Abstract
La malattia cardiovascolare resta la principale causa di morte nel mondo 1. Ingegneria tissutale cardiaca molto promettente per fornire scoperte mediche rivoluzionarie con gli obiettivi di sviluppo di tessuti funzionali per la rigenerazione cardiaca, così come test di screening in vitro. Tuttavia, la capacità di creare modelli ad alta fedeltà di tessuto cardiaco è rivelato difficile. Matrice extracellulare del cuore (ECM) è una struttura complessa costituita da entrambi i segnali biochimici e biomeccanici che vanno dalla micro-alla scala nanometrica 2. Locali condizioni di carico meccanico e le interazioni cellula-ECM sono stati recentemente riconosciuti come componenti vitali in ingegneria del tessuto cardiaco 3-5.
Una gran parte della ECM cardiaco è composto da fibre di collagene allineate con diametri scala nanometrica che influenza significativamente l'architettura dei tessuti e accoppiamento elettromeccanico 2. Purtroppo, alcuni metodi have stato in grado di mimare l'organizzazione delle fibre ECM fino alla scala nanometrica. Recenti progressi nelle tecniche di nanofabbricazione, tuttavia, hanno permesso la progettazione e la realizzazione di ponteggi scalabili che imitano i segnali vivo rigidità strutturali e substrato della ECM nel cuore 6-9.
Presentiamo qui lo sviluppo di due riproducibile, processi nanopatterning scalabili per l'allineamento funzionale delle cellule cardiache utilizzando la poli polimero biocompatibile (lattide-co-glicolico) (PLGA) 8 e un poliuretano (PU) polimero a base conveniente, e. Questi substrati anisotropicamente nanofabricated (ANF) imitare la ECM sottostante ben organizzate, tessuti allineati e può essere utilizzato per studiare il ruolo di nanotopography sulla morfologia e la funzione delle cellule 10-14.
Utilizzando un nanostrutturati (NP) maestro di silicio come un modello, un acrilato di poliuretano (PUA) muffa è fabbricato. Questo stampo PUA viene quindi utilizzato per pattern l'idrogel PU o PLGA tramite solventi mediata litografia forza capillare (CFL)-UV assistita o, rispettivamente, 15,16. In breve, PU o PLGA pre-polimero è caduta erogato su un vetrino di vetro e lo stampo PUA è posto sulla parte superiore. Per CFL-UV assistita, il PU viene poi esposto a radiazioni UV (λ = 250-400 nm) per la polimerizzazione. Per mediata solvente CFL, il PLGA viene stampato mediante calore (120 ° C) e pressione (100 kPa). Dopo la polimerizzazione, lo stampo PUA è staccata, lasciando dietro un ANF per coltura cellulare. Pile, come neonatali miociti ventricolari di ratto, così come cardiomiociti derivati dalle cellule staminali umane pluripotenti, possono essere mantenuti in ANF 2.
Introduction
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità nel mondo e presentare un pesante fardello socio-economico su un già tesa globale 1,17 sistema sanitario. Ingegneria tissutale cardiaca ha due obiettivi distinti: (1) per rigenerare il miocardio danneggiato dopo la malattia ischemica o cardiomiopatia o (2) per creare un modello ad alta fedeltà del cuore per lo screening in vitro di droga o di modellazione malattia.
Il cuore è un organo complesso che deve lavorare costantemente per la fornitura di sangue al corpo. Strutture laminari densamente di cardiomiociti e tessuti di sostegno sono disposti in schemi elicoidali tutta la parete cardiaca 18,19. Il cuore è anche accoppiato elettromeccanico 20 in un modo altamente coordinato per espellere efficacemente sangue al corpo 21. Diversi ostacoli principali restano da affrontare, tuttavia, prima intricato disegno della natura può attendibilmente essere ricapitolato in vitro.In primo luogo, anche se robusti metodi di differenziazione dei cardiomiociti continuano ad essere sviluppato 22, HPSC-CM esporre ancora fenotipi piuttosto immaturi. Le loro proprietà elettromeccaniche e la morfologia più strettamente corrispondono livelli fetali 23. In secondo luogo, se tenuto in condizioni di coltura tradizionali, sia derivato dalle cellule staminali e cardiomiociti primari non riescono ad assemblare in strutture native, tessuto-like. Piuttosto, le cellule diventano orientati in modo casuale e non presentano l'aspetto a forma di bastoncino fasciato di miocardio adulto 24.
