltà di assunzione di assegnazione (NIH 5P30NS069254 P30-02 , PI, Phil Haydon) in Tufts Neuroscienze Dipartimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D Systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
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| Neuron culture medium for plating cell
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| Astrocyte culture medium
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| Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
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References
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