Summary
Descriviamo una singola cellula saggio ad alta prestazione per misurare la citotossicità delle cellule T quando incubati con cellule tumorali bersaglio. Questo metodo impiega una densa matrice elastomerica di sub-nanolitri pozzetti (~ 100.000 pozzetti / matrice) per confinare spazialmente le cellule T e le cellule bersaglio con rapporti definiti ed è accoppiato al microscopio a fluorescenza per monitorare effettore-bersaglio coniugazione e apoptosi successiva.
Abstract
Immunoterapia cancro può sfruttare la specificità della risposta immunitaria per individuare e eliminare i tumori. Terapia cellulare adottiva (ACT) basato sul trasferimento adottivo di cellule T geneticamente modificate per esprimere un recettore chimerico antigene (CAR) ha mostrato promettente in studi clinici 1-4. Ci sono molti vantaggi di utilizzare CAR + cellule T per il trattamento di tumori tra cui la possibilità di individuare antigeni ristrette non MHC e di funzionalizzare le cellule T per la sopravvivenza ottimale, homing e la persistenza all'interno dell'ospite e, infine, per indurre l'apoptosi delle CAR + cellule T in caso di tossicità ospitante 5.
Delineare le funzioni ottimali di CAR + cellule T associate a beneficio clinico è essenziale per la progettazione della prossima generazione di studi clinici. I recenti progressi nella diagnostica per immagini di animali vivi, come la microscopia multifotone hanno rivoluzionato lo studio della funzione delle cellule immunitarie in vivo 6,7. Mentre questi studi hanno avanzato la nostra comprensione di funzioni delle cellule T in vivo, cellule T ACT basata in studi clinici richiede la necessità di collegare le caratteristiche molecolari e funzionali di cellule T preparazioni pre-infusione con efficacia clinica post-infusione, utilizzando in vitro monitoraggio funzioni delle cellule T come, citotossicità e la secrezione di citochine. Standard di flusso-citometria saggi basati sono stati sviluppati che determinano il funzionamento complessivo di popolazioni di cellule T a livello di singola cellula, ma questi non sono adatti per il monitoraggio e la formazione coniugato vite o la capacità della cellula stessa per uccidere più bersagli 8.
Array microfabbricati progettati in polimeri biocompatibili come polidimetilsilossano (PDMS) è un metodo particolarmente interessante per limitare spazialmente effettori e gli obiettivi in piccoli volumi 9. In combinazione con automatico time-lapse microscopia a fluorescenza, thousands di effettore bersaglio interazioni può essere monitorato contemporaneamente da singoli pozzetti di imaging di una matrice di nanowell. Vi presentiamo qui un high-throughput metodologia per il monitoraggio delle cellule T citotossicità mediata a livello di singola cellula che può essere ampiamente applicata allo studio della funzionalità delle cellule T citolitica.
Protocol
1. Reagenti Preparazione
- Preparare RPMI-PLGH miscelando 500 ml ml RPMI-1640 e 5 ciascuno di penicillina-streptomicina, L-glutamina, e la soluzione di HEPES.
- Preparare R10 soluzione miscelando RPMI-PLGH con 10% siero fetale bovino (FBS). L'FBS è inattivati termicamente a 56 ° C per 30 minuti prima dell'aggiunta.
- Pre-riscaldare a 37 ° C 50 ml di RPMI-PLGH, 15 ml ml di PBS, e 15 di R10 in sterili provette coniche.
- Fabbricazione di matrici di nanowells in PDMS: Il master di silicio è prodotto utilizzando fotolitografia essenzialmente come descritto in precedenza 10. Mescolare accuratamente il Sylgard 184 kit di base elastomero e catalizzatore nel rapporto 10:1 peso in una tazza usa e getta con un coltello di plastica. Degassare la miscela in una camera a vuoto per 1 ora. Versare il composto sulla matrice nanowell, sigillare con una lastra di vetro e lasciate riposare per 30 minuti. Trasferire l'assemblaggio in un forno impostato a 80 ° C per 2 ore e lasciata raffreddare a temperatura ambiente per 1 ora. L'elastomero sarà corre durante questo periodo e si legherà al vetrino. La slitta di vetro contenente la matrice PDMS nanowell è alzato attentamente fuori il padrone di silicio, ricoperto di nastro adesivo e conservati fino al momento dell'uso futuro.
