Summary
Werkwijze voor het oplosmiddel toegankelijkheid van de thiolgroep van cysteine residuen van analyseren
Abstract
Het nabootsen van en het benutten van virus eigenschappen en fysisch-chemische en fysische eigenschappen houdt belofte om oplossingen te bieden om een aantal van de meest urgente in de wereld uitdagingen. De enorme bereik en de soorten virussen gekoppeld aan hun intrigerende eigenschappen potentieel geven eindeloze mogelijkheden voor toepassingen in virus-gebaseerde technologieën. Virussen hebben de mogelijkheid om zelf te monteren in deeltjes met discrete vorm en grootte specificiteit van symmetrie, veelzijdigheid en stabiele eigenschappen onder een breed temperatuurbereik en pH-omstandigheden. Niet verrassend, met zo'n opmerkelijke scala van eigenschappen, zijn virussen voorgesteld voor gebruik in biomaterialen 9, vaccins 14, 15, elektronische materialen, chemische middelen, en moleculaire elektronische containers 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
Om virussen in nanotechnologie gebruiken, moeten zij worden gewijzigd in hun natuurlijke vorm om nieuwe functies geven. Deze uitdagende process kan worden uitgevoerd via verschillende mechanismen waaronder genetische modificatie van het virale genoom en chemisch verbonden buitenlandse of gewenste moleculen voor het virusdeeltje reactieve groepen 8. De mogelijkheid om een virus te passen vooral afhangt van de fysisch-chemische en fysische eigenschappen van het virus. Bovendien de genetische of fysisch aanpassingen moeten worden uitgevoerd zonder dat de virus natieve structuur en functie virus. Maize rayado fino virus (MRFV) manteleiwitten zelf-assembleren in Escherichia coli produceren stal en lege VLP die gestabiliseerd door eiwit-eiwit interacties en die gebruikt kunnen worden in virus-gebaseerde technologieën toepassingen 8. VLP's geproduceerd in tabaksplanten onderzocht als een steiger waarop verschillende peptiden covalent worden weergegeven 13. Hier beschrijven we de stappen 1) bepalen welke van de oplosmiddel-toegankelijke cysteines in een viruscapside beschikbaar voor wijzikation en 2) Bioconjugate peptiden om de gewijzigde capsiden. Met natieve of mutationally ingestoken aminozuurresten en standaard koppeling technologieën hebben vele verschillende materialen zijn op het oppervlak van plantenvirussen zoals Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12 Cowpea chlorotic mottle virus 6, tabaksmozaïekvirus virus 17, Turnip geel mozaïek virus 1 en MRFV 13.
Protocol
1. Virusinoculatie en VLP Zuivering van Nicotiana benthamiana Planten
- Produceren afgedekt T7-RNA transcripten van aardappelvirus X (PVX) gebaseerde vector plasmiden met MRFV wild-type (wt) en Cys-gemuteerde manteleiwit (CP) genen 12, met Ambion de T7-mMessage mMachine Kit.
- Voor elke T7 transcriptie reactie inoculeren twee volgroeide bladeren van N. benthamiana met 10 ui reacties en incubeer de planten gedurende 10 dagen in de kas, bij 60% luchtvochtigheid gedurende 16 uur met licht (25.000-30.000 lux) bij 25 ° C en 8 uur donker bij 20 ° C.
- Harves t N. benthamiana virus-geïnfecteerde bladeren 10 dagen na inoculatie (dpi) en weeg het plantenweefsel (50 gram) en plaats op ijs.
- Homogeniseer het plantenmateriaal in een blender in aanwezigheid van 100 ml van een gekoelde oplossing van 0,5 M Na-citraat buffer, pH 5,5 (gebruik 2 ml buffer per gram plantenweefsel).
- Filter homogenaat tot en met 3 lagen van cheeseclOTH en verduidelijken door centrifugeren bij 27.000 xg gedurende 30 minuten. Decanteer het supernatans in een gekoeld maatcilinder, meet het volume, en vervolgens overbrengen naar een gekoelde steriele beker. Gooi de pellet.
- Verwerk de supernatant door 10% polyethyleenglycol 8000 (PEG 8000), roer 15 min bij 4 ° C en nog 45 min incuberen bij 4 ° C om het neerslaan van de virus-achtige deeltjes (VLP's) PEG-matrix.
- Centrifugeer het monster bij 27.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en verwijder het supernatant.
