Summary
この研究では、神経細胞の軸索と小説（ASTRO）グリア共培養プラットフォームをセットアップする手順について説明します。この共培養系では、単一の軸索（と単一神経膠細胞）との間の直接的な相互作用の操作は、グリアシグナリング相互ニューロンのメカニズム解析を可能にすることが可能となる。
Abstract
グリア相互作用への適切なニューロンは、中枢神経系（CNS）の生理機能に重要である。この双方向通信は高度にニューロンとグリア1,2の間の特定のシグナル伝達経路によって媒介される。これらのシグナル伝達経路の同定および特徴は、グリア相互作用の形中枢神経生理学にどのニューロンの理解に不可欠である。以前は、ニューロンとグリア細胞混合培養が広くニューロンとグリア細胞間のシグナル伝達経路をテストおよび特性評価に利用されてきた。我々 は 、in vivo のツールで 、これらの製剤と他から学んだことは、しかし、ニューロンとグリア細胞間の相互シグナリングがしばしばニューロン（ すなわち 、軸索、樹状突起、またはソーマ）3内の特定の区画で発生したことを示唆している。これは、重要な神経区画の分離を可能にする新しい培養システムを開発することができ、具体的にはグリア細胞と神経の間の相互作用を調べNAL軸索/樹状突起。加えて、従来の混合培養系は、可溶性因子とニューロンとグリア細胞間の直接メンブレン接点信号を区別することができるではありません。さらに、従来の共培養系におけるニューロンとグリア細胞の大量は、単一の軸索とグリア細胞間の相互作用を観察するために必要な決議を欠いている。
そこで本研究では、マイクロ流体文化プラットフォーム（MCP）を用いた新規軸索とグリア共培養系を記述します。この共培養系では、神経細胞とグリア細胞は、複数の中央のチャネルで接続されている2つの別々の室で培養される。このマイクロ流体文化のプラットフォームでは、唯一の神経プロセス（特に軸索）は、中央のチャネルを介してグリア側を入力することができます。強力な蛍光タンパク質の標識との組み合わせでは、このシステムはそのような、軸索/樹状細胞およびグリア相互作用の間のシグナル伝達経路を直接検査することができます神経端末におけるグリア、グリア媒介受容体の輸送、およびグリア媒介軸索成長のs軸索を介した転写調節。チャンバーの狭い直径も大きく軸索/樹状突起とグリアの表面との間の直接の膜タンパク質相互作用のプロービングを容易にして、グリアチャンバー内にニューロンに富んだ媒体の流れを禁止しています。
Protocol
1。マイクロ流体培養チャンバー（MCP）の組立
- MCP（ 図1）はセル4の異なる種類の区画文化のために設計されたオープン室である。これは、典型的には、中央のチャネル（直径3μm）を介して接続されている2つの区画を持っています。ガラス底皿とMCPの組み立ては、文化やその後の画像解析を準備するために必要です。
- まず、オルニチン（Sigma-Aldrich社、1 mg / ml）を持つコート無菌のガラス底皿は四ホウ酸ナトリウム（Sigma-Aldrich社、10mMのpH8.5）に溶解し、37℃で一晩インキュベートした。
- 次の日に、コーティングされたガラス底皿をddH 2 Oで3回洗浄し、滅菌ヒュームフードの下で乾燥させた。ガラス底皿はその後さらにラミニン（シグマアルドリッチは、1 mg / ml）をコーティングし、1時間UV光下で乾燥した。コーティングされた料理は、使用する準備ができているか、使用するまで-20℃で保存することができます。これらのコーティング共培養におけるめっきニューロンおよびアストロサイトのために必要な再。
- 文化プラットフォームを組み立てるために、マイクロ流体文化プラットフォームはタイトなシールを形成するために、その下側の中央の接続チャネルでコーティングされたガラス底皿の上に置かれた。定期的なニューロンやアストロサイトの培養培地を組み立てMCPに両側（ 図1）（細胞播種領域から）を添加し、37℃で2-4時間インキュベートし、MCPとガラスの間に漏れがないことを確認したボトムディッシュ。私たちには漏れがないことを確認するために細胞をプレーティングする前に培地をテストしている。ガラスボトムディッシュにMCPの組み立てが新たに使用する前に準備する必要があります。
2。組立てMCPの神経軸索の神経文化と誘導の準備
- 大脳皮質の神経細胞培養物は、新鮮胚の14から16日齢マウスの脳から調製した。神経細胞培養培地をNeurobasal培地、2％B27 neurobasaから構成されている100xのグルタマックスの1％、1％ペニシリン - streptomysinを追加することで、リットルサプリメント、2mMグルタミン。マウスの脳の解剖の後、髄膜を解剖顕微鏡下で皮質から削除されました。組織は、トリプシンにさらされる表面積を増やすために、小さな組織ブロックを作るためにかみそりの刃でミンチにしました。組織ブロックはファイアーポリッシュパスツールピペットで粉砕して穏やかに解離した後、37℃の水浴中で10分間（Sigma-Aldrich社、0.05％トリプシン）トリプシン処理し、及びました。解離された細胞は、明確な神経細胞懸濁液を収集するために70μmのストレーナーを通して濾過した。
