Summary
이 연구는 소설 neuronal 축삭과 (천체) glia 공동 문화 플랫폼을 설정하는 절차를 설명합니다. 이 공동 문화 시스템에서 하나의 축삭 (및 단일 glial 세포) 사이의 직접 상호 작용 조작은 glial 신호에 대한 상호 신경 세포의 기계론의 분석을 수 있도록 가능한된다.
Abstract
glia 상호 작용에 적절한 신경 세포는 중추 신경계 (CNS)의 생리적 기능에 중요합니다. 이 양방향 통신이 sophisticatedly 뉴런과 glia 1,2 사이에 특정 신호 경로에 의해 중재됩니다. 이러한 신호 경로의 식별 및 특성은 glia 상호 작용 형태의 CNS의 생리에 얼마나 신경 세포의 이해에 필수적입니다. 이전 뉴런과 glia 혼합 문화가 널리 뉴런과 glia 사이의 신호 경로를 테스트 및 특성화에 활용되었습니다. 우리가 생체 도구에서 이러한 준비 및 기타에서 배운 것을 그러나, 뉴런과 glia 사이의 상호 신호가 자주 뉴런 (즉, 축삭, dendrite, 또는 소마) 3 내의 특정 구획에서 오류가 발생 것을 제안했습니다. 이것은 중요한 neuronal 구획의 분리 할 수있는 새로운 문화 시스템을 개발 할 수 있으며 특별히 glia과 신경 사이의 상호 작용을 검사NAL axons / 수석. 또한, 기존의 혼합 문화 시스템은 가용성 요인과 뉴런과 glia 사이에 직접 멤브레인 연락처 신호를 구별 할 수 없습니다. 또한, 종래의 공동 문화 시스템의 뉴런과 glial 세포의 큰 수량은 하나의 축삭과 glial 세포 사이의 상호 작용을 관찰하는 데 필요한 해상도를 부족합니다.
본 연구에서는, 우리는 마이크로 유체 문화 플랫폼 (MCP)의 사용과 소설 축삭과 glia 공동 문화 시스템을 설명합니다. 이 공동 문화 시스템에서 뉴런과 glial 세포는 여러 중앙 채널을 통해 연결된 2 개의 별도의 방에서 배양되어 있습니다. 이 마이크로 유체 문화 플랫폼에서 만 neuronal 프로세스 (특히 axons) 중앙 채널을 통해 glial 측면을 입력 할 수 있습니다. 강력한 형광 단백질 라벨과 함께,이 시스템은, / axonal 수지상와 glial 상호 작용 사이의 경로를 신호를 직접 검사 할 수 있습니다neuronal 터미널에서 glia, glia로 인한 수용체 인신 매매 및 glia로 인한 축삭의 성장에의 축삭로 인한 전사 조절. 챔버의 좁은 직경은 크게 axons / 수석과 glial 표면 사이의 직접 막 단백질 상호 작용의 프로빙 촉진, glial 챔버에 신경 강화 매체의 흐름을 금지합니다.
Protocol
1. 마이크로 유체 문화 회의소의 조립 (MCP)
- MCP (그림 1)은 세포 4 종류 compartmented 문화 용으로 설계된 개방형 챔버 있습니다. 그것은 일반적으로 중앙 채널 (직경 3 μm)를 통해 연결된 2 개의 구획이 있습니다. 바닥이 유리로 요리 MCP 조립 문화와 이후의 이미징 분석을 준비하기위한 필요합니다.
- 첫째, Polyornithine (시그마 - 알드리치, 1 MG / ML)와 코트 멸균 유리 바닥 요리 나트륨 테트라 보레이트 (시그마 - 알드리치, 10 밀리미터 산도 8.5)에 용해하고 37 ° C.에서 하룻밤 incubated되었습니다
- 다음 날, 코팅 유리 바닥 요리는 ddH 2 O로 세 번 씻어되었으며, 멸균 배기함에 넣고 건조. 유리 바닥 요리는 더 laminin (시그마 - 알드리치, 1 MG / ML)로 코팅 1 시간 동안 UV 빛 아래에서 건조했다. 코팅 요리 사용할 수 있습니다 또는 사용 할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 이러한 코팅공동 문화에 도금 뉴런과 astrocytes에 필요한 재.
