Summary
تقنية جديدة لإنشاء استنساخه
Abstract
استخدام الفئران المعدلة وراثيا يعزز فهمنا للآليات الجزيئية الكامنة وراء عدة اضطرابات عصبية مثل إصابات الحبل الشوكي (النخاع الشوكي). مرفوعة التحكم اليدوي تستخدم لإنتاج نموذج تهتك من اصابات النخاع الشوكي يخلق الإصابات لا تتفق كثيرا ما يرتبط مع عنصر سحق أو كدمة، وبالتالي، تم تطوير تقنية جديدة. وقد حل لدينا نموذج من عنق الرحم تهتك النخاع الشوكي الصعوبات المتأصلة مع أسلوب اليدوي من خلال دمج 1) تحقيق الاستقرار في العمود الفقري العنقي بواسطة تثبيت وجه من وجوه الفقري، 2) تعزيز التعرض الحبل الشوكي، و 3) إنشاء تهتك استنساخه من الحبل الشوكي باستخدام شفرة تتأرجح مع دقة ± 0.01 ملم في العمق بدون كدمة المرتبطة بها. بالمقارنة مع الطرق المعيارية لخلق تهتك النخاع الشوكي مثل استخدام مرفوعة من مشرط أو مقص، أنتجت طريقة لدينا آفة متسقة. وهذه الطريقة مفيدة لإجراء دراسات عن تجدد المحاور من corticospإينال، حمراوي نخاعي، ومساحات تصاعدي الظهرية.
Introduction
توافر الفئران المعدلة وراثيا هو أداة قوية لتحديد آثار جينات معينة تلعب دورا في آليات اصابات النخاع الشوكي. تهتك النخاع الشوكي هو نموذج هامة تستخدم لدراسة العوامل العلاجية أو الجزيئات التي يمكن أن توفر العلاج الفعال بعد هذه الاصابة 8. تثبيت من العمليات الشائكة خلال إنشاء إصابة تمزق في الفئران غير دقيقة بسبب صعوبة في استيعاب عمليات رقيقة وهشة الشائكة المشاركة مع الحفاظ على تثبيت العمود الفقري 5،11. تقلب في عمق تهتك من 0.2 ملم فقط (10٪ من القطر من الحبل الشوكي الماوس) يؤدي التفسير المضلل من البيانات. طبيعة ومدى الحبل الشوكي الآفة تهتك يجب تعريفها بدقة 10. لمواجهة هذا التحدي، قمنا بتطوير تقنية جديدة تتألف من استقرار العمود الفقري وتستخدم شفرات ملفقة تعلق على لويزفيل الاصابات جهاز نظام (LISA) لإنتاج تهتك النخاع الشوكي 7،14. تم إنشاء هذه الإصابة باستخدام شفرة حادة تتأرجح أن تجنب تشويه الأنسجة أثناء عملية تهتك. كان عمق تهتك دقيقة إلى دقة 0.01 ملم باستخدام الصغرى السائقين التي تتحكم في عمق تهتك. هي حسب الطلب شفرات القطع إلى الأشكال والاعراض محددة لإنشاء تهتك المطلوب كفاف 9. علينا أن نظهر 1) طريقة التعرض العمود الفقري العنقي، 2) أسلوب تحقيق الاستقرار الفقري باستخدام جهاز تثبيت الوجه الثنائية، و3) إنشاء إصابة تهتك عنق الرحم باستخدام شفرة تهتز.
Protocol
1. إعداد الحيوان وتطبيق مثبت العمود الفقري
الماوس العمود الفقري العنقي هو مقعر البطني كما يرى من وجهة النظر الجانبي. العمليات الشائكة من C3 إلى T1 صغيرة وقابلة للتفتيت، وبالتالي، ليست مناسبة لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري كما هو موضح عادة 3،4. نحن نوصي بأن استقرار العمود الفقري أن يؤديها الوحشي تثبيت الوجه. يتكون الجهاز من تثبيت قناة معدنية على شكل حرف U لدعم الماوس واثنين قابل للتعديل الأسلحة الفولاذ المقاوم للصدأ المشبك إلى أن كل وجه من وجوه أفقيا. وهذا يوفر الشلل الممتاز للفقرة الهدف. بعد تثبيت العمود الفقري، والعمود الفقري ومرتفعة قليلا لشد انحناء العمود الفقري العنقي لتوفير أفضل التعرض للحبل الشوكي.