2. Obiettivo cellulare (T) Etichettatura
- Contare 5 milioni di cellule bersaglio di coltura cellulare utilizzando un emocitometro e il pellet in una provetta sterile 15 ml conica per centrifugazione a 340 xg per 5 min. La coltura cellulare è suddiviso il giorno precedente in 5 ml di volume totale (densità = 1 milione / ml) e coltivate in T-25 beuta (VWR). Protocolli per il conteggio delle cellule usando emocitometro sono stati descritti in dettaglio in precedenza 11
- Aspirare supporti in eccesso lasciando dietro di sé circa 50 microlitri di media.
- Preparare una soluzione di lavoro di Cell Tracker Red (CTR) miscelando 0,5 microlitri magazzino CTR (1 mM) per 150 ml RPMI-PLGH (concentrazione finale 2,5 micron). Aggiungere 150 pl della soluzione di lavoro per le cellule bersaglio e miscelare accuratamente con una pipetta P200.Alternativamente, PKH 26 (concentrazione finale di 2 mM) può essere utilizzato cellule bersaglio etichette secondo le istruzioni del produttore.
- Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per 20 min.
3. Effector (E) Cell Etichettatura
- Contare 5 milioni di cellule effettrici di coltura cellulare utilizzando un emocitometro e il pellet in una provetta sterile 15 ml conica per centrifugazione a 340 xg per 5 min.
- Aspirare supporti in eccesso
- Preparare una soluzione di lavoro di Vybrant soluzione DyeCycleViolet Stain con l'aggiunta di 1 ml di 5 mM magazzino Violet Vybrant a 1 ml di R10 media (concentrazione finale di 5 pm). Aggiungere la soluzione di lavoro per le cellule e risospendere usando pipetta P200. Alternativamente, PKH 67 (concentrazione finale di 2 mM) può essere utilizzato cellule bersaglio etichette secondo le istruzioni del produttore. Se PKH 67 viene utilizzata, quindi SYTOX verde non deve essere utilizzato poiché sono nello stesso canale di fluorescenza. L'enumerazione degli obiettivi apoptotici si effettua esclusivamente con Acolorazione nnexinV in questo caso.
Nota: Se si esegue time-lapse e non misure di endpoint, coloranti UV come Violet Vybrant dovrebbe essere evitato. - Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per 20 min.
4. Separazione di cellule vive e morte mediante gradiente di densità
- Aggiungere 6,8 ml e 6,0 ml di RPMI-PLGH al bersaglio e cellule effettrici, rispettivamente e mescolare pipettando su e giù delicatamente.
- Strato 3,5 ml di Ficoll-Paque Plus per fondo di ogni provetta conica contenente bersaglio e cellule effettrici. Strato il FICOLL lentamente per garantire una uniforme di strati tra FICOLL e media.
- Centrifugare entrambi i tubi a 340 xg per 30 min. senza freno e accelerazione.
- Durante la centrifugazione, trasferire 7 ml di pre-riscaldato PBS ad una 4-pozzetti. Preparare matrice nanowell (fabbricato in PDMS): pulire il fondo vetrino con etanolo e ossidare il PDMS ad alta impostazione RF utilizzando ossidante plasma per 1 min. Questo passaggio sterilize dell'array nanowell mentre anche rendere idrofila la PDMS. Spostare immediatamente la matrice nanowell nella piastra contenente PBS.
- Trasferire la piastra per un armadio biosicurezza e aspirare PBS in eccesso. Prova del 10 ml di agar 1% nobile con l'aggiunta di polvere da 100 mg di agar a 10 ml di acqua deionizzata e poi forno a microonde che per 30-45 sec. Applicare riscaldare 1% agar nobile sul bordo superiore e inferiore del vetrino che contiene l'array nanowell per immobilizzare la matrice e attendere 10 min per agar per solidificare. Aggiungere 3 ml di PBS ed aspirare agar in eccesso.