- 문화 플랫폼을 조립하기 위해 마이크로 유체 문화 플랫폼은 방수 밀봉을 형성하기 위해 아래 쪽 중앙 연결 채널을 시청할 수있는 코팅 유리 바닥 요리의 상단에 배치했다. 일반 신경이나 astrocyte 문화 매체는 조립 MCP로 양쪽 (그림 1)에 (셀 도금 지역에서) 추가하고 37 ° C에서 2~4시간에 대한 incubated, MCP와 유리 사이에 누수가 없는지 확인하기 위해 한 바닥 요리. 우리는 누수가없는 보장하기 위해 도금 세포하기 전에 중간에서 테스트했습니다. 유리 바닥 요리에 MCP의 어셈블리가 신선하게 사용하기 전에 준비해야합니다.
2. 조립 MCP에 Neuronal Axons의 Neuronal 문화 유도의 작성
- 대뇌 피질의 neuronal 세포 문화는 신선한 배아 14-16일 된 마우스 뇌에서 준비되었다. 뉴런 문화 매체는 neurobasal 매체 2% B27 neurobasa으로 구성되어 있습니다난 보충, 100x GlutaMAX의 1 %, 그리고 1퍼센트 페니실린 - streptomysin를 추가하여 글루타민이 음. 마우스 뇌의 해부 후, meninges는 해부 현미경으로 피질에서 제거되었습니다. 조직은 다음 트립신에 노출 면적을 증가시키기 위해 작은 조직 블록을 만들기 위해 면도날과 다진했다. 조직 블록은 37 ° C의 물을 욕조에 10 분 동안 (시그마 - 알드리치, 0.05 % 트립신) trypsinized, 그리고 불타는 광택 파스퇴르 피펫으로 분쇄하여 부드럽게 한 다음 dissociated했다. Dissociated 세포는 일반 neuronal 세포 현탁액를 수집하기 위해 70 μm의 스트레이너를 통해 필터링되었습니다.
- 뉴런이 세포 보존 지역 (그림 1)에 첨부 할 수 있도록 뉴런은 (2-3 × 10 6 / ML, 150 μl) 조립 MCP의 오른쪽 (그림 1)에서 셀 도금 부분에 도금되었습니다. 신선하게 조리 된 뉴런은 regula에 5% 태아 소 혈청 (Hyclone)로 보완되어 신경 도금 매체를 도금했다R 뉴런 문화 매체입니다. 세포 보존 영역에 첨부 만 뉴런이 중앙 채널을 통해 조립 MCP의 다른 측면에 axons 성장을 할 수 있기 때문에 충분한 뉴런이 연결된 수 있도록하기 위해 셀 도금 지역의 뉴런의 판 고밀도 중요합니다 세포 보존 지역. neuronal axons의 높은 밀도의 대표 이미지가 그림 2A에 표시됩니다.
- 다음 날에서 신경 도금 매체는 일반 뉴런 문화 매체로 대체되었습니다. 변경 매체는 조심스럽게 챔버의 세포 도금 지역에서 매체를 aspirating하여 수행하지만, 조립 MCP의 세포 보존 지역에서, 셀 보존 지역과 중앙 연결 채널에 기포를 방지하기 위해 인치되었습니다 기포가 심각한 MCP의 중심 채널로 축삭의 가지와 이후의 항목을 억제합니다. Glial 세포 파생 neurotrophic 요인 (GDNF, 10-20 NG / ML)도 다른 (왼쪽) 측면에 추가되었습니다조립 MCP (그림 2A)의 중앙 채널을 통해 neuronal 측면과 십자가에서 축삭의 가지 (5)의 유도를 촉진하기 위해 같은 날 챔버의. GDNF없이 자연 neurite의 파생물의 공정한 금액도 조립 MCP의 중심 채널을 통해 neuronal 측면과 십자가에서 관찰된다. 중앙 채널에 입력 Axons은 종종 2-3일 도금 후 관찰됩니다. axons는 중앙 채널에 입력되면, 그들은 보통 하루 내에 다른 쪽을 입력합니다. Axons은 다른 쪽을 입력 한 후 최소 1 주일 동안 정상적으로 그대로입니다.