- تعقيم الأدوات الجراحية التالية: 2-3 أزواج من ملقط، 2 أزواج من microscissors، 30 G إبرة، إبرة خياطة وحامل، ومقاطع الجلد، وكليب قضيب. تطهير استقرار العمود الفقري. انيسthetize الماوس باستخدام كوكتيل داخل الصفاق الكيتامين / زيلازين (100 ملغ / 10 ملغ / كلغ). حلاقة الشعر من رقبة الفأر.
- بعد تنظيف البشرة بمحلول اليود بوفيدون والكحول 70٪، حرك الماوس على طاولة العمليات تحسنت مع وسادة التدفئة. تغطية عيون الحيوان مع مرهم للعين لمنع جفاف القرنية.
- بعد تحريض التخدير (الذي تم التوصل إليه عندما الماوس لا يستجيب لقرصة الذيل)، وجعل الخلفي عنق الرحم خط الوسط شق الجلد من قفا إلى الدهون تحت الجلد وسادة من العمود الفقري العنقي أقل. تحت التكبير، إجراء شق خط الوسط بين العضلات شبه المنحرفة في C2 وتقسيم عضلات الرأس الشوكية النصفية. التعرف على وسادة من الدهون تحت عضليه يسهل تشريح في طبقة الصحيح.
- تمديد تشريح العضلات خط الوسط نحو caudally إلى العملية الشائكة T2 التي هي بمثابة علامة بارزة موثوق بها. قطع العضلات التي تعلق على فقرة T2 وإزالة جزء غضروفي من T2العملية الشائكة.
- تشريح عضلات محيطة بالنخاع من C2 من خلال صفيحة T2 باستخدام زوج من مقص الصغرى. تشريح العضلات يبدأ المتاخمة للعمليات الشائكة، ويمتد على أساس ثنائي لمفاصل. فصل عضلات المجاورة على الفور إلى العمليات الشائكة والصفائح (في طبقة السمحاق) لتقليل النزيف. بعد يتعرض لها جوانب الجانبية، ضع الماوس على القناة على شكل U للمرحلة LISA.
- إرفاق الأسلحة الفولاذ المقاوم للصدأ تحت الأوجه يتعرض الثنائي. وبمجرد أن الأسلحة هي في مكان، وتشديد الخناق الإبهام من الأسلحة الصلب لشل حركة العمود الفقري. هذا يحافظ على تثبيت شركة للفقرة المستهدفة ويوفر التعرض ممتازة. ويمكن تعديل الأسلحة إلى توفير التوجيه الأفقي دقيقة في العمود الفقري.
- شق الرباط الأصفر بين C5 و C6 لفضح الكامنة الجافية. بين الفضاء بين الصفائح، واستخدام إبرة G 30 لإنشاء durotomy صغيرة يتم من خلالها وضع microscissors إلىتمديد durotomy. الحبل الشوكي هو الآن على استعداد للخضوع لآفة تهتك للرقابة.
2. تهتك عنق الرحم العمود الفقري الحبل باستخدام جهاز LISA
- العرض من عنق الرحم توسيع الحبل الشوكي تختلف في مستويات مختلفة. جعل آفة تنصيف الظهرية في C5-6 باستخدام 2.3 مم شفرة مسطحة وتعيين السعة من اهتزاز لتغطية كامل عرض من الحبل الشوكي. ويتم الحصول على شفرات من الجميلة العلوم أدوات شركة (فوستر سيتي، كاليفورنيا) وتعديلها لتمزق الحبل الشوكي. الحفاظ على السعة من التذبذب في شفرة ≥ 0.5 ملم، حيث أن مستويات السعة أقل سوف يقلل من سهولة تمزق الحبل.
- ضع استقرار العمود الفقري والفأر على المسرح ليزا. يتم إرفاق نصل إلى ليزا مع موقفها يسيطر عليها الصغرى السائقين قادرة على ثلاثة نطاقات للحركة. يتم وصف مكونات ليزا وظائفهم في الشكل 1.
- السلطة التبديل شفرة تهتز على. تحت magnification، حرك الماوس بحيث يتم وضع الحبل الشوكي معرضة مباشرة تحت شفرة تهتز.
- رفع دعم المرحلة الماوس نحو النصل تتأرجح. يتم تسجيل موقف "0" عندما نصل بالكاد تلامس الوريد الظهري في النخاع الشوكي. قياس عمق تمزق الحبل الشوكي النسبي لموقف "0".
- رفع موقف المرحلة عن طريق التحكم سائق الصغرى: 360 ° بدوره من مقبض الباب سائق الصغرى يرفع المرحلة بنسبة 0.25 ملم. وبالتالي، يتم إنشاء 0.75 مم الظهرية الآفة تنصيف بتدوير مقبض سائق الدقيقة 3 مرات. دقة الآفة هو ± 0.01 ملم. كما يبدأ نصل إلى ممزق النخاع الشوكي، على تليين الجراحي الميداني مع الري المالحة. يتم التحكم في عمق القطع في الحبل الشوكي من قبل سائق الجزئي الرأسي ومستقلة عن التوجيه البصري.