La matrice (ECM) ambiente extracellulare con cui le cellule interagiscono gioca un ruolo importante in numerosi processi cellulari 11,13,25. L'ECM consiste di complessi segnali molecolari e topografici, ben definiti che influenzano significativamente la struttura e la funzione delle cellule 6,26. All'interno del cuore, l'allineamento cellulare segue da vicino le fibre ECM sottostante scala nanometrica 2. L'impatto di questi nanotopographspunti iCal sul cellulare e la funzione del tessuto, tuttavia, è ben lungi dall'essere completamente capito. Studi preliminari di interazione cellula-biomateriale scala nanometrica indicano la potenziale importanza e l'impatto di sub-micron spunti topografici per la segnalazione cellulare 27, 28-30 adesione, la crescita del 31, e la differenziazione 32,33. Tuttavia, a causa della difficoltà di sviluppare substrati nanofabricated riproducibili e scalabile, tali studi potrebbero non riprodurre gli effetti cellulari multi-scala del complesso in ambiente ECM vivo. In questo protocollo, una tecnica di nanofabbricazione semplice e conveniente per produrre scaffold di coltura cellulare che mimano allineamento delle fibre ECM cardiaca nativa è descritto, consentendo una vasta gamma di nuove ricerche di interazioni cardiomiociti-biomateriale. Capire come cardiomiociti interagiscono con l'ambiente ECM nanoscala potrebbe consentire per la capacità di controllare il comportamento cellulare per imitare più da vicino funzioni tessuto nativozione. Inoltre, monostrati cellulari sono un sistema sperimentale semplificato rispetto a strutture 3D, ma ancora presentano un comportamento multicellulare complesso per le indagini penetranti e screening funzionale 2,34-36. Infine, tali impalcature potrebbero essere utilizzati per migliorare la funzione del trapianto cellulare quando impiantato nel cuore per fini rigenerativi 37.
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Protocol
Tutte le procedure sono condotte a temperatura ambiente (~ 23 ° C), salvo diversamente indicato.
1. Fabbricazione di Silicon Maestro
- Pulire wafer di silicio con 100% di etanolo o xilene e secco sotto O 2 / N 2 gas.
- Posizionare wafer di silicio in spin-coater a velocità di rotazione di 2.000-4.000 rpm per produrre un film di spessore 0,3-0,5 micron.
- Reticolo la pellicola di fotoresist con le dimensioni corrette utilizzando un sistema di fotolitografia
- Immergere completamente le fette di silicio photoresist rivestite con fantasia in un volume appropriato di soluzione photoresist in via di sviluppo.
- Sciacquare i wafer di silicio photoresist rivestite sviluppati con acqua deionizzata.
- Per formare array di sub-micron creste scala con pareti laterali verticali vicino, profondo reattiva etch ioni di silicio esposto utilizzando un sistema di incisione.
- Rimuovere il fotoresist rimanente posizionando il wafer di silicio in un sistema asher plasma.
- Tagliare il silicio wAfers con una fresa diamantata nei padroni di silicio opportunamente dimensionati per il successivo stampaggio replica.
2. Fabbricazione di PUA Stampo da Silicon Maestro
NOTA: Volume da aggiungere al padrone silicio per nanofabbricazione varierà a seconda della zona del master nanostrutturati da replicare e la viscosità della soluzione di poliuretano acrilato (PUA).
- Pulire la superficie di silicio maestro con il 100% di etanolo o xilene e asciutto in O 2 / N 2 gas.
- Posizionare lato silicio maestro modello in una capsula di Petri.