- Aggiungere 3 ml di R10 sulla parte superiore della matrice nanowell e lasciare equilibrare per ~ 10 min.
- A seguito di Ficoll centrifugazione, aspirare 5 Mezzi ml dallo strato superiore di ciascun tubo. Fare attenzione a non aspirare il livello contenente le cellule.
- Raccogliere le cellule (strato bianco) recuperando 1-2 ml dallo strato tra FICOLL e media con P1, 000 pipetta e passare a nuove provette sterili coniche. Ripetere questa operazione per entrambi i gruppi di cellule, badando a che si massimaize le cellule di recupero.
- Aggiungere 3 ml di pre-riscaldato RPMI-PLGH a ciascuna provetta, pipettando e pellet per centrifugazione a 340 xg per 5 min a piena accelerazione e freno.
- Aspirare supporti in eccesso, aggiungere 5 ml di pre-riscaldato RPMI-PLGH a ciascuna provetta e ripetere la centrifugazione a 340 xg per 5 min.
- Aspirare supporti in eccesso e risospendere il pellet cellulare in 500 ml di R10.
- Contare le celle in diretta tramite il metodo di esclusione Trypan blu su un emocitometro.
5. Cella di carico su Array Nanowell
- Aspirare i supporti in eccesso dalla matrice nanowell e aggiungere 2 ml di R10 fresco attraverso la matrice. Aspirare nuovamente facendo attenzione che la parte superiore della matrice nanowell non è troppo umido / secco in quanto influirà distribuzione delle cellule.
- Deposito 1 x 10 5 cellule effettrici in 200 pl di R10 sulla superficie dell'array nanowell (densità = 5 x 10 5 cellule / ml).
- Lasciate che le cellule accontentarsi di 5 minuti e l'utilizzo di uno standard di coltura controllo dei tessuti al microscopio per enAssicurarsi che la distribuzione delle cellule è auspicabile. Aggiungi più celle, se necessario.
- Deposito 1 x 10 5 cellule bersaglio in 200 microlitri R10 sulla superficie dell'array nanowell (densità = 5 x 10 5 cellule / ml).
- Lasciate cellule accontentarsi di 5 min e utilizzando uno standard coltura tissutale microscopio controllo per assicurare che la distribuzione delle cellule è auspicabile. Aggiungi più celle, se necessario.
- Sciacquare accuratamente con matrice nanowell 2 ml R10 e aspirare i supporti in eccesso.
- Preparare 3 ml di pre-riscaldato R10 in una provetta da 15 ml conica sterile. Aggiungere 3 ml di acido 0,5 mM SYTOX verde Nucleic Stain (concentrazione finale 0,5 micron) e 60 pl di annessina V-Alexa Fluor 647 a preparare la soluzione di lavoro. Aggiungere la soluzione di lavoro sul 4-pozzetti attentamente assicurandosi che le cellule non vengono spostati dai pozzetti.
- Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per 15 min.
6. Imaging 1
- Acquisire le immagini della matrice nanowell utilizzando un micr fluorescenzaoscope: In questo esempio, usiamo un Observer ZEISS Z-1 microscopio dotato di un palco motorizzata e Lambda-DG4.
- Inizializzare il software e il microscopio e controllare l'intensità del segnale in luce trasmessa e gli altri canali fluorescenti. Nel complesso, vi saranno cinque canali corrispondenti a: luce trasmessa, Annessina V-647 (Cy5 filtro), CTR (DsRed filtro), SYTOX verde (FITC filtro), e Vybrant Violet (DAPI filtro). Assicurarsi che il microscopio è configurato per garantire massimo segnale al rumore, evitando la saturazione.
- Impostare la posizione X e Y per la matrice nanowell. Inizia processo fissando la posizione di zero e l'inizializzazione di messa a fuoco sul centro di 7 x 7 blocco di matrice nanowell in alto a sinistra del timbro matrice nanowell. Impostare le posizioni x, y in coincidenza con il centro di ogni blocco e il valore z per riflettere con precisione la messa a fuoco su ogni blocco.
