Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Sommario

Questo studio descrive le procedure di creazione di un nuovo assone neuronale e (astro) glia co-coltura piattaforma. In questo sistema di co-coltura, la manipolazione di interazione diretta tra un singolo assone (e singole cellule gliali) diventa possibile, consentendo l'analisi meccanicistica del neurone reciproco segnalazione gliali.

Abstract

Neurone propria interazione glia è fondamentale per funzione fisiologica del sistema nervoso centrale (CNS). La comunicazione bidirezionale è sofisticato mediata da specifiche vie di segnalazione tra neuroni e glia ^1,2. Identificazione e caratterizzazione di queste vie di segnalazione è essenziale per la comprensione di come l'interazione neurone a glia forme CNS fisiologia. In precedenza, le colture di neuroni e glia misti sono stati ampiamente utilizzati per il test e la caratterizzazione di vie di segnalazione tra neuroni e glia. Quello che abbiamo imparato da questi preparativi e altri strumenti in vivo, tuttavia, ha suggerito che la segnalazione reciproci tra neuroni e glia sono presentati spesso in settori specifici all'interno dei neuroni (cioè, assoni, dendriti, o soma) ^3. Per questo è importante per sviluppare un nuovo sistema di cultura che permette la separazione dei compartimenti neuronali ed esamina in particolare l'interazione tra glia e neuronali assoni / dendriti. Inoltre, il sistema convenzionale coltura mista non è in grado di differenziare i fattori solubili e segnali in membrana di contatto tra neuroni e glia. Inoltre, la grande quantità di neuroni e cellule gliali del convenzionale sistema di co-coltura manca la risoluzione necessaria per osservare l'interazione tra un singolo assone e cellule gliali.

In questo studio, si descrive un assone romanzo e glia sistema di co-coltura con l'uso di una piattaforma microfluidica cultura (MCP). In questo sistema di co-coltura, neuroni e cellule gliali sono coltivati ​​in due camere separate che sono collegati attraverso molteplici canali centrali. In questa piattaforma microfluidica cultura, solo i processi neuronali (soprattutto assoni) può entrare nel lato gliali attraverso i canali centrali. In combinazione con potente etichettatura proteina fluorescente, questo sistema permette esame diretto di percorsi di segnalazione tra interazioni assonali / dendritiche e gliali, tales assone-mediata regolazione trascrizionale nelle cellule gliali, glia-mediata traffico recettore in terminali neuronali e glia-mediata della crescita degli assoni. Il diametro ridotto della camera vieta anche significativamente il flusso del neurone arricchito medio nella camera gliale, facilitando sondaggio della diretta membrana-proteina tra assoni / dendriti e superfici gliali.

Protocollo

1. Assemblea della Camera Cultura Microfluidic (MCP)

1. MCP (Figura 1) sono progettati per cavità si aprono culture compartimenti di diversi tipi di cellule ^4. Ha tipicamente due compartimenti che sono collegati attraverso i canali centrale (3 mm di diametro). Montaggio di MCP con fondo di vetro piatti è necessario per la preparazione di culture e l'analisi di immagini successive.
2. Primo, cappotto sterili fondo di vetro piatti con Polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) sciolto in tetraborato di sodio (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8,5) e sono state incubate per una notte a 37 ° C.
3. Il giorno seguente, il fondo di ....

Risultati

Time-lapse imaging di analisi assone indotta da attivazione del promotore GLT1 negli astrociti

Il neurone compartimenti e astrociti co-coltura sistema consente solo i processi neuronali, in particolare gli assoni, di interagire selettivamente con astrociti. Seguendo la costituzione ottimale di assoni e astrociti (o altre cellule gliali) co-coltura in assemblata MCP, diversi tipi di assone-glia interazioni possono essere studiate come; assone indotta attivazione di attivazione astrogliale gene p.......

Discussione

Il neurone MCP based e astrociti co-coltura sistema consente di dissezione neurone dettagliata astroglia vie di segnalazione permettendo solo gli assoni passare i canali centrali e interagire con le cellule astrogliali. Questo co-coltura sistema può essere comodamente impostato con neurone convenzionale e procedure di coltura astrociti. Abbiamo anche descritto un applicazione pratica di questo sistema di co-coltura con l'impiego di un reporter eGFP based per dimostrare assone-dipendente attivazione promotore GLT1 ne.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siero fetale bovino	Hyclone	SH30070.03	per la placcatura neurone per neurone medio cutlure
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	F4135	per il terreno di coltura astrociti
Gliale fattore nervoso derivato	R & D Systems	212-GD	Applicare 10-20 ng / ml a lato neurone della camera
Dulbecco modificato aquila medio alte concentrazioni di glucosio	Sigma-Aldrich	11995
70 millimetri filtro cella	BD Falcon	352350
Sterile piatto di vetro basso	MatTek Corporation
Piattaforme cultura microfluidici	Xona microfluidica LLC	SND150
6 pozzetti della piastra di coltura	Cellstar	657 160
			Neuron terreno di coltura Media Neurobasal 2% B27 supplemento Neurobasal 2 mM glutammato aggiungendo 1% 100x glutamax 1% di penicillina-streptomysin
			Neuron terreno di coltura per cellule placcatura Media Neurobasal 2% B27 supplemento Neurobasal 2 mM glutammato aggiungendo 1% 100x glutamax 1% di penicillina-streptomysin 5% di siero fetale bovino SH30070.03
			Terreno di coltura astrociti Dulbecco modificato eagle glucosio medio alto 10% di siero bovino fetale F4135 1% di penicillina-streptomysin
			Materiali Tabella 1. Utilizzati per la microfluidica cultura piattaforma basata su assone neuronale e glia di co-cultura di sistema.