- Per un maestro di silicio con 2 cm x 2 cm modello di superficie, pipetta 40 ml di PUA al modello di superficie.
- Mettere un foglio di 4 cm x 4 cm trasparente in poliestere (PET) il PUA erogato.
- Premere sul foglio PET e diffondere la PUA sotto il lenzuolo sulla faccia pattern usando un rullo o una superficie piana taglio (ad esempio una carta) in modo che l'interamodello è coperto dal prepolimero PUA.
- Mettere maestro di silicio, prepolimero, e PET circa 10 cm sotto una luce 20 Watt (115 V) UV (λ = 365 nm) per 50 sec. Per essere efficace, la lunghezza d'onda della luce UV può essere ovunque tra 310-400 nm. L'intensità della luce è 10-15 mW / cm 2 alla superficie del substrato.
- Dopo l'indurimento, rimuovere i fogli di PET lentamente con una pinza. PUA deve allegare al film PET con un negativo del silicio maestro nanopattern.
- Cure nanopatterns PUA / PET in UV per almeno 12 ore prima dell'uso. La sovraesposizione non è un problema.
- Per pulire maestri silicio, posizionare un altro film di PET in cima al padrone senza l'aggiunta di PUA e esporre a luce UV (λ = 365 nm) per 50 sec e rimuovere i fogli di PET. Questo eliminerà eventuali monomeri che non hanno reagito.
- Sciacquare maestro di silicio con il 100% di etanolo o xilene e secco sotto O 2 / N 2 gas.
3a. Polymer nanopatterning poliuretano
3b. Nanopatterning Poli (Lactide-Co-Glycolide) Hydrogel
- Creare uno stampo PDMS piatto vigorosamente mescolando silicone base di elastomero di silicone elastomero agente indurente in un rapporto di 10:1.
- Pour PDMS misti precursore soluzione in una capsula di Petri in modo che il precursore PDMS raggiunge i 5 mm fino al bordo del piatto (cioè tale PDMS uno spessore di 5 mm).
- Porre piastra di Petri e PDMS precursore in un essiccatore per 1 ora a Degas.
- Spostare piastra di Petri e PDMS precursore in un forno a 65 ° C per almeno 2 ore per curare.
- Dopo PDMS è guarito, utilizzare un rasoio per tagliare i PDMS piatto in 3 cm x 3 cm sezioni quadrate. Questi saranno i PDMS piatto stampi utilizzati in seguito nel processo di patterning.
- Clean 25 mm di diametro vetrini circolare di placing in alcol isopropilico per 30 minuti in un sonicatore acqua.
- Dry vetrini puliti in O 2 / N 2 gas.
- Goccia dispensare 100 ul di soluzione di PLGA (15% w / v PLGA in cloroformio) sul vetrino.
- Posizionare uno stampo PDMS piatta sulla parte superiore del PLGA erogato per assorbire il solvente e ottenere una superficie piana PLGA. Applicare una leggera pressione (~ 10 kPa) posizionando un peso di 200 g in cima alle PDMS per 5 min.
- Sbucciare lentamente stampo PDMS piana e posizionare il vetro di copertura su un piatto preriscaldato (120 ° C) per 5 minuti per rimuovere il solvente residuo e aumentare l'adesione tra il PLGA e il vetro di copertura.
- Collocare lo stampo NP PUA sopra il piatto PLGA e applicare una pressione costante (~ 100 kPa) e calore (120 ° C) posizionando un peso 1 kg sulla parte superiore dello stampo PUA mentre sulla piastra di riscaldamento per 15 min.
- Rimuovere il peso dal PLGA coperchio scorrevole e lasciare il substrato raffreddare a temperatura ambiente. Non rimuovere PUA stampo fino a quando i substrati sono statiraffreddato.
- Una volta che i substrati sono sufficientemente raffreddato, togliere via lo stampo NP PUA, rivelando il substrato NP PLGA. Il substrato NP PLGA dovrebbe avere un aspetto iridescente.
- Posizionare campioni finiti in essiccatore per la conservazione a lungo di un mese.