- Una volta che la posizione di messa a fuoco e sono tutti insieme, assicurarsi di impostare l'acquisizione di immagini in modalità lineare e acquisire immagini.
7. Post-imaging
Trasferire il 4-pozzetti contenente la matrice nanowell in un incubatore (37 ° C / 5% CO 2) per 6 ore.
8. Imaging 2
Acquisire le immagini al secondo time-point, come indicato al punto 6.
9. Image Analysis
- L'uso di cellule all'interno del nanowells viene determinato mediante l'uso di opportuni programmi di segmentazione di immagini (ad es ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) essenzialmente come descritto in precedenza 9,12.
- Analisi della prima serie di immagini al microscopio (t = 0 hr; t 0) è usata per generare un database dei nanowells individuali contenenti esattamente una cellula bersaglio vivo (identificatoda Red CellTracker, rosso) e non le cellule morte (identificati mediante colorazione annessina V, verde) [0 T1T nanowells].
- Analisi della seconda serie di immagini al microscopio (t = 6 hr; t 6) è utilizzato per determinare indipendentemente un secondo database di nanowells contenenti 1 cella di destinazione (rosso) [T1T nanowells 6]. Un controllo di integrità (query di database) è implementato per assicurare che tutti i bersagli in scena a t 0 sono abbinati ad obiettivi a t 6 per la produzione di una serie finale di obiettivi corrispondenti (implementato come nanowells che hanno T1T 0 = T1T 6, designato come T1match)
- Il numero di cellule effettrici in nanowells è determinato usando colorazione Vybrant Violet a t 0 [nanowells E1]
- Una query di database viene implementato per identificare nanowells contenenti effettori singoli co-incubate con singoli target (definito come nanowells che hanno partita E1 e T1, designati come E1T1)
- Effector apoptosi indotta è segnato da i dentifying obiettivi che sono annessina V con negativo a t 0 e annessina V positivo t 4 (E1T1 colorazione con annessina V a destinazione t 6).
10. Opzionale time-lapse imaging of Killing Utilizzando Nikon BioStation IM
- Prendere una capsula di Petri con fondo coprioggetto e tagliare un piccolo pezzo del chip matrice nanowell (preparato al punto 5) che si adattano perfettamente al coprioggetto. Assicurarsi che il chip rimane bagnata durante il taglio.
- Mix 1 x 10 6 obiettivi e 1 x 10 6 cellule T in 100 ul dei media, e la pipetta sul vetrino coprioggetti.
- Lasciare circa 15-30 minuti per consentire alle cellule stabilirsi.
- Rapidamente invertire il piccolo chip di matrice nanowell e posizionarlo sul coprioggetto.
- Al fine di garantire che il chip non sarà in grado di passare nel luogo di imaging, uno o due 20mm x 20 millimetri coprioggetti sulla sommità del chip. Applicare pressione per spingere dolcemente il chip al fondo del piatto.
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Representative Results
Un esempio di applicazione del saggio ad alta prestazione citolitica è mostrato nella Figura 2. In breve, l'etichetta-CD19 specifici CAR + cellule T sono state co-incubate con marcate topo EL4 cellule bersaglio nei singoli pozzetti di una matrice nanowell (sezioni 1-5). L'immagine iniziale è stata registrata sul microscopio a fluorescenza automatizzata per identificare l'occupazione (effettori e / o gli obiettivi) di ogni singolo nanowell sull'array (sezione 6). L'elaborazione delle immagini è stato utilizzato per identificare tutti i nanowells che contengono esattamente un singolo bersaglio e un effettore singolo e per escludere nanowells contenenti obiettivi morti (Sezione 9). Il chip è stato trasferito ad un incubatore per 6h e poi una seconda immagine del chip è stato registrato (sezioni 7-8). La capacità di effettore di indurre apoptosi in cellule bersaglio è stata misurata mediante colorazione con annessina V, in nanowells contenenti esattamente un bersaglio e un effettore. Due esperimenti sono stati eseguiti in parallelo con gli stessi effettori e due serie of cellule bersaglio (EL4-CD19 + e CD19-EL4-(controllo negativo)) per determinare la frequenza di lisi antigene-specifico (Figura 2). È desiderabile ottenere basse frequenze di non specifico lisi (~ 2-4%). La metodologia dipende dalla disponibilità delle cellule bersaglio appropriate ed esperimenti paralleli vengono eseguiti per determinare l'apoptosi in obiettivi indipendenti di effettori. Alte frequenze di apoptosi bersaglio in assenza di effettori nel periodo 6h (> 8%) indica la necessità di ottimizzare coltura e condizioni di saggio. L'array nanowell può essere adattato per time-lapse imaging quando è necessario un monitoraggio continuo (Film 1) e questo permette l'osservazione di effettore-bersaglio coniugazione e successiva morte cellulare.