3. Compartmentalized 공동 문화 시스템을 구축하기 위해 MCP에 대한 양식 Astrocytes의 추가
기본 astrocyte 문화는 P1-3 마우스 새끼 뇌에서 준비되었다. 뇌 분리 절차는 위에서 설명한 neuronal 세포 분리 절차와 비슷합니다. Astrocytes 먼저 사전에 한 10cm 요리로 도금 된Polyornithine (시그마 - 알드리치, 1 MG / ML)로 코팅. astrocyte 문화 매체는 (DMEM, 10 % 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 - streptomysin) 파편을 제거하려면 다음 두 일 동안 매일 변경되었습니다. 그 후, 매체는 매 3 일마다 교체되었습니다.
- Astrocytes는 90 %의 합류가 7 일 후에 monolayer를 형성하고 있습니다. 합류 astrocytes는 trypsinized되었으며 axons가에 대한 입력하려고합니다 또는 왼쪽의 체결했을 때 다시 중지 astrocytes (1x10 6 / ML) 150 μl은 조립 MCP의 왼쪽의 셀 도금 지역으로 다시 도금했다 MCP 조립. 뉴런이 도금 한 이후 Astrocytes는 일반적으로 4-5일 도금했다. GDNF 먼저 MCP의 왼쪽에 astrocytes의 재 도금하기 전에 삭제되었습니다. 재 도금 astrocytes는 같은 GFAP의 immunostaining (그림 1)에 의해 도시 된 바와 같이, 셀 고정 영역에 첨부되었습니다. 챔버의 양쪽 사이에 매체의 최소한의 흐름 (형광 D에 의해 결정이전에 4,6를 그림과 같이 예)는 MCP에서 발견되었다.
- Astrocytes는 90 %의 합류가 7 일 후에 monolayer를 형성하고 있습니다. 합류 astrocytes는 axons가에 대한 입력 또는 왼쪽에 입력 한 경우 조립 MCP의 왼쪽의 셀 도금 지역으로 다시 도금 된 trypsinized하고 다시 중지 astrocytes (1 × 10 6 / ML) 150 μl되었습니다 조립 MCP의 측면. 뉴런이 도금 한 이후 Astrocytes는 일반적으로 4-5일 도금했다. GDNF 먼저 MCP의 왼쪽에 astrocytes의 재 도금하기 전에 삭제되었습니다. 재 도금 astrocytes는 같은 GFAP의 immunostaining (그림 1)에 의해 도시 된 바와 같이, 셀 고정 영역에 첨부되었습니다. 이전에 4,6를 그림과 같이 챔버의 양쪽 사이에 매체의 최소한의 흐름 (형광 염료에 의해 결정), MCP에서 발견되었다.
- astrocytes의 재 도금 후, 조립 MCP의 왼쪽을 입력 axons 직접 astr과 상호 작용직접 axonal 연락처 또는 수용성 요소의 릴리스에 의해 ocytes. astroglial 플라즈마 막 glutamate의 전송 GLT1와 neuronal βIII-tubulin의 Immunostaining은 그림 2D-F에 도시 된 바와 같이, axons과 astrocytes 사이의 상호 작용을 시각화하기 위해 수행되었다.
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Representative Results
astrocytes의 축삭 유도 GLT1 프로모터 활성화의 시간 경과 영상 분석
compartmented 신경 세포와 astrocyte 공동 문화 시스템은 neuronal 프로세스, 특히 axons은 선택적으로 astrocytes와 상호 작용 할 수 있습니다. 조립 MCP의 축삭과 astrocyte (또는 다른 glial 세포) 공동 문화의 성공적인 설립 후, 축삭-glia 상호 작용의 다른 유형은 다음과 같은 연구 될 수있다; astroglial 유전자 프로모터 활성화, astrocyte - 유도 축삭 가이드 축삭 유발 활성화를 , 축삭 유도 astroglial 칼슘이 oligodendrocytes의 + 응답하고, 축삭 유도 myelin 합성. 이 응용 프로그램의 모든 glial 세포하거나 셀에로드 염료에 사용할 강력한 형광 기자의 가용성을 활용합니다.
