En ny teknikk for å skape en reproduserbar<em> In vivo</em> Modell av cervical ryggmargen sårskader skade i musen er beskrevet. Denne teknikken er basert på ryggraden stabilisering ved fiksering av de cervikale fasetter og laceration i ryggmargen ved hjelp av en oscillerende stang med en nøyaktighet på ± 0,01 mm.
Anvendelse av genetisk modifiserte mus forbedrer forståelsen av molekylære mekanismene bak flere neurologiske forstyrrelser slik som en ryggmargsskade (SCI). Frihånd manuell kontroll som brukes til å produsere en rift modell av SCI skaper inkonsekvent skader som ofte forbindes med en klem eller contusion komponent, og derfor ble en ny metode utviklet. Vår modell av cervical sårskader SCI har løst iboende problemer med frihånd metode ved å innlemme en) cervical vertebral stabilisering av ryggvirvel fasett fiksering, 2) økt ryggmargen eksponering, og 3) etableringen av en reproduserbar laceration av ryggmargen med en oscillerende blad med en nøyaktighet på ± 0.01 mm i dybden uten assosiert contusion. Sammenlignet med standard metoder for å skape en SCI sårskader som frihånd bruk av en skalpell eller saks, har vår metode produsert en konsekvent lesjon. Denne metoden er nyttig for studier av aksonal regenerasjon av corticospinal, rubrospinal og rygg stigende traktater.
Tilgjengeligheten av genmodifiserte mus er et kraftig verktøy for å kartlegge effekten av spesifikke gener som spiller en rolle i mekanismene for SCI. Sårskader SCI er en viktig modell brukes til å undersøke terapeutiske midler eller molekyler som kan gi effektiv behandling etter denne skaden åtte. Fiksering av spinous prosesser under etableringen av sårskader skader hos mus er upresis på grunn av vanskeligheter med å fatte de tynne og skjøre spinous prosesser som er involvert med å opprettholde spinal fiksering 5,11. Variasjon i dybden av sårskader på kun 0,2 mm (10% av diameteren av musen ryggmarg) fører misvisende tolkning av dataene. Typen og omfanget av ryggmargen sårskader lesjon må være presist definert 10. For å møte denne utfordringen, har vi utviklet en ny metode som består av ryggvirvel stabilisering og brukt fabrikkerte blader festet til Louisville Injury System Apparatus (LISA) for å produsere en laceration SCI 7,14. Denne skaden ble opprettet ved hjelp av en skarp oscillerende blad som unngikk vev deformasjon under sårskader prosessen. Dybden av sårskader var nøyaktig til en nøyaktighet på 0,01 mm ved hjelp av mikro-drivere som styrer sårskader dybde. Knivene er skreddersydd til bestemte former og bredder for å skape den ønskede laceration kontur ni. Vi demonstrerer 1) metoden for cervical spine eksponering, 2) teknikken for ryggvirvel stabilisering ved hjelp av en bilateral fasett fiksering enhet, og 3) etableringen av en cervical laceration skade ved hjelp av en vibrerende blad.
Ryggvirvel stabilisering før laceration skader i ryggmargen har blitt oppnådd ved fiksering i spinous prosesser. Både cervical spine lordotic kurve og festing av klemmer til bulk korte cervical spinous prosesser fra C3 gjennom T1 i musen hindre effektiv ryggraden stabilisering. Videre bruk av et barberblad eller microscissors utnyttet kontrolleres manuelt forårsaker betydelig vev deformasjon som skaper variasjon i dybden av lesjon seks. Dette kan føre til feiltolkning av data spesielt når aksonal regenerasjon av konkrete trasé er studert. For eksempel kan spart rygg corticospinal axoner mistolkes som regenerert axoner hvis dorsal corticospinal skrift ikke ble fullstendig transektert på tidspunktet for lesioning. Disse utfordringene kan løses ved hjelp av en ryggrad stabilisering enheten med fiksering til de fasetter på et enkelt nivå og presis lesioning av ryggmargen. I tillegg bruker ahigh frekvens oscillerende blad gir et skarpt laceration uten å knuse eller contusing tilstøtende ryggmarg. Denne metoden har blitt brukt til å produsere ryggmargen laceration skader hos rotter 9,12,14, med senere endringer for å produsere thorax ryggmargen flenger i mus 6. I denne henvendelsen, beskriver vi metoden for å skape pålitelige livmorhalskreft laceration lesjoner i mus.
I den utstrekning anteroposterior diameter av ryggmargen er <2 mm i musen, presise dypet av sårskader lesjon er avgjørende for å skape et pålitelig eksperimentell modell. Minimal variasjon i lesjon dybde vil vesentlig endre resultatene av eksperimenter vurdere axon regenerering samt volum og atferdsmessige studier. Nøyaktigheten av lesjon dybde ved hjelp av denne metode er ± 0,01 mm fordi vi brukte høy presisjon mikroelementer for å kontrollere posisjonen av skjærebladet. Denne metoden har redusert inkonsekvens ihørende i andre modeller for å skape en rift SCI. Denne metoden er spesielt nyttig i å studere aksonal regenerering av den lange ryggmarg trasé lokalisert i dorsal halvdel av ryggmargen, som corticospinal tarmkanalen, den rubrospinal tarmkanalen, og den dorsale stigende tarmkanalen. Med denne metoden kan disse fiber traktater være fullstendig og pålitelig transektert. I dette henseende blir feil av datafortolkningen minimeres, og dermed forbedre påliteligheten til rapportering av eksperimentelle studier på SCI.
Oppsummert har vi beskrevet en ny teknikk for å skape en reproduserbar in vivo modell av cervikal ryggmarg sårskader skade i musen. Denne teknikken er basert på ryggraden stabilisering ved fiksering av de cervikale fasetter og laceration i ryggmargen ved hjelp av en oscillerende kniv. Ved hjelp av denne metoden i en dorsal thorax ryggmargen sårskader modell i mus 6, viste vi en tett sammenheng mellom sårskader dybde, histologi, ogatferd utvinning. En slik teknikk har også blitt funnet å være pålitelig ved flere andre laboratorier 2,12.
The authors have nothing to disclose.
Utviklingen av denne enheten ble støttet av LISA Co, Louisville, Kentucky. Vi erkjenner også den pågående støtte fra Norton Healthcare, Louisville, KY til CBS, og NS050243 NIH, NS052290, og NS059622 til Xmx.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. |