Summary
En ny teknik för att skapa en reproducerbar
Abstract
Användning av genetiskt modifierade möss ökar vår förståelse av molekylära mekanismer bakom flera neurologiska sjukdomar som en ryggmärgsskada (SCI). Freehand manuell styrning används för att producera ett skärsår modell av SCI skapar inkonsekventa skador ofta förknippas med en fruktdryck eller kontusion komponent och därför behövdes en ny teknik utvecklats. Vår modell av livmoderhalscancer skärsår SCI har löst inneboende svårigheter med frihand metoden genom att införliva 1) livmoderhalscancer vertebral stabilisering av ryggraden aspekt fixering, 2) ökad ryggmärgen exponering, och 3) skapande av en reproducerbar skärsår av ryggmärgen med en oscillerande klinga med en noggrannhet av ± 0,01 mm i djup utan associerad kontusion. Jämfört med de vanliga metoderna för att skapa en SCI skärsår såsom frihand användning av en skalpell eller sax, har vår metod fram en konsekvent lesion. Denna metod är användbar för studier av axonal återbildning av corticospnalet, rubrospinala och dorsala stigande skrifter.
Introduction
Tillgången på genetiskt modifierade möss är ett kraftfullt verktyg för att identifiera effekterna av specifika gener som spelar en roll i mekanismerna för SCI. Laceration SCI är en viktig modell som används för att undersöka terapeutiska medel eller molekyler som kan ge effektiv behandling efter denna skada 8. Fixering av spinalutskotten under skapandet av skärsår skada i möss är otydlig på grund av svårigheten att förstå de tunna och sköra spinous processer med upprätthållande spinalfixering 5,11. Variationen i djupet av laceration av endast 0,2 mm (10% av diametern av musen ryggmärgen) orsakar missledande tolkning av data. Arten och omfattningen av ryggmärgen laceration lesion måste definieras 10. För att möta denna utmaning, har vi utvecklat en ny teknik som består av vertebral stabilisering och använde påhittade blad bifogas Louisville Injury System Apparat (LISA) för att producera en laceration SCI 7,14. Denna skada har skapats med hjälp av en kraftig oscillerande kniv som undvek vävnad deformation under laceration processen. Djupet av laceration var exakt med en noggrannhet av 0,01 mm genom att använda mikro-drivrutiner som styr laceration djupet. Kapskivor är skräddarsydda för specifika former och bredder för att skapa den önskade laceration konturen 9. Vi demonstrerar 1) metoden för halsryggen exponering, 2) tekniken med vertebral stabilisering med hjälp av en bilateral enhet fasett fixering, och 3) att skapa en livmoderhalscancer skärsår skada med ett vibrerande blad.
Protocol
Ett. Animal utarbetande och tillämpning av Spine Stabilizer
Musen halsryggen är konkav ventralt sett från lateral vy. Spinalutskotten från C3 till T1 är små och sköra och därför inte lämpliga för vertebral stabilisering som beskrivs vanligen 3,4. Vi rekommenderar att ryggraden stabilisering utföras av laterala aspekt fixering. Fixeringen Anordningen består av en U-formad metall kanal för att stödja musen och två justerbara rostfria armar stål som klämma till varje aspekt sidled. Detta ger utmärkt immobilisering av målet ryggkotan. Efter ryggradsfixering är ryggraden något förhöjd för att platta till halskotpelaren krökning för att åstadkomma bättre exponering av ryggmärgen.
- Sterilisera följande kirurgiska instrument: 2-3 par pincett, 2 par microscissors, en 30 G nål, sutur och nål hållare, clips hud och klipp applikator. Desinficera ryggraden stabilisatorn. Anesthetize musen med en intraperitoneal cocktail av ketamin / xylazin (100 mg / 10 mg / kg). Raka håret från musens nacke.
- Efter hudrengöring med povidon-jodlösning och 70% alkohol, flytta musen på operationsbordet värmas med en värmedyna. Täck djurets ögon med oftalmologiska salva för att förhindra hornhinnan torkning.
- Efter induktion av anestesi (nåtts när musen inte svarar på en svans nypa), gör en bakre livmoderhalscancer snitt mittlinjen hud från nackknöl till underhudsfettet-pad av den nedre halsryggen. Under förstoring, utför en mittlinjen snitt mellan trapeziusmusklerna på C2 och dela musklerna semispinalis capitis. Identifiering av submuscular fett pad underlättar dissektion i rätt lager.
- Förläng mittlinjen muskler dissektion caudally till T2 taggutskottet som fungerar som ett pålitligt landmärke. Skär musklerna bifogas T2 kotan och ta bort brosk delen av T2processus spinosus.
- Dissekera paraspinal musklerna från C2 till T2 lamellerna med hjälp av ett par mikro-sax. Muscle dissekering börjar intill spinalutskotten och sträcker bilateralt till facettleder. Separera musklerna omedelbart intill spinalutskotten och laminat (i periosteala skiktet) för att minimera blödning. Efter de laterala aspekterna är exponerade, placera musen på den U-formade kanalen av LISA scenen.