Figura 1. A. Schema di dosaggio matrice nanowell basato citolitica. Labelled CAR +Cellule T (blu) e cellule bersaglio (rosso) vengono incubate in una matrice di nanowells. Microscopia viene utilizzato per monitorare effettrici citolisi mediata di destinazione. B. micrografie rappresentative composite di CD19-specifica CAR + cellule T che inducono apoptosi nelle EL4-CD19 + cellule bersaglio e quelli che non lo fanno.
Figura 2. Antigene-specifica attività citolitica di CD19-specifica CAR + cellule T. Trame cellula bersaglio istogramma di pozzetti contenenti un effettore unico e un singolo bersaglio dopo 6 ore di co-incubazione. Istogrammi corrispondenti di cellule bersaglio senza effettori sono mostrati a riferire la frequenza di morte cellulare sfondo.
Movie 1. Time-lapse microscopia di CAR + T-cellule citolisi mediata. AUTO + cellule T (senza etichetta) sono stati co-incubate con NALM-6-GFP cellule bersaglio + (verde) in un naNowell e le immagini sono state prese ogni 2 minuti per un totale di 12 ore per consentire il monitoraggio dinamico. Annessina V è stato aggiunto al mezzo di coltura e le cellule apoptotiche diventano etichettati rosso.
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Discussion
Abbiamo delineato il protocollo per un high-throughput cella singola saggio citolitica abilitato tramite co-incubazione di effettori e degli obiettivi in matrici di nanowells (Figura 1). Oltre a un throughput un grande vantaggio di questa tecnica è la capacità di monitorare effettore la citotossicità contro cellule bersaglio desiderate senza necessità di engineering cellule bersaglio che a sua volta consente l'uso di cellule tumorali autologhe o matched / primaria come cellule bersaglio. Il confinamento spaziale permette il recupero e successiva clonazione di cellule T funzionali al termine del dosaggio 9. Un limite del saggio è la necessità di microscopi specializzati con stadi automatizzati e rapida commutazione ottica. Questo non è tuttavia un grave limite dato che queste macchine sono ora disponibili come parte di strutture di ricerca di base.
Ci sono una varietà di flusso-citometria saggi based che offre un throughput più elevato, mentre preserving singola cella di risoluzione. Tra questi saggi che macchiano per il marcatore surrogato della degranulazione (CD107a) o il contenuto perforina in effettori caspasi e / attività granzimi negli obiettivi di 13,14. Questi saggi però non veramente monitorare effettore-bersaglio coniugazione o la capacità del effettore di impegnarsi e uccidere più bersagli. Rispetto al test gold standard, ad esempio un 4h 51Cr-release test, eseguito in E: T ratio di 1:1, la nostra metodologia di solito riporta lo stesso numero complessivo di effettori citolitica, pur fornendo singola cella di risoluzione. Anche se il protocollo descritto qui solo i dettagli sulla citotossicità, come descritto in precedenza questa analisi può essere facilmente combinato con il test per determinare microengraving citochine secrete dalle singole cellule effettrici upon legatura di destinazione 9. È quindi possibile generare profili compositi funzionali CAR + cellule T che combinano citotossicità e la secrezione di citochine al livello di singola cellula.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Cancer Institute del National Institutes of Health di cui al numero Award R01CA174385. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco's PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
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