Summary
Vi beskriver en encellet high-throughput analysen å måle cytotoksisitet av T-celler når inkubert med tumor målceller. Denne fremgangsmåten anvender en tett, elastomeriske rekke sub-nanoliter brønner (~ 100.000 brønner / array) til romlig begrense den T-celler og målceller ved definerte forholdstall og er koblet til fluorescens mikroskopi å overvåke effektor-target konjugering og påfølgende apoptose.
Abstract
Kreft immunterapi kan utnytte det spesielle ved immunresponsen å målrette og eliminere svulster. Adoptive celleterapi (ACT) basert på den adoptive overføring av T-celler genetisk modifisert til å uttrykke et kimert antigen reseptoren (CAR) har vist betydelige løftet i kliniske studier 1-4. Det er flere fordeler ved å bruke CAR + T celler for behandling av kreftformer inkludert muligheten til å målrette mot MHC bundne antigener og å functionalize T-cellene for optimal overlevelse, homing og utholdenhet i verten, og endelig til å indusere apoptose av CAR + T-celler i tilfelle verten toksisitet 5.
Opptegning av optimale funksjoner CAR + T celler forbundet med klinisk effekt er avgjørende for utformingen av neste generasjon av kliniske studier. Nylige fremskritt i levende dyr avbildning som multiphoton mikroskopi har revolusjonert studiet av immunceller funksjon in vivo 6,7. Mens disse studiene har utvidet vår forståelse av T-celle funksjoner i vivo, T-celle basert ACT i kliniske studier krever behovet for å knytte molekylære og funksjonelle trekk ved T-celle preparater forinnsprøytning med klinisk effekt etter infusjon, ved å utnytte i vitro overvåking T-celle funksjoner som, cytotoksisitet og cytokin sekresjon. Standard flow-cytometri baserte analyser har blitt utviklet som bestemmer den totale funksjon av populasjoner av T-celler på enkelt-celle-nivå, men disse er ikke egnet til å overvåke konjugat formasjon og levetid eller evnen av den samme cellen å drepe flere mål 8.
Microfabricated matriser designet i biokompatible polymerer som polydimetylsiloksan (PDMS) er en spesielt attraktiv metode for å romlig begrense effektorer og mål i små volumer 9. I kombinasjon med automatisk time-lapse fluorescens mikroskopi, thousands av effektor-target interaksjoner kan overvåkes samtidig av bildebehandling individuelle brønner på et nanowell array. Vi presenterer her en high-throughput metoden for overvåking T-cellemediert cytotoksisitet på enkelt-celle-nivå som kan bredt anvendt til å studere cytolytisk funksjonaliteten av T-celler.
Protocol
1. Reagenser Forberedelse
- Forbered RPMI-PLGH ved blanding 500 ml RPMI-1640 og 5 ml hver av Penicillin-streptomycin, L-glutamin, og HEPES-løsning.
- Forbered R10 løsning ved å blande RPMI-PLGH med 10% fetalt bovint serum (FBS). FBS er varme-inaktivert ved 56 ° C i 30 min før tilsetning.
- Forvarme ved 37 ° C 50 ml RPMI-PLGH, 15 ml PBS, og 15 ml R10 i sterile koniske rør.
- Fabrikasjon av matriser av nanowells i PDMS: Silisium Master er fremstilt ved hjelp av fotolitografi hovedsak som beskrevet tidligere 10. Bland grundig Sylgard 184 elastomer kit base og herder ved 10:01 vektforhold i en disponibel cup med en plast kniv. Degas blandingen i et vakuumkammer i 1 time. Hell blandingen på nanowell array, forsegle med et glass lysbilde og la den sitte i 30 min. Overfør sammenstillingen inn i en ovn innstilt på 80 ° C i 2 timer og la avkjøles ved romtemperatur i 1 time. Elastomeren vil nåe i denne perioden og vil hefte til glass-slide. Glasset lysbilde som inneholder PDMS nanowell rekke løftes forsiktig av silisium master, dekket med teip og lagres inntil fremtidig bruk.