- Fäst de rostfria armar nedanför exponerade fasetter bilateralt. När armarna är på plats, dra åt tumskruvarna på de stålarmar att immobilisera ryggraden. Detta bibehåller fast fixering av målet kotan och ger utmärkt exponering. Armarna kan justeras för att ge exakt horisontell orientering av ryggraden.
- Incise ligamentum flavum mellan C5 och C6 att exponera underliggande dura. Mellan interlaminär utrymme, använd en 30 G nål för att skapa en liten durotomy genom vilka microscissors placeras tillförlänga durotomy. Ryggmärgen är nu beredda att genomgå kontrollerad laceration lesion.
2. Cervikal Spinal Cord Laceration Använda LISA Device
- Bredden på den cervikala ryggmärgen utvidgningen varierar på olika nivåer. Gör en dorsal hemisection lesion vid C5-6 med användning av en 2,3 mm platta blad och ställa in amplituden för vibrationen för att täcka hela bredden av ryggmärgen. Blades erhålles från Fine Science Tools Inc. (Foster City, CA) och ändras för ryggmärgen laceration. Bibehåll amplituden för bladets oscillation vid ≥ 0,5 mm, eftersom lägre amplitudnivåer kommer att minska den lätthet av sladd laceration.
- Placera ryggraden stabilisatorn och mus på LISA scenen. Bladet är ansluten till LISA med sin position kontrolleras av mikro-drivrutiner kan tre serier av rörelse. Komponenter i LISA och deras funktioner beskrivs i figur 1.
- Ström bladet vibrerar slå på. Under magnifblue, flytta musen så att den exponerade ryggmärgen är placerad direkt under vibrationsblad.
- Höj scenen stödja musen mot den oscillerande kniven. Den "0" registreras när bladet knappt vidrör dorsala venen av ryggmärgen. Mät djupet av ryggmärgen laceration förhållande till "0"-läge.
- Höj scenen position genom mikro-förarkontroll: a 360 ° sväng av mikro-föraren ratten höjer scenen med 0,25 mm. Således är en 0,75 mm dorsal hemisection lesion skapas genom att vrida på mikro-föraren ratten 3 gånger. Noggrannheten av lesionen är ± 0,01 mm. När bladet börjar att sarga ryggmärgen, smörj det kirurgiska området med koksaltlösning bevattning. Den skärande djup av ryggmärgen styrs av vertikal mikro-drivrutin och är oberoende av visuell vägledning.
- När väl det förutbestämda djupet har uppnåtts, vrid vibrerande frånslag. Idealt är oscillerande bladet placerad i Lesion gap utan bevis av vävnad deformation. Sänk scenen från kniven och ta bort blod och saltlösning från det kirurgiska området med bomull Q-tips. Hemostas sker spontant i <1 min.
- Släpp musen från ryggraden stabilisatorn. Ungefärliga de paraspinal muskler med 6-0 silke sutur och stäng hudsår med rostfria Michel klipp.
Tre. Animal Care
- Subkutant injicera totalt 1-2 ml koksaltlösning för att upprätthålla adekvat hydrering och placera musen i återhämtningen buren på en värmedyna medan återfår medvetandet.
- Ge vatten och mjuk mat ad lib och administrera analgetika under 48 timmar postoperativt. Det finns inget behov av urinblåsan vård efter rygg hemisection av ryggmärgen.
Representative Results
Immobilisering av mål-kota är av stor betydelse för att generera exakta lesioner i ryggmärgen hos möss. Vår ryggrad Stabiliseringsanordningen övervinner de anatomiska frågor av korta spinalutskotten och ventrala lordos av musen halsryggen. Den halskotor är väl exponerade för att använda vår halskotpelaren stabilisator (Figur 2). Vår mus ryggraden stabiliserande enhet är en tillförlitlig teknik för att förbereda ryggraden för livmoderhalscancer ryggmärgen förfaranden. Djupet av lesionen med LISA är korrekt till 0,01 mm 6,13. Den exakta skärsår orsakar ingen kontusion vid lesion / vävnad gränssnittet (Figur 3). Precisionen av de dorsala hemisection lesioner visades i C57BL / 6 möss i en studie om axonal återbildning i vilken en 0,9 mm djup laceration utvidgas precis bortom den centrala kanalen i varje prov bekräftades genom patologiska sektioner av ryggmärgen 1. Locomotion av alla dessa djur återhämtaed följer denna ryggmärgsskada sladd skärsår.