- そのニューロンは細胞保持領域（ 図1）に接続できるような神経細胞（2-3×10 6個 / ml、150μl）を組み立てたMCPの右側のセルメッキ領域（ 図1）上にプレーティングした。作りたてのニューロンは、レギュレーションに5％ウシ胎児血清（Hyclone）を補充しているニューロンメッキ培地で播種したRニューロン培養培地。細胞保持領域にアタッチのみニューロンが中央のチャネルを介して組み立てられたMCPの反対側に軸索を成長することができるので、それだけでは十分ではニューロンが接続されるように細胞播種面積のニューロンのプレートに高密度に重要である細胞保持領域。神経軸索の高密度の代表画像を図2Aに示されています。
- 翌日、ニューロンメッキ媒体はレギュラーニューロン培養培地と交換した。変化媒体は慎重に細胞保持エリアと中央の接続チャネル内の気泡を避けるために、チャンバーの細胞播種エリアからではなく、組み立てたMCPの細胞保持領域から培地を吸引することによって達成された。気泡が厳しく軸索伸長とMCPにおいて中心的なチャネルに次のエントリを阻害するであろう。グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF、10〜20 ng / mlの）も、他の側（左側）に追加されました組み立てられたMCP（ 図2A）の中央チャンネルを通じて神経側と十字架から軸索伸長5の誘導を容易にするために同じ日にチャンバーの。 GDNFをせずに自発的な神経突起伸長のかなりの量はまた組み立てられたMCPの中央チャンネルを通じて神経側とクロスから観察される。中央のチャンネルに入力した軸索は、多くの場合2〜3日、めっき後に観察される。軸索は中央のチャンネルに入ると、彼らは通常、1日以内にもう一方の側を入力します。軸索は、反対側を入力した後、少なくとも1週間は正常に変更されていない。
3。コンパートメント化された共培養系を確立するために、MCPに培養アストロサイトの追加
プライマリアストロサイトの培養は、P1-3マウス子犬脳から調製した。脳解離手順は、上記の神経細胞の単離操作に似ています。アストロサイトは、まず事前た10cmの皿に播種したオルニチン（シグマアルドリッチは、1 mg / ml）でコーティングした。星状膠細胞培養培地（DMEM、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - streptomysin）破片を除去するために次の2日間、毎日変更されました。その後、培地を3日ごとに変更されました。
- アストロサイトは、90％コンフルエントになると7日後に単分子膜を形成します。コンフルエントアストロサイトをトリプシン処理し、軸索が入ろうとしている、または単にの左側に入力したときに再懸濁した星状細胞（1×10 6個 / ml）150μlを組み立てたMCPの左側のセルメッキ面積に再播種したMCPの組み立て。アストロサイトは、通常、神経細胞が播種した4-5日後に播種した。 GDNFは最初MCPの左側にアストロサイトの再メッキ前に削除されました。 GFAPの免疫染色（ 図1）で示されるように、再メッキアストロサイトは、細胞保持領域に付着させた。チャンバーの両側の間の媒質の唯一の最小流量（蛍光dによって決定はい）は、以前に4,6に示すように 、MCPに発見された。
- アストロサイトは、90％コンフルエントになると7日後に単分子膜を形成します。コンフルエントアストロサイトをトリプシン処理し、軸索が左に先ほど入力を入力するか、または持ってしようとしているときに再懸濁した星状細胞（1×10 6個 / ml）150μlを組み立てたMCPの左側のセルメッキ面積に再播種した組み立てられたMCPの側。アストロサイトは、通常、神経細胞が播種した4-5日後に播種した。 GDNFは最初MCPの左側にアストロサイトの再メッキ前に削除されました。 GFAPの免疫染色（ 図1）で示されるように、再メッキアストロサイトは、細胞保持領域に付着させた。以前に4,6に示すようにチャンバーの両側の間の媒質の唯一の最小流量は、（蛍光色素によって決定される）は、MCPで発見された。
- アストロサイトの再めっき後、組み立てられたMCPの左側に入った軸索は、直接astrと対話可溶性因子の直接の軸索の接触またはreleaseによってocytes。アストログリア細胞膜のグルタミン酸トランスポーターと神経GLT1βIII-チューブリンの免疫染色すると、 図2D-Fに示すように、軸索とアストロサイトとの間の相互作用を可視化するために行われた。
