Summary
우리는 잠재적으로 이식 거부의 높은 위험없이 이식 후 면역 억제제의 철수를 결정하는 데 사용할 수있는 유용한 진단 분석을 설명합니다. 분석은 지연 형 과민 반응의 원리를 사용하여받는 사람이 탑재 된 두 기증자 특정 이펙터 및 규제 면역 반응의 정확한 평가를 제공합니다.
Abstract
지연 형 과민 반응 (DTH)은 숙주 면역 시스템은 최근 과거에 경험있는 외국 항원 (자세)에 대한 T 세포 의존 면역 반응의 생체 징후의 급격한입니다. DTH 반응은 종종 일반적으로 감작 후 몇 일 뒤에 초기 항원 경험과 도전 단계를 참조 감작 단계로 구분됩니다. 피부 테스트에 의해 입증 리콜 AG의 지연 형 과민 반응의 부족은 종종 anergy의 증거로 간주됩니다. 기존의 DTH 분석을 효과적으로 많은 미생물 감염을 진단하는 데 사용되었습니다.
이러한 림프구 침윤, 부종 및 조직 괴사와 유사한 면역 기능을 공유에도 불구하고, 직접 DTH 때문에 기증자의 항원 및 이식 손실 감작의 결과로 직접 분사의 가능성 이식 환자에서 가능한 진단 기술이 아니다. 이 문제를 방지하려면, 험투 마우스 "트랜스 생체"DTH 분석은 1,2 개발되었다. 이 테스트는 인간의 말초 혈액 단핵 세포 (말초 혈액) 및 특정 항원 pinnae에 피하 주사 또는 순진 마우스와 DTH와 같은 부종의 노상 18-24 시간 후 3 측정 된에 기본적으로 전송 DTH 분석이다. 식세포 나 높은 혈관 마우스 조직에서 T 세포 수지상 인간 항원 제시 세포에 의해 항원 프레 젠 테이션 염증 폭포를 트리거하고 붓기 반응의 결과로 마우스 면역 세포를 끈다. 반응은 항원 특이하고 사전 항원 감작이 필요합니다. TV-DTH 분석에 긍정적 인 기증자 반응 DTH 반응은 이식 환자는 이식 alloantigens 향해 염증성 면역 처리를 개발했다고 반영합니다.
이 분석의 가장 중요한 기능은 또한 방관자 억제를 일으키는 원인이 규제 T 세포를 감지하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 의 방관자 억제기증자의 항원의 존재 DTH 리콜 응답 허용 이식 2,4-14와 이식의 특징입니다. TV-DTH에 의해 alloreactivity 및 규제에 대한 이식의 모니터링은 거부 또는 악화 신장 기능의 높은 위험없이 면역 억제제의 감소 혜택을 누릴 수있는 환자의 하위 집합을 식별 할 수 있습니다.
유망한 지역은자가 면역 15,16의 모니터링 또한 종양 면역학 17 TV-DTH 분석의 응용 프로그램입니다.
Protocol
1. 림프구의 준비
- ACD (산성 구연산 포도당) 튜브에 혈액을 수집합니다.
- 표준 방법에 따라 림프구 분리 매체를 사용하여 신선한 인간의 말초 혈액에서 PBMC를 분리합니다.
- 오염 혈소판을 제거하는 PBS로 PBMC 세 번 씻으십시오. 혈소판은 트랜스 생체 DTH 분석을 방해 발견되었다. PBMC 준비의 최대 허용 혈소판 오염 ≤ 1X10 7 / 주입이다.
- 눈에 띄는 적혈구 오염이있는 경우, 첫 번째 세척 후 ACK 용해 버퍼를 사용하여 적혈구의 용해를 수행합니다. PBS로 2 회 세척하여 ACK 버퍼를 제거합니다.
2. Alloantigen의 준비
- 위와 같이 프로 시저를 사용하여 기증자의 말초 혈액에서 PBMC를 분리합니다.
- 120x10 6 세포 / ㎖의 농도 (4X10 6 세포 / 30 μL)에서 PBS에서를 Resuspend 기증자 PBMC.
- 단백질을 방지하기 위해 혼합물에 1 μM PMSF 추가분해.
- 2 MM-프로브 sonicator로 일곱 1 초 펄스를 사용하여 세포 현탁액을 초음파 처리. (주 : 물자 감기를 유지하고 과도한 거품을 방지 거품이 발생하면, 세포 현탁액은 2 ~ 3 분 동안 얼음에 앉아 보자..)
- 혈구를 사용하여 세포의> 90 %의 중단을 확인합니다.
- 냉장의 microfuge에서 20 분 동안 4 ° C에서 14,000 rpm으로 혼합물을 원심 분리기.
- 새로운 2.0 ML 안전 잠금 튜브에 뜨는을 전송하고 단백질 농도를 결정한다.