4. Semina cellulare e cultura
NOTA: Questo protocollo descrive la cultura della neonatali miociti ventricolari di ratto (NRVMs) e cardiomiociti H7 umane staminali embrionali derivate da cellule (hESC-CMS), ma altre fonti di cellule possono essere utilizzati.
- Applicare i coprioggetti ANF (PU o PLGA) di un tessuto di cultura piatto di polistirolo da 35 mm. Pipettare 20 ml di Norland Optical Adhesive (NOA83H) sul fondo del piatto e posizionare con cura il vetrino ANF sulla parte superiore del NOA. Lasciare che la colla per stendere e coprire tutto il fondo vetrino. Cure NOA esponendo piatto ai raggi UV per 10 min.
- Sterilizzare ANF risciacquando con 2 ml di soluzione acquosa di etanolo al 70% per 5 minuti, due volte. Rimuovere ethanol per aspirazione. Lasciare ANF completamente asciugare all'aria per circa 1 ora sotto la lampada di sterilizzazione UV (λ = 200-290 nm) nella cappa di sicurezza biologica.
- Adesione cellulare è arricchito da rivestimento della ANF in fibronectina durante la notte. Diluire fibronectina in acqua deionizzata a 5 mg / ml. Pipettare 2 ml di soluzione di fibronectina nel piatto. Porre in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 durante la notte (almeno 6 ore).
- Ottenere NRVMs, hESC-CMS o altre cellule cardiache di interesse in base alle precedenti protocolli 22.
- Campione di cellule centrifugare a 1000 rpm per 3 minuti per agglomerare le cellule.
- Rimuovere con attenzione il surnatante tramite aspirazione. Assicurarsi di non disturbare il pellet.
- Risospendere le cellule in opportuno terreno di coltura ad una concentrazione di 4,6 x 10 6 cellule / ml.
- Pipetta con cautela 200 ml di sospensione cellulare su ANF sterilizzati. Assicurarsi sospensione cellulare rimane sul vetrino.
- Posizionare cellule in incubatore a 37 ° C e 5%CO 2 per 4 ore per permettere alle cellule di allegare al ANF.
- Aggiungere 2 ml di terreni di coltura caldo al piatto e sostituire le cellule in incubatrice alle stesse condizioni.
- Dopo 24 ore, rimuovere il supporto e lavare con 2 ml di DPBS due volte per rimuovere le cellule in eccesso.
- Aggiungere 2 ml di terreni di coltura caldo al piatto e sostituire le cellule in incubatrice alle stesse condizioni. Cultura le cellule a confluenza. Sostituire i media ogni altro giorno.
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Representative Results
La figura 1 è uno schema del processo di produzione per i due metodi di fabbricazione. A causa della diffrazione della luce causata dalla topografia nanoscala, nanopatterning dovrebbe risultare in una superficie iridescente alla ANF. Figura 2 mostra questa superficie iridescente su un ben modellata-25 millimetri coprioggetto NP-PU (Figura 2A) con cresta 800 nm e scanalatura larghezza (Figura 2B). L'aspetto iridescente della ANF varierà leggermente a seconda delle larghezze di cresta e scanalatura.
Dopo la semina le cellule sul ANF, le celle devono iniziare ad allinearsi nella direzione parallela alle creste del substrato. Allineamento dovrebbe diventare evidente nelle prime 24 ore dopo la semina e deve rimanere per l'intero periodo di coltura. Figura 3 mostra le immagini in campo chiaro rappresentative di NRVMs dopo 7 giorni di cultura e hESC-CM, dopo 48 ore di coltura. NRVMs unnd hESC-CM sulle superfici NP mostra evidente anisotropia strutturale e l'allineamento (figure 3B e 3D), mentre cardiomiociti su superfici nanostrutturata sono orientati in modo casuale (Figure 3A e 3C). L'analisi immunoistochimica evidenzia l'impatto della nanotopography di allineamento del citoscheletro delle cellule. Microfilamenti di actina (F-actina) e α-sarcomerica actinina in cellule coltivate sulle ANF diventano allineati lungo le nano-dorsali ma rimangono distribuite casualmente in celle su substrati non nanostrutturata (Figura 4). Cellule cardiache presentano pestaggio spontaneo dopo 24-48 ore di cultura.