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Representative Results
アストロサイトにおける軸索誘導のGLT1プロモーター活性化のタイムラプスイメージング解析
コンパートメントニューロンとアストロサイトの共培養システムは、特に唯一の神経突起、軸索は、選択的にアストロサイトと対話することができます。組み立てMCPにおける軸索と星状膠細胞（または他のグリア細胞）の共培養の成功確立に続いて、軸索·グリア相互作用の異なる種類は、次のような研究することができる、アストログリア遺伝子プロモーターの活性化アストロサイト誘導性の軸索ガイダンスの軸索誘導活性化を、オリゴデンドロサイトにおける軸索誘導のアストログリアのCa 2 +応答、および軸索誘導のミエリン合成。これらすべてのアプリケーションは、グリア細胞またはこれらの細胞にロード染料に使用できる強力な蛍光レポーターの可用性を活用しています。
ここでは、細菌人工染色体を用いてアストログリア型グルタミン酸トランスポーター1（GLT1）プロモーターの軸索誘導の転写活性化を記述するいくつかの（BAC）GLT1のeGFPトランスジェニックマウスおよびこのコンパートメント共培養系。 BAC GLT1のeGFPトランスジェニックマウスでは、EGFP蛍光レポーターがGLT1ゲノムプロモーターの制御下で7過剰発現させた。 EGFPレポーターの発現は、このようにin situで単一アストロサイトにおけるGLT1プロモーター活性の評価を可能に内在GLT1プロモーター活性化蛋白質の発現と機能活性7と相関している。アストログリアGLT1発現は神経刺激6,8に大きく依存しています。プライマリアストロサイトはGLT1の最小レベルを表現しますが、GLT1発現量（mRNAとタンパク質の両方）が強くニューロン9と共培養アストロサイトに誘導される。証拠はコンパートメント共培養系において有意に増加したGLT1免疫反応性（ 図3）でここに示されています。従来のニューロンとの共培養アストロサイト、ニューロンの高密度で観察することが少なく理想的ですGLT1プロモーターの転写活性化に神経軸索の効果。
軸索依存GLT1プロモーター活性をモニターするために、野生型ニューロンは、組み立てられたMCPの右側で培養し、軸索は、組み立てられたMCPの左側にGDNFの適用後誘導された。軸索が組み立てMCPの左側に誘導され、直前に入力された後、BAC GLT1たeGFPマウス由来のアストロサイトは組み立てMCPの左側で培養した。 6日間の合計（24時間〜140時間）タイムラプス画像がリアルタイムでeGFPの蛍光強度変化とMCPにおける軸索の成長を監視するために集められた。 図4Aに示すように、アストロサイトにおける最低限eGFPの蛍光発現はアストロサイトのめっき後24時間を観察した。軸索はアストロサイト側に十分にあり、相互作用するときeGFPの強度の有意な増加が共培養（24時間から68時間まで）48時間後に観察されたtが直接アストロ（ 図4 BC）と接触。軸索がカイナイト（200μM）を組み立て、MCP（ 図4D-F）の神経細胞（右）側に誘導された神経細胞死によって後退し、縮退した一回一方、EGFP蛍光強度は徐々に減少した。軸索への応答におけるEGFP蛍光強度の動的な変化は明らかにアストログリアGLT1プロモーター活性は、軸索との相互作用によって変調されることを実証した。
図1。マイクロ流体ニューロンとアストロサイトの共培養プラットフォームの模式図。マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）は、中央のチャネルを介して接続された2つの区画を持っています。細胞は、それぞれの側に細胞播種面積からめっきすることができると神経細胞の軸索は、中央のチャネルを介して細胞保持領域とパスからのent誘導されるえー反対側（スケールバーは50μmを挿入）。
図2。神経細胞の軸索とMCP MCPにおけるアストロサイトによる軸索の相互作用の誘導。組み立てMCPの細胞保持領域内のニューロンの（A）の高密度、βIII-チューブリン免疫染色により明らかになった。スケールバー：50μm以下（B）の軸索中央チャネルを横断して、MCPの反対側に入るの拡大図。スケールバー：軸索は、MCPの反対側に入るときBIII-チューブリン染色によって明らかにさ100μm（C）の軸索成長円錐。スケールバー：100ミクロン（D）の中央のチャネルを通じて成長とMCPの反対側に入力軸索の束。 （E）アストロサイトは、MCPのグリア側でGLT1免疫染色により明らかになった。 （F）はマージされた画像は、軸索とGLT1陽性アストロサイトとの間の接触が表示されます。スケールバー：50μmである。