- مرة واحدة وقد تم التوصل إلى عمق محدد سلفا، أدر مفتاح تهتز قبالة. من الناحية المثالية، يتم وضع شفرة تتأرجح في لالفجوة esion دون وجود أدلة من تشوه الأنسجة. خفض مرحلة من شفرة قطع وإزالة الدم والمالحة من الميدان الجراحي باستخدام القطن Q-نصائح. يحدث عفويا في الارقاء <1 دقيقة.
- الافراج عن الماوس من استقرار العمود الفقري. تقريبي عضلات محيطة بالنخاع باستخدام 6-0 خياطة الحرير وإغلاق الجرح الجلد باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ كليب ميشال.
3. رعاية الحيوان
- حقن تحت الجلد ما مجموعه 1-2 مل المالحة للحفاظ على الماء الكافي ووضع الماوس في قفص الانتعاش على وسادة التدفئة في حين اسعافه.
- توفير المياه والناعمة عفوي الغذاء وإدارة المسكنات لمدة 48 ساعة بعد الجراحة. ليست هناك حاجة للحصول على الرعاية المثانة بعد تنصيف الظهري في النخاع الشوكي.
Representative Results
الشلل في فقرة هدف له أهمية كبيرة في توليد الآفات دقيقة من الحبل الشوكي الماوس. لدينا جهاز تثبيت العمود الفقري يتغلب على القضايا التشريحية من العمليات الشائكة قصيرة وقعس بطني من الفأرة العمود الفقري العنقي. الفقرة العنقية يتعرضون جيدا باستخدام لدينا استقرار العمود الفقري العنقي (الشكل 2). لدينا العمود الفقري الماوس استقرار الجهاز هو أسلوب موثوق بها لإعداد العمود الفقري لإجراءات الحبل الشوكي عنق الرحم. عمق الآفة باستخدام ليزا هي دقيقة إلى 0.01 ملم 6،13. وتهتك دقيق يسبب أي كدمة في واجهة الآفة / الأنسجة (الشكل 3). وقد تجلى دقة الآفات تنصيف الظهرية في C57BL / 6 الفئران في دراسة عن تجدد المحاور فيه 0.9 مم تهتك عميق امتد أبعد من مجرد القناة المركزية في أكده أقسام المرضية من الحبل الشوكي 1 كل عينة. تنقل جميع هذه الحيوانات استردادإد تتبع هذا الحبل الشوكي إصابة تمزق.
الشكل 1. (A) الماوس في استقرار العمود الفقري وضعت على المسرح ليزا. يتم توجيه شفرة تهتز نحو الحبل الشوكي إلى أن المتهتك. وتقع الضوابط سائق الصغرى تحت خشبة المسرح، ومصممة لوضع الماوس في الموقع المناسب. يتحكم في الدقيقة سائق عمودي عمق الآفة، ومقبض الباب إمالة يتحكم في المستوى الأفقي من الحبل الشوكي لمنع التزوي من تهتك. التبديل على الخروج يتحكم في اهتزاز المحرك، ومفتاح آخر يقوم بتعديل مدى اتساع هذه الظاهرة. (B) A 0.75 مم الظهرية تنصيف آفة تهتك خفض تحت أقواس الصفحي سليمة.
الشكل 2. (A) واستقرار العمود الفقري الماوس يتكون من قناة على شكل حرف U واثنين من الأسلحة والموصلات. يتم وضع الماوس في الحوض الصغير C تستخدم لعنق الرحم واصابات النخاع الشوكي في الحوض الصغير T لاصابات النخاع الشوكي الصدري. (B) هي تركز اهتمامها في العمود الفقري العنقي عن طريق وضع السلاح تحت الأوجه الجانبية ثم قفل مسامير الإبهام. يتعرض الجافية بين الصفائح من C5-6، C6-7، وC7-T1 دون أي إزالة العظام.
الشكل (3). أربعة جروح الحبل الشوكي الظهري في أعماق 0.5، 0.8، 1.1، و 1.4 مم لوحظ في عرض السهمي (الكريزيل البنفسجية ويوزين وصمة عار) التي تصور درجة عالية من الدقة باستخدام هذه التقنية.