3. 주사에 대한 세포의 준비
- 2.0 ML 안전 잠금 튜브에 각각 주입 나누어지는 7X10 6 PBMC합니다.
- 의 microfuge에서 분 동안 6,000 rpm으로 원심 분리하여 그 상등액을 제거합니다.
- PBS에서 함께 또는 항원이없는 세포를 resuspend을. PBS로 35 μL를 주입 볼륨을 조정합니다. 다음 계획은 주사에 사용됩니다 :
부정적인 제어 : PBMC + PBS
긍정적 인 제어 : PBMC + TT / DT (25 & 무; G / 주입)
실험 항원 특정 응답 : PBMC + 시험 자세 (4-8 ㎍ / 주입)
실험 항원 특정 규정 : PBMC + 시험 자세 + TT / DT
4. 사전 측정, 주입 및 사후 측정
- isoflurane을 함께 CB17 SCID 마우스를 마취. 스프링 캘리퍼스를 사용하여 후면 발바닥의 두께를 측정한다. 측정 부위의 일관성을 유지하기 위해 벤치 마크를 제공하기 위해, 하나의 가장자리 다리의 마지막 산책 패드를 만지고, 발바닥의 중심에서 캘리퍼를 넣어. 게이지 판독 값이 안정 될 때 발바닥의 두께가 기록됩니다.
- 천천히 28 게이지 바늘 ½ CC 인슐린 주사기를 사용하여 쥐의 발바닥에 피하 세포 현탁액을 주입. 바늘 발가락 향하게하고, 경사가 위를 향하도록 주입을 수행합니다. (참고 : 누수가 없는지 확인).
- 주사 후 18 ~ 24 시간은, 발바닥 부종의 isoflurane을 반복 측정에 마우스를 마취.
- Subtr발바닥 부종 값을 가져 포스트 분사 값에서 주입 전 각 발바닥의 두께 행동, 10 -4 인치의 단위로 데이터를 표현한다. 치료 (PBMC + 기증자 alloantigen, TT / DT, 또는 기증자 alloantigen + TT / DT)에서 얻은 발바닥 부종 값에서 제어 발바닥 부종 (PBMC + PBS)를 뺀 항원 특이 그물 붓기를 계산합니다. PBS에 배경 응답을 통해 ≥ 25X10 -4 인치의 항원 TT / DT를 호출하는 긍정적 인 제어 응답이 유효한 것으로 간주되는 테스트가 필요합니다.
- 다음 공식을 사용하여 각 주사의 순 붓기를 비교하여 기증자의 항원의 존재 리콜 반응의 억제를 확인합니다 :
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Representative Results
1. TV-DTH 분석을 사용하여 기증자의 항원에 특정한 응답 신장 이식의 평가
신장 이식 기증자 반응 세포 성 면역을 테스트하기 위해 우리는 기증자의 항원 단독으로 또는 리콜 항원 파상풍 톡소이드 (TT)를 가진 환자의 PBMC를 주입했다. 양성 대조군 세포는 TT 형과 주입으로. 우리는 이식 지연 형 과민 반응의 세 가지 패턴 (그림 1)을 관찰합니다. 모든 환자는 자세 (TT)를 호출하기 위해 강력하게 대응했다. 환자 중 62 기증자의 항원 공여 항원의 존재 항원 반응을 리콜 표시된 연결 억제 (67 %)에 약한 반응을 특징으로 규제 패턴을 보여줍니다. 이 장기 이식 허용과 연관된 것으로 발견 된 패턴이다. 환자의 # 48 전시 기증자에 약한 반응의 기능을하지만 연결 억제 (또는 연결된 억제 <50 %)가 비 규제 패턴. 이패턴이 자주 면역 억제제를 복용하는 환자에서 관찰되었다. 그러나 여전히 포스트 이식 면역 억제 약물을받는 일부 환자는 DTH 반응 기증자의 항원 결합 억제를 표시 할 수 있습니다. 환자 # 8 전시물 기증자의 항원에 대한 높은 반응없이 연결 억제에 의해 특징 기증자 감응 패턴. 이 응답은 임상 사례 연구에서 이식 거부 8과 연관됩니다.
2. 신장 이식의 임상 모니터링 기증자 특정 규제의 역할
PBMC는 ITN507ST 관측 재판에 등록한 과목에서 ( "식별 및 관대 한 신장 이식 환자의 기계적 조사") TV-DTH 분석 및 기증자 (또는 기증자를 사용 기증자 특정 간접 경로 T 이펙터와 T 규제 대응에 대한 검사를했다 HLA- 일치 대리) 항원. 같은 그림 2A와 같이 기증자의 항원에 대한 간접적 인 경로를 T 이펙터 응답을 계시한다등록 그룹간에 뚜렷한 스펙트럼, 만성 거부되는 것과 허용되는 것과 환자의 임상 상태의 범위로 발바닥 부종 증가합니다. 허용받는 사람 말초 혈액이 감소하거나 거부 개인의 말초 혈액 반면 더 DTH 반응은 강한 부종 반응을 트리거되지 유도.