2. Target Cell (T) Merking
- Tell 5000000 målceller fra cellekultur med et hemocytometer og pellet cellene i et sterilt 15 ml konisk rør ved sentrifugering ved 340 xg i 5 minutter. Cellekulturen splittes gårsdagen i 5 ml totalt volum (densitet = 1000000 / ml) og dyrket i T-25 kolbe (VWR). Protokoller for Celletellingen hjelp hemocytometer har blitt beskrevet i detalj tidligere 11
- Aspirer overflødig utskriftsmateriale etterlot ca 50 pl media.
- Forberede en arbeidsoppløsning av Cell Tracker Red (CTR) ved å blande 0,5 ul CTR lager (1 mM) for å 150 pl RPMI-PLGH (sluttkonsentrasjon 2,5 pM). Tilsett 150 ul av arbeidsløsningen til målceller og bland grundig ved hjelp av en P200 pipette.Alternativt kan PKH 26 (endelig konsentrasjon på 2 uM) brukes etikett målceller som per produsentens instruksjoner.
- Inkuber ved 37 ° C / 5% CO 2 i 20 min.
3. Effektor (E) Cell Merking
- Tell 5000000 effektorceller fra cellekultur med en hemacytometer og pellet cellene i et sterilt 15 ml konisk rør ved sentrifugering ved 340 xg i 5 minutter.
- Aspirer overflødig utskriftsmateriale
- Forberede en arbeidsoppløsning av Vybrant DyeCycleViolet Stain løsning ved tilsetning av 1 pl av 5 mM Vybrant Violet lager til 1 ml av R10 media (sluttkonsentrasjon av 5 uM). Legg arbeidsløsningen til cellene og resuspender med P200 pipette. Alternativt kan PKH 67 (endelig konsentrasjon på 2 uM) brukes etikett målceller som per produsentens instruksjoner. Hvis PKH 67 er brukt, så SYTOX Grønn ikke bør brukes siden de er i den samme fluorescens kanal. Opptellingen av apoptotiske mål er gjort utelukkende ved hjelp AnnexinV farging i dette tilfellet.
Merk: Hvis du utfører time-lapse og ikke endepunktet målinger, bør UV fargestoffer som Vybrant Violet unngås. - Inkuber ved 37 ° C / 5% CO 2 i 20 min.
4. Separasjon av levende og døde celler ved hjelp av tetthetsgradient
- Legg 6.8 ml og 6,0 ml RPMI-PLGH til målet og effektorceller henholdsvis og bland ved å pipettere opp og ned forsiktig.
- Lag 3,5 ml Ficoll-Paque Plus til bunnen av hver konisk tube inneholdende målet og effektorceller. Lag på Ficoll sakte for å sikre god dannelse av lagene mellom Ficoll og media.
- Sentrifuger begge rørene 340 xg i 30 min. med ingen brems og akselerasjon.
- Under sentrifugering overføres 7 ml forvarmet PBS til en 4-brønns plate. Forbered nanowell array (fabrikkert i PDMS): ren bunnen av glass lysbilde med etanol, og oksidere PDMS ved høy RF innstilling ved hjelp plasma oksideringsanordning i 1 min. Dette trinnet vil sterilize den nanowell rekke samtidig gjengivelse PDMS hydrofile. Flytt straks den nanowell rekke inn platen som inneholder PBS.
- Overfører platene til en biosikkerhet kabinett og aspirere overflødig PBS. Lag 10 ml 1% edle agar ved å tilsette 100 mg agar pulver til 10 ml DI-vann og deretter mikrobølgeovn den for 30-45 sek. Påfør varme 1% edle agar på toppen og nedre kant av glass lysbildet som inneholder nanowell rekke å bremse den array og vente 10 min for agar å stivne. Tilsett 3 ml PBS og aspirer overflødig agar.