여기 박테리아 인공 chromo를 사용하여 astroglial glutamate의 수송 1 (GLT1) 발기인의 축삭 유도 전사 활성화를 설명일부 (BAC) GLT1 eGFP 유전자 변형 마우스이 compartmentalized 공동 문화 시스템입니다. BAC GLT1 eGFP 유전자 변형 마우스에서 eGFP 형광 기자는 GLT1 게놈 프로모터 7 통제 overexpressed되었습니다. eGFP 기자의 표현 따라서 원래의 장소에 하나의 astrocytes의 GLT1 발기인 활동의 평가를 허용 내생 GLT1 프로모터 활성 단백질 발현 및 기능 활동 7 연결합니다. Astroglial GLT1 표현은 neuronal 자극 6,8시 매우 달라집니다. 기본 astrocytes는 GLT1의 최소 수준을 표현하지만, GLT1 표현 수준은 (mRNA와 단백질 모두) 강력 뉴런 9 공동 배양 아르 astrocytes에서 유도하고 있습니다. 증거는 compartmentalized 공동 문화 시스템에서 크게 증가 GLT1 immunoreactivity (그림 3)에 의해 여기에 표시된다. 에서 기존의 신경 세포와 공동 배양 astrocyte, 뉴런의 높은 밀도를 관찰 할 때 덜 이상적인GLT1 발기인의 전사 활성에 neuronal axons의 효과.
야생 형 뉴런은 조립 MCP와 axons의 오른쪽에 배양 된 축삭에 의존 GLT1 프로모터 활성화가 조립 MCP의 왼쪽에있는 GDNF의 응용 프로그램에 따라 유도했다. 모니터링하려면 axons은 조립 MCP의 왼쪽으로 유도하고 방금 입력 한 후 BAC GLT1 eGFP 마우스에서 파생 Astrocytes는 조립 MCP의 왼쪽에 배양 하였다. 육일 총 (24 시간 140 시간) 시간 경과 이미지는 실시간으로 eGFP 형광 강도의 변화와 MCP의 축삭의 성장을 모니터링 할 수 수집되었습니다. 그림 4A에 도시 된 바와 같이, astrocytes에서 아주 최소 eGFP의 형광 표현은 astrocytes의 도금에 따라 24 시간을 관찰했다. axons 잘 astrocyte 측면과 interac에있는 경우 eGFP 강도의 상당 증가 (24 시간에서 68 시간까지) 공동의 문화 후 48 시간을 관찰 할 수 있었다t 직접 astrocytes (그림 4 BC)로 연락을 취할 수 있습니다. axons은 kainite (200 μM) 조립 MCP (그림 4D-F)의 neuronal (오른쪽) 측에서 유도 neuronal 세포 죽음으로 후퇴하고 퇴화 된 후에는 다른 한편으로는, eGFP 형광 강도는 점차적으로 감소되었습니다. axons에 대응 eGFP 형광 강도의 동적 변화는 명확하게 astroglial GLT1 프로모터 활동이 축삭의 상호 작용에 의해 변조 된 것을 보여 주었다.
1 그림. 마이크로 신경 세포와 astrocyte 공동 문화 플랫폼의 개략도. 마이크로 유체 문화 플랫폼 (MCP)는 중앙 채널을 통해 연결된 2 개의 구획이 있습니다. 세포는 각면에 셀 도금 지역에서 도금 할 수 있으며, neuronal axons은 다닐로 중앙 채널을 통해 세포 보존 지역과 패스에서 유도 아르어 다른 쪽 (스케일 바 50 μm를 삽입).
그림 2. neuronal axons와 MCP MCP의 astrocyte와 axons의 상호 작용 유도. 조립 MCP의 세포 보존 지역에서 뉴런의 (A) 높은 밀도, βIII-tubulin의 immunostaining에 의해 밝혀졌습니다. 규모 바 : 중앙 채널과 MCP의 다른쪽에 체결을 넘어 axons의 전망을 확대 50 μm (B). 규모 바 : axons는 MCP의 다른 측면에 입력 할 때 빌 - tubulin의 착색에 의해 공개 100 μm (C) 축삭 성장 콘. 규모 바 : 100 μm (D)의 중심 채널을 통해 성장과 MCP의 다른 측면에 입력 축삭 번들. (E) Astrocytes는 MCP의 glial 옆에 GLT1 immunostaining에 의해 밝혀졌습니다. (F) 통합 이미지는 axons과 GLT1 긍정적 인 astrocytes 사이의 접촉을 표시합니다. 규모 바 : 50 μm.
