ביטוי מחוץ לרחם הוא טכניקה אחת על מנת להבהיר את תפקיד רנ"א בהתפתחות המוח. עם זאת, מיקוד באזורים מסוימים באמצעות ב electroporation אובו הוא מאתגר. כאן, אנו מציגים דרך יעילה לאזורי המוח התיכון הגחון ועל גב באופן סלקטיבי electroporate.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
RNAs ללא קידוד הם שחקנים נוספים בויסות ביטוי הגנים. ממוקד ב electroporation אובו של אזורים ספציפיים מספק כלי ייחודי לשליטה במרחב ובזמן של ביטוי microRNA מחוץ לרחם. עם זאת, מבנים מוחיים הגחון כמו המוח התיכון הגחון הם די קשים להגיע לכל מניפולציות. הנה, אנחנו מדגימים דרך יעילה לelectroporate מירנה למוח תיכון הגחון באמצעות אלקטרודות פלטינה דקות. שיטה זו מציעה דרך אמינה transfect אזורים ספציפיים של המוח התיכון וכלי שימושי במחקרי vivo.
מבוא
ההכרה של RNAs ללא קידוד הקטן כמו שחקנים נוספים לביטוי גנים השיקה מורכבות חדשות לרגולציה תכנות / גן הגנומי. יש מינים שונים של RNAs ללא קידוד חשיבות תפקודית בתאים עצביים, כוללים קטן RNAs 1-4 ללא קידוד. מיקרו RNA (miR או מירנה) למשל מראה פרופילי ביטוי שונים ומשתנים במוח המתפתח 5. ממוקדת ב electroporation אובו של עובר חומוס מספקת הזדמנות ייחודית לבקרת זמן ומרחב של ביטוי גנים והשתקה במהלך פיתוח.
סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים של ביצוע ביטוי מחוץ לרחם של מירס באזורים מסוימים של המוח התיכון חומוס שימוש באוב ele....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. דרישות באוב Electroporation
- הכנת מבנה הווקטור: פריימרים תחושת miR וantisense תוכננו אחרי ההוראות של Ambion, annealed ואת הגבעול לApaI / EcoRI מתעכל וקטור U6.1 pSilencer. לאחר שינוי מוצלח אחד מהשיבוטים וכתוצאה מכך היה גדל ופלסמיד pSilencer היה מבודד על ידי שיטת תמוגה אלקליין באמצעות ערכת הכנת פוליפוני Quiagen.
- אלקטרודות: ניתן לרכוש אלקטרודות או בקלות להיבנות 13. אנו משתמשים באלקטרודות מתוצרת עצמית של חוט פלטינה (Φ = 0.2, 0.25, או 0.5 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באזור המוח התיכון transfected עם miR המידה גלויה דרך הביטוי של ה-GFP מוקטור כתב הזריק יחד עם הווקטור להביע miR (איור 2). באמצעות אלקטרודות פלטינה עם קוטר של 0.5 מ"מ והניח במקביל לציר AP של מוביל המוח התיכון בדרך כלל לtransfection של שטח נרחב לאורך DV-AP והציר, ובכלל זה למוח האחורי, המוח התיכון ולפעמים diencephalon (2A דמויות ו-B). הגודל של תוצאות אלקטרודות בשדה חשמלי רחב שהוחל על האזור במוח ובכך אזור transfected רחב.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
וידאו זה מדגים שיטה יעילה לtransfect פלסמיד לתוך תאי neuroepithelial של אזורים הספציפיים של המוח התיכון החומוס. פולסים חשמליים מלבניים של מתח נמוך יכולים להציג את ה-DNA לתוך תאים של הצינור העצבי החומוס באוב 6,16. עם זאת, הדיוק של מיקוד DNA מתעכבת לעתים קרובות על ידי השדה החשמלי הרחב, שעולה דרך אלקטרודות גדולות יחסית (Φ = 0.5 מ"מ). ניסינו להתמודד עם בעיה על ידי שימוש באלקטרודות קטנות יותר בקוטר פועל בהתאם להנחיות של Momose et al. 8.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לנו מה למסור.
תודות
אנו מכירים ק Mikic, שתרם לשלב הראשוני של הסרט הזה ומ Nicolescu לתמונת miR. ג הובר נתמכה על ידי מענק של IZKF של טובינגן Universtitätsklinikum, א 'אלווין הפר אנאנד על ידי תכנית ההון של טובינגן Universtitätsklinikum.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נימי זכוכית Borosillicate | Hartenstein | דגם: 0.9 מ"מ | |
| חולץ מיקרו-נימי | WPI, ברלין | דגם: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | דגם: TSSIC | |
| סטריאומיקרוסקופ - פלואורסצנטי | LEICA | דגם: MZFLIII | |
| סטריאומיקרוסקופ | Zeiss | דגם: Stemi | |
| מצלמה ותוכנה | Zeiss | דגם: Axiocam MRc / Axiovision Re. 4.8 |
מקורות
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