- Tilsett 3 ml R10 på toppen av nanowell array og la det ekvilibrere i ~ 10 min.
- Etter Ficoll sentrifugering aspirer 5 ml medier fra det øverste laget av hvert rør. Vær forsiktig så du ikke suge laget som inneholder cellene.
- Høste celler (hvitt lag) ved å gjenopprette 1-2 ml fra laget mellom Ficoll og media med P1, 000 pipette og flytte til nye sterile koniske rør. Gjenta dette for begge settene av celler samtidig sørge for at du leveregelize gjenopprettings celler.
- Tilsett 3 ml forvarmet RPMI-PLGH til hvert rør, bland ved pipettering og pellet ved sentrifugering ved 340 xg i 5 min på full akselerasjon og brems.
- Aspirer overflødig utskriftsmateriale, tilsett 5 ml forvarmet RPMI-PLGH til hvert rør og gjenta sentrifugering ved 340 xg i 5 minutter.
- Aspirer overflødig utskriftsmateriale og resuspender cellepelleten i 500 ul av R10.
- Tell levende celler ved hjelp av Trypan blå utelukkelse metoden på en hemacytometer.
5. Cell Laster inn Nanowell Array
- Aspirer overflødig utskriftsmateriale fra nanowell array og tilsett 2 ml frisk R10 over tabellen. Aspirer igjen samtidig som at toppen av nanowell matrise er ikke for våt / tørr som det vil påvirke fordelingen av celler.
- Innskudd 1 x 10 5 effektorceller i 200 ul av R10 bort på nanowell matrise overflate (densitet = 5 x 10 5 celler / ml).
- La celler bosette mellom 5 min og med en standard vevkultur mikroskop sjekk til noat fordelingen av celler som er ønskelig. Legg flere celler om nødvendig.
- Forekomst 1 x 10 5 målceller i 200 pl R10 for nanowell matrise overflate (densitet = 5 x 10 5 celler / ml).
- La celler bosette mellom 5 min og med en standard vevkultur mikroskop sjekk for å sikre at fordelingen av celler som er ønskelig. Legg flere celler om nødvendig.
- Skyll nanowell rekke nøye med 2 ml R10 og aspirere overflødig utskriftsmateriale.
- Forbered 3 ml forvarmet R10 i en 15 ml sterilt konisk tube. Tilsett 3 pl 0,5 mM SYTOX Grønn Nucleic Acid Stain (sluttkonsentrasjon 0,5 pM) og 60 pl av Annexin V-Alexa Fluor 647 for å forberede arbeidsløsningen. Legg arbeidsløsningen på 4-brønns plate nøye samtidig sørge for at cellene ikke er forskjøvet fra brønnene.
- Inkuber ved 37 ° C / 5% CO 2 i 15 min.
6. Imaging en
- Skaffe bilder av den nanowell rekke ved hjelp av en fluorescens microscope: I dette eksempelet bruker vi en ZEISS Observer Z-1 mikroskop utstyrt med en motorisert scene og Lambda-DG4.
- Initialisere programvaren og mikroskopet og sjekk signalstyrken på overført lys og de andre fluorescerende kanaler. Samlet vil det være fem kanaler tilsvarende: overført lys, Annexin V-647 (Cy5 filter), CTR (DsRed filter), SYTOX Green (FITC filter), og Vybrant Violet (DAPI filter). Sørg for at mikroskop det setup å sikre maksimal signal til støy og samtidig unngå metning.
- Still X og Y-posisjonen for nanowell matrisen. Begynn prosessen ved å sette null posisjon og initialisering fokus på midten av 7 x 7 nanowell rekke blokk på venstre hjørne av nanowell rekke stempel. Still x, y posisjoner til sammenfaller med midten av hver blokk og z-verdien å nøyaktig gjenspeile fokus på hver blokk.