그림 3. 기본 astrocytes의 GLT1 표현의 뉴런에 의존 유도에 GLT1 immunoreactivity (A) 차 astrocyte 문화, 규모 바 :. 50 μm (B) 차 neuronal 문화, 그리고 (C) 차 신경 세포와 astrocyte 공동 문화. 규모 바 : 뉴런이 βIII-tubulin의 immunostaining으로 표시됩니다. GLT1 immunoreactivity의 상당 증가 뉴런과 공동 문화 astrocyte에서 관찰되었다.
4 그림. BAC GLT1 eGFP의 astrocytes 및 야생 유형 뉴런과 MCP의 축삭 유도 GLT1 프로모터 활성화 시간 경과 이미지. eGFP 강도와 axons의 성장의 동적 변경 사항은 astrocyte 도금 후 6D 시간 경과 기록을 통해 수집되었다. (A) 24 (B) 48 (C) 68h (D) 92h (E) 112h (F) 140h는. 의 항목astrocyte쪽으로 xons는 (노란색 화살표로 강조 표시) 48에서 증가 eGFP 형광 강도와 연관 92h로 관찰되었다. kainite이 (200 μM) neuronal 세포 죽음과 축삭의 변성을 유도하기 위해 92h에서 neuronal 측면에 적용된 후 112h에서 140h에 발생 eGFP 형광 강도의 감소. 규모 바 : 50 μm.
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Discussion
MCP 기반의 뉴런과 astrocytes 공동 문화 시스템은 axons는 중앙 채널을 통과 허용하고 astroglial 세포와 상호 작용에 의해 astroglia 신호 경로에 대한 자세한 뉴런의 절개를 할 수 있습니다. 이 공동 문화 시스템은 편리하게 기존의 신경 세포와 astrocyte 문화 절차를 설정할 수 있습니다. 우리는 또한 astrocytes의 축삭에 의존 GLT1 프로모터 활성화를 입증 eGFP 기반 기자를 고용하여 공동 문화 시스템의 실제 응용 프로그램을 설명했다.
잘 1) 고해상도 현미경이 아래에 실시간으로 하나의 axons과 astrocytes의 명시 적 형태학의 상호 작용을 시각화하고 식별 할 수있는 능력) :이 MCP 기반의 뉴런과 astroglia 공동 문화 시스템은 기존의 공동 문화 방식에 비해 몇 가지 장점을 제공합니다 발기인 활성화의 세포 별 효과 3 약리 조작을 적용 할 제어 독립적 인 microenvironment) 분석및 단백질 표현이 독점적으로 유도 / axons 접촉에 의해 변조 된 아르 astrocytes에 - 규제. 기본 microglia 10 oligodendrocytes 11 문화 절차가 잘 확립되어,이 MCP 공동 문화 시스템은 또한 공동의 문화 oligodendrocyte에 microglia과 뉴런에 뉴런에 적용 할 수 있습니다. 한편, 우리는 또한이 공동 문화 시스템은 이러한 RNA 또는 단백질 분석 세포의 대량 분석의 종래의 방식에 보완되는 단일 세포 수준에서 민감한 이미지 분석을 위해 예정되는 것을 인식하고 있습니다. 또한, 우리의 시스템은 단일 셀 및 축삭 사이의 exemplifying 상호 작용에 의해 뉴런과 생체 내 glial 세포 사이의 거대한 상호 작용을 단순화합니다. 이 공동 문화 시스템에서 결과를 해석 할 때 다음의 모든이 고려되어야한다. CNS에서 axons과 다른 glial 세포 사이의 상호 작용은 광범위하게 존재하고 신경 세포 모두에 매우 중요하며glial 기능 12,13. 이 공동 문화 시스템의 개발이 상호 작용의 영상 기반의 절개를 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 BAC GLT1 eGFP 마우스와 GLT1 항체를 제공하기 위해 박사 제프리 Rothstein 감사드립니다, 가치의 핵심 시설을 제공하는, 신경 과학 연구 Tufts 센터 (PI, 롭 잭슨 NIH P30 NS047243), 새로운 교수 채용 기금 (NIH P30 5P30NS069254-02 , Tufts 신경 과학학과 PI, 필 Haydon).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D Systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
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| Neuron culture medium for plating cell
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| Astrocyte culture medium
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| Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
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References
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