면역 규제가 신장 이식 승인을위한 중요한 메커니즘이었다. 그림 2B 프로그램은 중간을 통해 대부분의 범위 규정 반응의 감소 (톨) 증명 연결된 억제 분석에 의해 방지 기증자 간접 경로 T 규제 응답의 측정 (모노 SI) 최소 허용 (CR) 환자 14.
3. TV-DTH 분석을 사용하여자가 면역 모니터링
유망한 지역은자가 면역의 감시에서 TV-DTH 분석의 응용 프로그램입니다. BOS의 과정에서 작은기도의 폐색 석면은 - obliterative폐 이식, 폐 이식 실패의 가장 흔한 원인이다.
이 과정에서 콜라겐 타입 V에 대한 세포 매개 면역의 역할을 테스트함으로써, 우리는 세기관지염 폐색 증후군 (BOS) 개발의 높은 상대 위험도가 자신의 콜라겐 타입 V에 대한 긍정적 인 TV-DTH 반응을 개발 한 환자에서 관찰되었다는 것을 것을을 발견했습니다 말초 혈액.
그림 3은 폐 이식에서 말초 혈액 아니라 건강한 컨트롤이나 콜라겐 IV-반응성 굿패 스처 증후군 환자에서 신장 이식 후, 자주 콜라겐 V 반응 15 것으로 나타났다.
4. 종양 면역학의 응용 프로그램
트랜스 생체 DTH는 예방 접종 치료에 전립선 암 환자의 우선 순위를 암 연구에 새로운 가능성을 열어 가고 있습니다. 규제 T 세포가 암 개발과 진행에 중요한 역할을하기 때문에, 우리는 PBMC의 반응을 테스트하기 위해 TV-DTH 사용DNA 백신 인코딩 전립선 산성 인산 가수 분해 효소 (PAP)로 치료 암 환자들. 우리는 항원 특정 규제 활동은 예방 접종에 대한 응답으로 이끌어되고 있는지 확인하기 위해 항원을 기억하는 응답의 방관자 억제를 사용했습니다. 우리는 PAP 특정 규제 T 세포가 일부 전립선 암 환자에서 자연적으로 발생하는, 예방 접종 기간 동안 지속 및 PAP 특정 이펙터 반응 후 예방 접종의 검출을 방지하였습니다. 일부 환자에서는 예방 접종하기 전에 PAP 특정 규제 T 세포 반응을 확인했다. PAP에 대한 구체적인 기존 규제 T 세포는 예방 접종 후 항원 특이 살전 형 면역 반응을 개발하는 무능력과 연관 될 수 있습니다. 또는 PAP에 대한 기존 규제 T 세포 반응은 여러 예방 접종을 다음과 이펙터 반응을 개발 가능성이 환자를 식별합니다. 그것은 개별 선택 우선 순위를하거나 제외하는 방법을 제안 할 수로 어느 쪽이든,이 분석은 중요한 관찰을 제공합니다항원 특정 백신 평가 17 idual 환자.
그림 1. 지연 형 과민 반응의 세 가지 패턴 (DTH)의 예는 신장 이식에서 발견. 환자의 말초 혈액을 리콜 항원 (TT), 기증자의 항원 하나와 함께 또는 기증자 + 리콜 항원 모두에 CB17 SCID 생쥐의 발바닥에 주입 하였다. 쇼 배경 위에 그물 붓기 응답입니다.
그림 2. . 간접 경로 T-세포 분석은 주제 5 개 그룹으로 등록 (톨) 임상 적으로 허용 쌍둥이, 스테로이드 단독 요법을(모노), 표준 면역 억제 (SI) 및 만성 거부 반응 (CR) (B) TV-DTH 분석에 의해 T 이펙터 응답 (A)와 T 규제 응답을 조사 하였다. 모든 패널 : 각 (개인 기호) 제목과 그룹 분위수와 (수평선) 중간에서 개별 결과가 표시됩니다. 그룹 사이에 유의 한 차이를 보여, * p <0.05, ** p <0.01 *** P <0.001; # p = 0.04, # # p = 0.03, # # # p = 0.008.
그림 3. TV-DTH 분석에 의한 콜라겐 타입 V 별 -자가 면역 측정. TV-DTH 반응 정상적인 건강한 통제, GPS 또는 폐 이식과 신장 이식에서 얻은 말초 혈액 있습니다. 모든 3 개는 항원을 기억하는 꼴을 (긍정적 응답 (≥ 25X10 -4 인치 그물 붓기)했다 II), 관절 연골 특정 fibrilar 콜라겐, 환자 또는 컨트롤의 TV-DTH 반응을 유도하지 않았다. GPS를 가진 신장 이식은 골 (IV)에 대한 응답을 붓기 의미 상승했다. 폐 이식은 골 (IV)에 응답하지 않았지만, 골 (V)에 대응했다.