Figura 1. Nanofabbricazione schematico - diagramma del proc due nanofabbricazioneesses. (B - D) raffigurano UV-assistita forza capillare litografia (CFL), mentre (E - H) raffigurano solvente-mediata CFL. (A) PUA negativo è costituito da un master silicio. (B) PU pre-polimero viene posta su un vetrino e lo stampo PUA-dosata goccia in cima. (C) Un PUA stampo e PU vetrino vengono poi esposti a luce UV per curare il PU. Soluzione di polimero (E) PLGA è su un vetrino-dosata goccia e uno stampo PDMS piatto viene utilizzato per creare una superficie piana PLGA. (F) Uno stampo PUA è posto sulla parte superiore del piatto PLGA e (G) costante calore e pressione vengono applicati a caldo in rilievo il NP nel PLGA. (D, H) Dopo peeling via lo stampo PUA, un substrato NP-PU o PLGA è lasciato alle spalle. Cellule cardiache possono essere seminate su questa superficie NP per creare array allineata di cellule.
Figura 2. Substrato NP-PU. (A) Fotografia di grande superficie NP. L'aspetto iridescente del vetrino è causato dal nanotopography. (B) Immagine SEM della sezione trasversale del nanotopography sottostante.
Figura 3. Cardiomiociti Allineati. 10X immagini in campo chiaro di NRVMs dopo 7 giorni di coltura (A, B) e hESC-CM dopo 2 giorni di coltura (C, D). NRVMs coltivate su substrati NP-PU (B) esporre evidente allineamento strutturale, mentre NRVMs su superfici piane PU (A) sono allineati in modo casuale. Frecce in (B) e (D) indica la direzione di NP anisotropia. Barra della scala = 100 micron.
.. Figura 4 immunofluorescenza confocale allineamento del citoscheletro cellulare e striature; actinina α-sarcomerica (rosso), nuclei cellulari (blu), e F-actina (verde). Cellule coltivate su substrati NP sono allineati α-sarcomerica actinina e fibre F-actina, mentre le cellule coltivate su substrati piatti sono orientati in modo casuale fibre. Inserto rosso sul canale actinin α-sarcomerica mostrare chiaramente sarcomeri striati.
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Discussion
Tessuti cardiaci funzionalmente maturi sono carenti sia in vivo che in vitro applicazioni di ingegneria tissutale cardiaco. I metodi di nanofabbricazione CFL qui descritte sono tecniche robuste per realizzare l'allineamento cellulare e influenzare la funzione del tessuto macroscopico dovuto alla scalabilità del sistema. Grandi aree possono essere facilmente modellati e utilizzati per la coltura cellulare. Macroscopico allineamento cellulare è essenziale in ingegneria tessuto cardiaco per creare biomimetico, tessuto funzionale in quanto influenza le proprietà meccaniche ed elettriche del miocardio 38.
I metodi qui può essere applicato ad un'ampia gamma di applicazioni in ingegneria del tessuto cardiaco. È stato precedentemente dimostrato che spunti nanoscala contribuiscono a creare una nicchia di cellule staminali cardiache e promuovere la rigenerazione 14. Così utilizzando polimeri biodegradabili come PLGA, "patch" nanostrutturati potrebbe essere fatto per promuovereguarigione dopo insulto cardiaco. In alternativa, utilizzando idrogel con moduli elastici simili a quelli di cuore nativo, interazioni cardiomyocyte-ECM possono essere studiati in un sistema semplificato, riproducibile.