Figur 1. (A) Musen i ryggraden stabilisatorn placerad på LISA scenen. Den vibrerande bladet riktas mot ryggmärgen som ska sargade. Micro-föraren kontroller finns lokaliserade nedanför scenen och är utformade för att placera musen på lämpligt ställe. Den vertikala mikro-föraren styr lesionen djup och lutning styr ratten horisontalplanet av ryggmärgen för att förhindra vinkling av rivsår. Den on-off switch styr vibrationer motor, och en annan ratt justerar dess amplitud. (B) A 0.75 mm rygg hemisection skärsår lesion klippa nedanför intakta laminära valv.
Figur 2. (A) Musen ryggrad stabilisator bestående av en U-formad kanal och två armar och kontaktdon. Musen placeras i C tråg används för cervical SCI och i T tråg för thoracic SCI. (B) Den cervikala ryggrad fixeras genom att placera armar under de laterala facetter och sedan låsa vingskruvarna. Den Dura är exponerad mellan lamellerna av C5-6, C6-7, och C7-T1 utan avlägsnande av ben.
Figur 3. Fyra dorsala ryggmärgen skärsår på djup av 0,5, 0,8, 1,1 och 1,4 mm som observerats i sagittalvy (kresyl-violett och eosin färgning) som visar den höga grad av precision med hjälp av denna teknik.
Discussion
Vertebral stabilisering innan skärsår skador på ryggmärgen har erhållits genom fixering av spinalutskotten. Både halsryggen lordotiska kurva och fastsättning av klämmor till spröda korta livmoderhalscancer spinalutskotten från C3 till T1 i musen förhindra effektiv rygg stabilisering. Vidare användning av ett rakblad eller microscissors utnyttjas under manuell kontroll orsakar betydande vävnad deformation som skapar variation i djupet av lesionen 6. Detta kan leda till feltolkning av data speciellt när axonal regeneration av specifika vägar studeras. Exempelvis kan besparas dorsala corticospinal axoner misstolkas som regenererade axoner om den dorsala kortikospinala tarmkanalen inte var helt transekterades vid tidpunkten för lesionering. Dessa utmaningar kan övervinnas med hjälp av en anordning rygg stabilisering med fixering till fasetter på en enda nivå och exakt lesionering av ryggmärgen. Dessutom använder ahigh frekvens oscillerande blad ger en skarp skärsår utan att krossa eller contusing intilliggande ryggmärgen. Denna metod har använts för att framställa ryggmärgsskador skärsår i råtta 9,12,14, med efterföljande ändringar producera bröstkorg ryggmärgen sår i möss 6. I detta meddelande beskriver vi metoden för att skapa tillförlitliga livmoderhalscancer skärsår lesioner i musen.
I den mån den anteroposteriora diametern av ryggmärgen är <2 mm i musen, exakta djupet av laceration lesionen är avgörande för att skapa en tillförlitlig experimentell modell. Minimal variabilitet i lesionen djupet kommer att avsevärt ändra resultaten av experiment utvärderar axonregeneration samt volymetrisk och beteendestudier. Noggrannheten för lesionen djup med hjälp av denna metod är ± 0,01 mm eftersom vi använt hög precision mikroelement för att styra läget hos skärbladet. Denna metod har minskat inkonsekvens iHerent på andra modeller för att skapa ett skärsår SCI. Denna metod är särskilt användbar för att studera axonal återbildning av den långa ryggmärgen vägar ligger i den dorsala hälften av ryggmärgen, såsom kortikospinala tarmkanalen, det rubrospinala tarmkanalen och den dorsala uppstigande tarmkanalen. Med denna metod kan dessa fiberområden vara fullständigt och tillförlitligt transected. I detta avseende är oriktig tolkning av data minimeras, och därigenom förbättra tillförlitligheten i rapporteringen av experimentella studier på SCI.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit en ny teknik för att skapa en reproducerbar in vivo-modell av cervikal ryggmärg laceration skada i mus. Denna teknik är baserad på ryggraden stabilisering genom fixering av de cervikala fasetter och laceration av ryggmärgen med användning av en oscillerande kniv. Med denna metod i en rygg bröstkorg ryggmärgen skärsår hos möss 6 visade vi en stram korrelation mellan laceration djupet, histologi, ochbeteende återhämtning. En sådan teknik har även visat sig vara tillförlitliga av flera andra laboratorier 2,12.
Disclosures
- Flera författare (YPZ, XMX, CBS) har ett ekonomiskt intresse i Louisville Impactor System, Inc.
- Författarna, Yi Ping Zhang, Lisa BE Shields och Christopher B. Shields, är anställda av Norton Healthcare, Louisville, KY. Andra författare är anställda vid Indiana University, Indianapolis, IN.
- Författarna fick inte stöd från något företag som producerar reagenser eller instrument som används i den här artikeln.
Acknowledgments
Utvecklingen av denna enhet stöddes av LISA Co, Louisville, Kentucky. Vi erkänner också den pågående stöd för Norton Healthcare, Louisville, KY till CBS, och NIH NS050243, NS052290 och NS059622 till XMX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