図3。プライマリーアストロサイトにおけるGLT1発現ニューロン依存的誘導でGLT1免疫反応性（A）は、一次星状膠細胞の培養、スケールバー：50μm以下（b）一次ニューロン培養、及び（C）一次ニューロンとアストロサイトの共培養。スケールバー：ニューロンがβIII-チューブリンの免疫染色で示されている。 GLT1免疫活性の有意な増加がニューロンと共培養アストロサイトにおいて観察された。
図4。 BAC GLT1 eGFPのアストロサイトおよび野生型ニューロンとMCPで軸索誘導のGLT1プロモーター活性化のタイムラプス画像。eGFPの強度と軸索の成長の動的な変更は、アストロサイトめっき後6Dタイムラプス記録を収集した。 （A）24（B）48（C）は68H（D）は92H（E）112H（F）は140H。のエントリアストロサイト側にxons（黄色の矢印で強調されている）48時間から増加したeGFP蛍光強度と相関92Hに観察された。カイナイト後に112Hから140Hに発生したeGFPの蛍光強度の減少（200μM）を神経細胞死と軸索変性を誘導することが92Hで神経側に塗布した。スケールバー：50μmである。
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Discussion
MCPベースのニューロンとアストロサイトの共培養系は、軸索のみが中央のチャンネルを通過できるようにし、星状膠細胞と相互作用することにより、星状膠細胞シグナル伝達経路の詳細な神経細胞の解剖を可能にします。この共培養系は、便利な、従来のニューロンとアストロサイトの培養の手順で設定することができます。我々はまた、アストロサイトにおける軸索依存GLT1プロモーター活性化を実証するためのeGFPベースのレポーターを用いることにより、この共培養系の実用化を説明した。
このMCPベースのニューロンとアストログリア共培養系は、従来の共培養の方法に比べていくつかの利点が提供：1）リアルタイムでの単一軸索およびアストロサイト間の明示的な形態学的相互作用を視覚化し、識別する能力の高解像度顕微鏡下2）もプロモーター活性化の細胞特異的効果3の薬理学的操作を適用するための制御された独立した微小環境）分析およびタンパク質の発現は、排他的に誘発さ/軸索の接触によって変調されるアストロサイトにおいてアップレギュレート。プライマリーミクログリア10およびオリゴデンドロサイト11の培養手順が十分に確立されてきたように、このMCPの共培養系も共培養オリゴデンドロサイトへのミクログリアとニューロンへの神経細胞に適用することができます。一方、我々はまた、この共培養システムは、例えば、RNAまたはタンパク質解析などの細胞を大量に解析する従来の手法に相補的であり、単一細胞レベルで敏感な画像解析のために意図されていることを認識しています。加えて、我々のシステムは、単一の細胞と軸索との間の相互作用を例示することにより 、in vivo でのニューロンとグリア細胞の間に膨大な相互作用を簡素化します。この共培養系から得られた結果を解釈する際に、これらのすべてが考慮されるべきである。 CNSにおいて、軸索と異なるグリア細胞間の相互作用が広く存在しており、ニューロンの両方に非常に重要であるとグリア機能12,13。この共培養系の開発は、これらの相互作用のイメージングベースの解剖を許可します。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、BAC GLT1たeGFPマウスとGLT1抗体を提供するための博士ジェフリー·ロススタインに感謝したいと思います。貴重なコア機能を提供するため、脳科学研究のためのタフツセンター（PI、ロブ·ジャクソンNIH P30 NS047243）;新教員採用助成金（NIH P30 5P30NS069254-02 ;タフツ神経科学部門のPI、フィル·ヘイドン）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D Systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
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| Neuron culture medium for plating cell
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| Astrocyte culture medium
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| Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
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References
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