- Når posisjonen og fokus er alle satt, sørg for å sette bildeopptak i lineær modus og hente bilder.
7. Post-avbildning
Overfør 4-brønns plate som inneholder nanowell matrisen i en inkubator (37 ° C / 5% CO 2) i 6 timer.
8. Imaging 2
Tilegne bildene på det andre tidspunktet-punkt som beskrevet i Trinn 6.
9. Bildeanalyse
- Occupancy av celler innenfor nanowells bestemmes ved bruk av hensiktsmessige bildesegmentering programmer (f.eks ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) hovedsakelig som beskrevet tidligere 9,12.
- Analyse av det første settet med mikroskop bilder (t = 0 hr; t 0) blir brukt til å generere en database av de enkelte nanowells inneholder nøyaktig en levende målcellen (identifisertved CellTracker Red, rød) og ingen døde celler (identifisert av Annexin V farging, grønn) [T1t 0 nanowells].
- Analyse av det andre settet med mikroskop bilder (t = 6 hr; t 6) blir brukt til å bestemme en andre uavhengig database over nanowells inneholdende 1 målcellen (rød) [T1t 6 nanowells]. En integritet sjekk (database spørring) er implementert for å sikre at alle levende mål på t 0 er tilpasset mål på t 6 for å produsere en endelig sett matchet mål (implementert som nanowells som har T1t 0 = 6 T1t, utpekt som T1match)
- Antallet effektorceller i nanowells bestemmes ved hjelp Vybrant Violet flekker på t 0 [E1 nanowells]
- En database spørring er iverksatt for å identifisere nanowells inneholder enkle effektorer inkubert med enkle mål (definert som nanowells som har E1 og T1 match, utpekt som E1T1)
- Effektor indusert apoptose er scoret av i dentifying mål som er Annexin V negative ved t 0 og Annexin V positivt på t 4 (E1T1 med Annexin V mål flekker på t 6).
10. Valgfri Time-lapse Imaging of Killing Bruke Nikons BioStation IM
- Ta en petriskål med dekkglass bunn og kutte ut en liten del av nanowell rekke chip (forberedt på trinn 5) som akkurat passe på dekkglasset. Pass på at brikken holder seg fuktig under kappingen.
- Bland 1 x 10 6 mål og 1 x 10 6 T-celler i 100 ul media, og pipette det på dekkglasset.
- Tillate ca 15-30 min å la cellene bosette.
- Raskt snu den lille nanowell rekke chip og plasser den på dekkglasset.
- For å sikre at brikken ikke vil være i stand til å bevege seg i løpet av avbildning, stedet en eller to 20mm x 20mm dekkglass på toppen av brikken. Påføre trykk mykt å skyve chip til bunnen av skålen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på anvendelsen av high-throughput cytolytisk analysen er vist i figur 2. Kort, merket CD19-spesifikke CAR + T-celler ble ko-inkubert med merkede mus EL4 målceller i de individuelle brønnene til en nanowell matrise (§ § 1-5). En innledende bildet ble tatt på den automatiserte fluorescerende mikroskop for å identifisere belegg (effektorer og / eller mål) av hvert enkelt nanowell på tabellen (§ 6). Bildebehandling ble brukt til å identifisere alle nanowells inneholder nøyaktig ett mål og én effektor og for å utelukke nanowells inneholder døde mål (§ 9). Brikken ble overført til en inkubator for 6t og deretter et andre bilde av chip ble registrert (§ 7-8). Muligheten av effektor til å indusere apoptose i målceller ble målt ved farging med Annexin V, i nanowells inneholder nøyaktig en effektor og ett mål. To parallelle forsøk ble kjørt med de samme effektorer og to sett of målceller (EL4-CD19 + og EL4-CD19-(negativ kontroll)) for å bestemme frekvensen av antigen-spesifikk lysis (Figur 2). Det er ønskelig å oppnå lave frekvenser av uspesifikk lysis (~ 2-4%). Metodikken er avhengig av tilgjengeligheten av passende målceller og parallelle forsøk er kjørt for å bestemme apoptose i mål uavhengig av effektorer. Høye frekvenser av mål apoptose i fravær av effektorer over 6t perioden (> 8%) indikerer et behov for å optimalisere dyrking og analysebetingelser. Den nanowell rekke kan tilpasses for time-lapse bildebehandling når kontinuerlig overvåking er nødvendig (Movie 1), og dette gjør det mulig for observasjon av effektor-target konjugering og påfølgende celle-død.