- Verwerk de pellet door toevoegen van 8 ml 0,05 M Na-citraat buffer, pH 5,5 met 2% Triton X-100. Swirl de centrifugebuizen goed aan de pellet los te maken. Breng de pellet en buffer naar een gekoelde steriele beker. Spoel de buizen met 2 ml van dezelfde buffer en voeg toe aan het bekerglas. Roer de suspensie bij 4 ° C totdat de pellets opgelost (gewoonlijk 1 uur).
- Verduidelijken door centrifugatie gedurende 5 min bij 27.000 xg, gooi de pellet en pProcess de supernatant door centrifugatie bij 140.000 g gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml 0,05 M Na-citraat buffer, pH 5,5 en plaats de suspensie op een 10-40% sucrose gradiënt in 0,05 M Na-citraat buffer, pH 5,5.
- Centrifugeer de gradiënt gedurende 3 uur bij 140.000 xg bij 4 ° C.
- Schijnen een licht op de bovenkant van de centrifugebuis en verzamel de lichtverstrooiende bovenste band op 4 cm van de top van de buis, verdund met 0,05 M Na-citraat buffer, pH 5,5, en centrifugeer gedurende 3 uur bij 140.000 xg bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet in 0,5 ml steriel water en bewaar bij 4 ° C tot zes maanden.
- Kwantificeren van de concentratie VLP uitvoeren van een Bradford-eiwittest. De opbrengst van VLP's tussen 1 en 3 ug / g plantenweefsel.
2. Fluoresceïne-5-maleïmide-labelingsreacties van VLP
- Bereid een 1 mM oplossing van fluoresceïne-5-maleïmide (427,37 g / mol) in 50 mM natrium Phosphate buffer, pH 7,0, 1 mM EDTA. Meng met behulp van de vortex en controleer volledig is opgelost. Bescherm de buis van licht met behulp van aluminiumfolie.
- Voeg fluoresceïne-5-maleïmide te VLP geproduceerd in stap 1 en meng. Een 25-voudige molaire overmaat van fluoresceïne-5-maleïmide voor molaire hoeveelheid sulfhydryls. Algemeen met 30 pi van VLP's in een concentratie van 1 pg / pl en 60 ul van de fluoresceïne-5-maleïmide oplossing acceptabele resultaten.
- Incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Beëindig de reactie door toevoeging van dithiothreitol (DTT) tot een eindconcentratie van 50 mM.
- Verwijder niet-gereageerde fluoresceine met een ontzouten spin kolom (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) en centrifugatie gedurende 2 minuten bij 1500 xg bij kamertemperatuur.
- Voor SDS-PAGE-analyse, voeg 10 ui 2 x SDS-PAGE Laemmli monsterbuffer van 10 pi van elke reactie. Sla de gelabelde eiwit beschermd tegen licht bij 4 ° C gedurende maximaal een maand ofeenmalig gebruik in aliquots bij -20 ° C maximaal 3 maanden.
3. Labeling reactie en bepaling van biotine Incorporation
- Gebruik ontzouten spin kolommen (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) om een bufferuitwisseling voeren van water van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.0 van de VLP's geproduceerd in stap 1.
- Bereid een 20 mM voorraadoplossing van maleimide-PEG2-biotine door toevoeging 190 pi PBS in maleïmide PEG2-biotine en mix No-wegen door en neer te pipetteren.
- Voeg maleimide-PEG2-biotine om de VLP's en meng. Een 10-voudige molaire overmaat reagens voor VLP oplossingen ≤ 2 mg / ml.
- Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
- Verwijderen van niet-omgezet maleimide-PEG2-biotine met een ontzoutingskolom spinkolom (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) en centrifugatie gedurende 2 minuten bij 1500 xg bij kamertemperatuur.
- Bepaal de mol biotine per mol VLP's met behulp van de Pierce Biotine Kwantificering Kit (Thermo Scientific) en following instructies van de fabrikant.
4. Verknoping van Cys 2-VLP's en F Peptide
- VLP waardoor beschikbaar cysteïneresten voor verknoping in stap 2 (Cys 2-VLP's) worden in de volgende stap. Bereid een nieuwe verknoping stock oplossing (28,63 mM) door 10 mg van NHS-PEG4-maleïmide vernetter in 680 pl dimethylsulfoxide.
- Los een 17 (F)-aminozuur lang peptide (LLPNMOKDKEACAKAPL) in 50 ul van conjugatie buffer (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) bij een concentratie van 0,1 mM.
- Voeg 4 pi vernettingsmiddel tot 50 pi van de opgeloste peptide (eiwit-NH2) bij 1 mM eindconcentratie (een 10-voudige molaire overmaat van 0,1 mM peptide oplossing).
- Incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Zuiveren verknoopte peptide met een ontzoutingskolom (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) geëquilibreerd met buffer conjugatie (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) door centrifugeren bij 1500 xggedurende 1 min bij kamertemperatuur.
- Stel een reactiemengsel combineren VLPs (eiwit-SH) en verknoopte peptide (eiwit-NH2) in een molaire verhouding bepaald door het aantal thiolen en geactiveerde amines bij de reactie betrokken en het verschil in molecuulgewicht tussen VLP's en peptide.
- Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Voor Western blot analyse mengen verkregen conjugatieproduct 1:1 met Laemmli buffer, koken gedurende 10 min, en doorgaan met SDS-PAGE op een prefab 10-20% Tris-Glycine gel (Invitrogen), gevolgd door elektroblotten op een nitrocellulosemembraan (Invitrogen). Blokkeer de membranen met 1 x PBS, pH 7,2 die 0,05% Tween-20 (PBS-Tween) en 5% magere melkpoeder en probe met peptide-specifieke antilichamen gevolgd door de juiste fosfatase gemerkt secundair antilichaam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdelijke expressie van mutant MRFV manteleiwit (CP) genen in N. benthamiana planten in een PVX-vector based producerende VLP wordt beschreven in figuur 1. De gewijzigde MRFV manteleiwitgen wordt geamplificeerd door PCR en vervolgens onder de transcriptionele controle van de dubbele subgenomische CP promoter in een PVX-vector based, pP2C2S 2 (een gift van D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, Engeland). In vitro RNA transcriptie produceert RNA transcripten die daarna worden gebruikt om N. inoculeren benthamiana planten. In de geïnfecteerde planten (Figuur 2A) MRFV-CP subeenheden vormen VLPs (figuur 2B) die gemakkelijk worden gezuiverd. Vervolgens worden de VLP verknoopt om peptiden.
Een voorbeeld van reactieve aminozuren van het MRFV manteleiwit is weergegeven in figuur 3. Elke geselecteerde aminozuur kan worden gebruikt om resten hechten als het blootgestelde oppervlak. De chemieal technieken omvatten traditionele bioconjugatie strategieën zoals de acylering van de aminogroep van lysine, alkylering van de sulfhydrilic groep cysteine en activering van carboxylzuurresten en koppeling met toegevoegde amines. Bovendien kunnen de aromatische groepen tyrosine en tryptofaan zijn aantrekkelijk doelwit voor bioconjugatie door diazotering en alkylatie.
Het oplosmiddel toegankelijkheid van Cys residuen van VLP aan thiol-specifieke reagentia wordt geïllustreerd in figuur 4. Gezuiverde wt-VLPs (baan 4) en Cys-VLPs mutanten die cysteïneresiduen op positie 107 tot 111 (baan 1) en 192-194 (laan 3) van de CP-gen 12 zijn niet reactief in natuurlijke omstandigheden met thiol-specifiek reagens (ontbreken van fluorescentie). Fluoresceïne-5-maleïmide verleent fluorescentie alleen voor de Cys-VLP mutant die cysteïneresiduen op positie 125-129 van de CP-gen (laan 2). Hieruit blijkt dat VLP's in laan 2 een geometrische arran hebbengement van cysteïnen residuen in oplosmiddel blootgestelde vrije thiolgroepen, dat de cysteïneresten in de monsters in lanen 1 en 3 misschien betrokken bij disulfidebruggen in het vouwen van het manteleiwit.
Labelingsreacties met maleimide-PEG2-biotine gevolgd door biotinylering assay vertegenwoordigen een ander voorbeeld van een analyse van de toegankelijkheid van oplosmiddel Cys residuen. Omdat biotine een relatief kleine molecule kan worden geconjugeerd verscheidene kopieën van de VLP's, die elk een molecuul avidine binden zoals getoond in figuur 5. Het niveau van biotinylering, 84,74 mol biotine per mol eiwit 13, geeft het aantal biotinemoleculen aan de VLP's en bijgevolg het aantal liganden die kunnen worden weergegeven op het buitenoppervlak. Door de beschikbaarheid van diverse thiol groepen op de VLP kunnen peptiden worden bevestigd door verknopingsreacties met NHS-PEG4-maleimide. Dit reagens is een hij tero-bifunctionele cross-linker die reactieve uiteinden zoals N-hydroxysuccinimide (NHS) ester en maleïmide groepen bevat, waardoor covalente conjugatie van amine-en sulfhydryl-bevattende moleculen. Zoals getoond in figuur 6A de NHS ester reageert met primaire amines die amidebindingen, terwijl maleïmide reageert met sulfhydrylgroepen die stabiel thioetherbindingen. Verknopingsreacties produceren VLP-peptide complexen die immunoreactief zijn met de specifieke antilichamen in Western blot zoals weergegeven in figuur 6B.