그림 4. 종양에 의한 immunoregulation을 평가하기 위해 TV-DTH 분석의 사용. 전립선 암 환자의 PBMC는 전립선 특이 항원 (PSA) 전립선 산성 인산 가수 분해 효소 (PAP) 단독으로 또는 리콜 항원 TT / DT와 및 제어와 같은 주입과 함께 또는없이 주입 하였다 항원 TT / DT를 기억합니다. PAP 주입 + PSA의 병용 투여는 TT / DT 리콜 항원에 DTH 반응을 억제 할 수 없습니다로 TT / DT는 PAP 항원에 특정한 규제 세포를 확인 하였다.
그림 5. TV-DTH 분석의 재현성. 냉동 보관 된 세포는 1/15/2007에 leukapheresis에 의해 얻을 수는 해동 PBS로 세척하고, PBS 또는 EBV 또는 P37-TE + EBV (자기 펩티드) 또는 P37-MA + EBV (기증자 펩타이드)와 혼합 된 발바닥에 주입했다. 2008년 7월 29일, 2010-02-23, 2011-09-01, 2011-10-11, 2011-12-15 : 세포는 다음의 시점에서 테스트되었습니다.
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Discussion
트랜스 생체 DTH 분석은 이식, 암,자가 면역 질환 환자에서 세포 매개 반응을 평가하는 잠재적 인 임상 응용 프로그램과 새로운 진단 테스트입니다. 이 리콜 T 이펙터 반응을 모니터링하는 데 유용뿐만 아니라 때문에 가치가있다,뿐만 아니라 그것은 T 규제 응답을 검색 할 수 있습니다. 인간의 DTH 규제를 감지하는 신뢰할 수있는 방법은 단독 요법 또는 내성 시험에 대한 후보자 환자에서 면역 억제 금단의 안전을 예측할 수 있습니다.
TV-DTH는 MHC의 allorecognition의 간접적 인 경로를 감지 매우 민감합니다. 그러나 TV-DTH는 그대로 기증자 MHC 분자에 직접 alloresponse을 감지 수정할 수 있습니다. DTH의 기증자 항원 결합 억제를 검색하려면 단일 기증자의 HLA 클래스 I 또는 클래스 II을 표현 EBV-LCL 세포는 환자의 PBMC와 coinjected 할 수 있습니다. EBV-LCL은 DTH 분석 항원의 소스로 사용되었을 때, 세포는 10,000 라드와 감마 - 조사했고, 20 세포 공동 하였다SCID 생쥐의 발바닥에 PBMC와 함께 주입했다.
TV-DTH를 개발하는 과정에서 우리는 몇 가지 조건이 분석에 영향을 미칠 수 있음을 찾을 수 있습니다. 가장 중요한 것은 방관자 억제 검출을위한 요구 사항입니다. 우리는 도전 사이트와 마우스 입양 호스트의 immunocompetence 모두 공동 지역화 된 기증자의 항원에 대한 응답으로 리콜 DTH의 억제를 감지하기 위해서는하면 TV-DTH 시험의 감도를 제한하는 중요한 요소임을 증거를 제공했다. PBMC는 발바닥, 그리고 귀 주입, 단 면역 결핍, 면역되지 쥐 3 때 허용 이식에서 PBMC는 방관자 억제를 중재.
모든 분석과 마찬가지로 TV-DTH 테스트 강도와 약점을 가지고 있습니다. TV-DTH 분석의 엄청난 장점은 다음을 포함한다 : 1 개의 것은) 매우 민감하고 안정적으로 인간의 규제 T 세포, 2)를 검색 할 수 있습니다 그것은 그들의 기능에 의해 조절 T 세포를 감지하지 않아 t후계자 표현형, 3) 그것은 TH-1과 TH-17 이펙터 응답 4) 원유 세포 용 해물은 기증자의 항원 5)이 분석은 재현성 / 안정성 (그림 5) 선물에 대한 환자 민감하지 않고 규제를 감지하는 데 사용할 수있는 두를 감지합니다. 단점은 : 1) 주입 당 PBMC 상대적으로 많은 수를 필요 2) 기술은 특히 방관자 억제 분석에 광범위한 훈련이 필요합니다.
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Disclosures
이 논문의 저자가 공개하는 관심 없음 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 이식 규제 DTH 반응에 대한 우리의 이해의 발전에 AM VanBuskirk의 기여를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 NIH 보조금에게 PO1AI084853 및 R01AI066219-06을 지원하고, EU가 후원 한 연구가 있었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
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