Discussion
لقد تم الحصول على استقرار العمود الفقري قبل إلى وقوع إصابات تهتك إلى الحبل الشوكي عن طريق تثبيت من العمليات الشائكة. كل من عنق الرحم العمود الفقري منحنى قعسي والتعلق من المشابك إلى تفتيت قصيرة العمليات الشائكة عنق الرحم من C3 من خلال T1 في الماوس منع استقرار العمود الفقري فعالة. وعلاوة على ذلك، واستخدام شفرة حلاقة أو microscissors تستخدم تحت التحكم اليدوي يسبب تشوه الأنسجة الهامة التي يخلق التباين في عمق الآفة 6. وهذا قد يؤدي إلى سوء تفسير البيانات وخاصة عندما يتم درس تجدد المحاور من مسارات محددة. على سبيل المثال، قد يساء تفسيرها يدخر المحاور القشري الظهرية كما المحاور مجدد إذا لم يكن مقطوع في السبيل القشري النخاعي الظهرية تماما في وقت lesioning. هذه التحديات يمكن التغلب عليها باستخدام جهاز تثبيت العمود الفقري مع تثبيت للجوانب على مستوى واحد وlesioning دقيقة من الحبل الشوكي. بالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام هIGH تردد شفرة تتأرجح تنتج تهتك حاد دون سحق أو contusing النخاع الشوكي المجاورة. وقد استخدمت هذه الطريقة لإنتاج الشوكي اصابات الحبل تهتك في الفئران 9،12،14، مع التعديلات اللاحقة لإنتاج الصدري جروح الحبل الشوكي لدى الفئران 6. في هذا البلاغ، ونحن تصف طريقة لإنشاء موثوق بها تهتك عنق الرحم الآفات في الماوس.
بقدر القطر الأمامي الخلفي من الحبل الشوكي هو <2 مم في الماوس، أعماق الدقيق للآفة تهتك حيوية في خلق نموذج تجريبي موثوق بها. سوف تقلب الدنيا في عمق الآفة تغيير كبير نتائج التجارب تقييم تجديد محوار فضلا عن دراسات الحجمي والسلوكية. دقة عمق الآفة باستخدام هذا الأسلوب هو ± 0.01 ملم لأننا المستخدمة والدقة المتناهية الصغر السائقين عالية للسيطرة على الموقف من شفرة القطع. وقد خفضت هذه الطريقة عدم الاتساق فيمتأصل في نماذج أخرى من خلق تهتك النخاع الشوكي. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في دراسة تجدد المحاور مسارات الحبل الشوكي طويلة تقع في النصف الظهري في النخاع الشوكي، مثل السبيل القشري النخاعي، والمسالك حمراوي نخاعي، والمسالك الصاعدة الظهرية. مع هذا الأسلوب، يمكن لهذه الألياف تكون مساحات تماما ومقطوع بشكل موثوق. وفي هذا الصدد، يتم الحد من الأخطاء لتفسير البيانات، وبالتالي تحسين موثوقية التقارير من الدراسات التجريبية على اصابات النخاع الشوكي.
في ملخص، التي وصفناها تقنية جديدة لخلق نموذج يمكن استنساخه في الجسم الحي من عنق الرحم الحبل الشوكي إصابة تمزق في الماوس. ويستند هذا الأسلوب على استقرار العمود الفقري عن طريق تثبيت للجوانب عنق الرحم وتهتك في النخاع الشوكي باستخدام شفرة تتأرجح. باستخدام هذا الأسلوب في الحبل الشوكي الصدري نموذج تهتك الظهرية في الفئران 6، أثبتنا وجود علاقة بين عمق ضيق تهتك، علم الأنسجة، وانتعاش السلوك. تم العثور على هذه التقنية أيضا أن تكون موثوق بها من قبل العديد من المختبرات الأخرى 2،12.
Disclosures
- العديد من الكتاب (YPZ، XMX، CBS) لديهم مصلحة مالية في لويزفيل المتصادم النظام، وشركة
- الكتاب، يي بينغ تشانغ، ليزا يكون كدروع، وكريستوفر B. شيلدز، والعاملين في الرعاية الصحية نورتون، لويزفيل، KY. ويعمل مؤلفين آخرين من جامعة إنديانا، إنديانابوليس، IN.
- على غرار الكتاب لا تتلقى تمويلا من أي شركة التي تنتج الكواشف أو الأدوات المستخدمة في هذه المقالة.
Acknowledgments
وأيد تطوير هذا الجهاز من قبل شركة ليزا، لويزفيل، كنتاكي. نحن نعترف أيضا الدعم المستمر من نورتون للرعاية الصحية، لويزفيل، KY لشبكة سي بي اس، والمعاهد الوطنية للصحة NS050243، NS052290، وNS059622 إلى XMX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