Vari altri metodi, come la stampa microcontact, elettrospinning, e microtopografia, hanno già state impiegate per controllare la struttura del tessuto cardiaco ingegnerizzato su microscala 39-41. Mentre queste tecniche si sono dimostrate efficaci nell'ottenere allineamento cellulare, è probabile che la struttura e la funzione del tessuto cardiaco in vivo è regolata dalle molto più piccole, stecche nanotopographical della ECM e quindi la nostra substrato NP dovrebbero rivelarsi vantaggiosa. Inoltre, queste tecniche di patterning microscala hanno svantaggi insiti rispetto ai nostri substrati anisotropicamente nanofabricated. Per esempio, il nostro metodo nanopatterning è più costo-efficace e controllabile rispetto elettrospinning. Stampa microcontact, d'altra parte, relies sulle cellule aderenti al corsie specifiche per ottenere anisotropia strutturale. Al fine di creare un monostrato funzionale, le cellule devono poi o proliferare o migrare su queste corsie per formare giunzioni strette. Questo è molto più difficile per le cellule con poca o nessuna capacità proliferativa come cardiomiociti neonatali. Microtopografia è limitata anche dalla incapacità di creare monostrati di cellule strettamente accoppiati. Date le dimensioni delle celle rispetto alla microtopografia, cellule risiedono sopra o all'interno delle microridges. Questo limita la quantità di interazione cellula-cellula e diminuisce accoppiamento cellula-cellula. Con il nostro metodo, le cellule diventano allineato con il bioinspired topografia nanoscala e possono interagire liberamente con le cellule vicine come le dimensioni caratteristiche sono almeno un ordine di grandezza inferiori alle cellule stesse. Questo consente una maggiore biomimetico, strettamente accoppiati cellule monostrati da creare.
Per ottenere risultati ottimali con la NP-PU consigliamo vivamente a seguito della gcoprioggetto lass fasi di pre-trattamento. Questi passaggi aumentare l'adesione del polimero alla superficie del vetro. Questo non solo un aiuto nella rimozione pulita del maestro PUA durante la fabbricazione, ma anche prevenire il polimero modellato da staccare dal vetro durante gli esperimenti. Per verificare l'efficacia delle fasi di pre-trattamento, collocare un substrato NP-UI in acqua e osservare se il polimero rimane aderente al vetro.
PLGA è un copolimero di acido glicolico e acido lattico che è stato sviluppato per entrambi dispositivo e la somministrazione di farmaci in vivo. Così, questo substrato fornisce una buona, ECM biocompatibile per le cellule. La rigidità di PLGA può essere modulata da una messa a punto del rapporto di acido glicolico acido lattico o alterando la contrazione di PLGA in cloroformio.
Vari parametri possono essere facilmente variati e regolati in questo sistema per l'ottimizzazione o fini investigativi. Vari polimeri a base di poliuretano sono disponibili con una vasta gamma diproprietà meccaniche. Così utilizzando diversi PU pre-polimeri, varie rigidità del substrato può essere fabbricato da lo stesso protocollo. L'utente può anche alterare la topografia substrato. Il nanotopography del substrato dipende dalla progettazione del master silicio. Pertanto, una varietà di larghezze cresta e femmina, così come varie geometrie, può essere modellato alterando il disegno matrice silicio per rispondere alle specifiche.
La dimensione dei nano-creste influenzerà anche la cella e il comportamento del tessuto. Larghezze di scanalatura piccoli consentono meno penetrazione cellulare nelle scanalature e limitano l'interazione della cellula con l'ingegneria nanotopography 2. Questo a sua volta alterato l'entità di comportamento anisotropo del monostrato cellulare cardiaca. Inoltre, il protocollo presentato è limitato a due dimensioni (2D) coltura cellulare e allineamento. Ovviamente, per essere veramente biomimetico, ingegneria tissutale cardiaco avrebbe bisogno di essere in 3D. Il lavoro futuro è necessario per designing denso e allineato functional3D tessuto cardiaco. Il protocollo presentato qui, tuttavia, offre un controllo superiore della morfologia delle cellule cardiache e consente il controllo della funzione del tessuto cardiaco macroscopico sulla base di indicazioni su scala nanometrica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25 mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500 g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
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