Figur 1. A. Skjematisk av nanowell rekke basert cytolytisk analysen. Merket CAR +T-celler (blå) og målceller (rød) inkuberes i en rekke nanowells. Mikroskopi brukes for å overvåke effektor mediert målet cytolyse. B. Representative kompositt mikrografer av CD19-spesifikk CAR + T-celler som induserer apoptose i EL4-CD19 + målceller og de som ikke gjør det.
Figur 2. Antigen-spesifikk cytolytisk aktivitet av CD19-spesifikke CAR + T celler. Målcellen histogram plott av brønner inneholdende en enkelt effector og et enkelt mål etter 6 hr av co-inkubering. Matchet histogrammer av målceller uten effektorer er vist å rapportere frekvensen av bakgrunnen celledød.
Movie 1. Time-lapse mikroskopi av CAR + T-celle mediert cytolyse. Bil + T-celler (umerket) ble ko-inkubert med NALM-6-GFP + målcellene (grønn) i et naNowell og bildene ble tatt hver 2 min for totalt 12 hr å aktivere dynamisk overvåking. Annexin V ble lagt til kultur media og apoptotiske celler blir merket rødt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har skissert protokollen for en high-throughput encellede cytolytisk analysen aktivert via co-inkubering av effektorer og mål i matriser av nanowells (figur 1). I tillegg til gjennomstrømming en stor fordel av teknikken er evnen til å overvåke effektor-mediert cytotoksisitet mot ønskede målceller uten behov for målcellen Engineering som i sin tur tillater bruk av autologe eller matchet / primær tumor celler som målceller. Den romlige innesperring tillater innhenting og påfølgende kloning av funksjonelle T-celler ved slutten av analysen 9. En begrensning av analysen er behovet for spesialiserte mikroskoper med automatiserte scener og rask veksling optikk. Dette er imidlertid ikke en alvorlig begrensning gitt at disse maskinene er nå allment tilgjengelig som en del av forskning kjernefasiliteter.
Det finnes en rekke flyt-cytometri baserte analyser som tilbyr høyere gjennomstrømning mens preserving encellede oppløsning. Disse inkluderer analyser som flekken for surrogatmarkør for degranulation (CD107a) eller perforin innhold i effektorer og caspase / granzymes aktivitet i mål 13,14. Disse assays imidlertid ikke virkelig overvåke effektor-target konjugering eller evne effektor å engasjere og drepe flere mål. Sammenlignet med gullstandarden analysen som en 4H 51Cr-release assay, kjøre på E: T forholdstall på 1:1, rapporterer vår metodikk vanligvis den samme totale antall cytolytisk effektorer, samtidig som encellede oppløsning. Selv protokollen beskrevet her kun detaljer om cytotoksisitet, som beskrevet tidligere i Analysen kan lett kombineres med microengraving analysen for å bestemme cytokiner utskilt av enkle effektorceller ved målet ligation 9. Det er således mulig å generere sammensatte funksjonelle profiler av CAR + T celler som kombinerer cytotoksisitet og cytokin sekresjon på enkelt-celle-nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award Number R01CA174385. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle utsikt over National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco's PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
- Louis, C. U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 118, 6050-6056 (2011).
- Savoldo, B., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. , (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).
- Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
- Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).
- Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).
- Makedonas, G., Betts, M. R. Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV. Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).
- Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).