Figuur 1. Schematische weergave van de productie van VLP's in planten, gevolgd door zuivering en VLPs daaropvolgende verknoping van peptiden.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Symptomen door T7 transcripten inoculatie op N. benthamiana planten (A) en transmissie-elektronenmicroscopie van de geproduceerde VLP (B).
Figuur 3. Een eiwitstructuur voorspelling van wild-type (wt)-MRFV-CP geeft reactieve cysteine aminozuren (aangegeven door pijlen).
Figuur 4. SDS-PAGE analyse van gezuiverde VLP's geconjugeerd aan fluorosCEIN-5-maleïmide. (A) Simply blauwe veilige kleuring werd gebruikt om eiwitten vlek. (B) fluoresceïne-5-maleïmide detectie door middel van fotografie onder UV-belichting. M: Voorgekleurde breed eiwitmerker (Bio-Rad, Hercules, CA), 1: 1-Cys gezuiverd VLP, 2: gezuiverd Cys 2-VLP, 3: gezuiverde Cys 3-VLP, 4: gezuiverde VLP gew. (Cys 1-VLP's, Cys 2-VLP en Cys 3-VLP zijn Cys-MRFV-VLPs mutanten 13).
Figuur 5. AT = 3 lint model van isometrische VLPs die de reactieve sulfhydryl chemie voor (A) biotine etikettering en (B) fluoresceïne-5-maleïmide labeling.
Figuur 6. Diagram eiwit dwarsverbinding tussen Cys 2-VLP's en F peptide (A) en Western blot (B) van Cys-VLP-F gehybridiseerd met specifieke antilichamen tegen F peptide. M: Voorgekleurde breed scala eiwitmerker (Bio-Rad, Hercules, CA), 1:. Cys-VLP-F geproduceerd in stap 4 Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De werkwijze die hier maakt een zeer gevoelige en snelle analyse van reactieve cysteïnen aanwezig op het oppervlak van VLP van plantaardige en op andere eiwitcomplexen. Maleïmiden zijn thiol-specifieke reagentia die reageren met vrije sulfhydryl-bevattende moleculen stabiele thioether bindingen. Deze methode is gebaseerd op de specificiteit van de maleïmides te reageren met sulfhydrylgroepen niet betrokken bij interacties met andere aminozuren. Behoud van de natieve structuur van de VLP erg belangrijk het gehele proces. In de beschreven toepassing worden de reacties uitgevoerd in natuurlijke omstandigheden en bij pH 7 de natieve structuur van de VLP handhaven. Bij neutrale pH hebben maleïmiden optimale reactiviteit met vrije sulfhydrylgroepen. Dit maakt etikettering van de VLP met ofwel fluoresceïne of biotine aan cysteine toegankelijk wijzigingen.
Milde pH (6,5-7.5) en bufferomstandigheden worden ook gebruikt in de verknopingreacties. Het aantal functionele groepen op de VLP bepaalt de juiste verhouding tussen verknopingsmiddel en VLP. Lagere cross-linker aan proteïne verhoudingen worden gebruikt wanneer er veel functionele groepen. Omgekeerd wordt een hogere cross-linker om eiwitverhouding gebruikt met minder beschikbare functionele groepen.
Een aantal factoren waaronder ruimte arm, cleavability, chemische samenstelling, afmeting en oplosbaarheid uiteindelijk bepalen de selectie van de gebruikte verknopingsmiddelen. Bovendien, de keuze van de gebruikte verknoper is een functie van de grootte van de twee eiwitten (in dit geval VLP's en peptide) bij de conjugatie. Hetero-bifunctionele cross-linkers zijn ideaal voor eiwit-peptide of eiwit-eiwit verknoping. Ze kunnen meer gecontroleerde tweestaps reacties die de ongewenste eigen conjugatie en polymerisatie die optreedt wanneer homo-bifunctionele NHS-ester reagentia worden gebruikt minimaliseren. In de eerste stap, de NHS ester reageert wie primaire amines vormen aminozuren obligaties. In de tweede stap, de maleïmide reageert met sulfhydrylgroepen die thioester bindingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vermelding van de handelsnamen van commerciële producten in de publicatie is uitsluitend bestemd voor het verstrekken van specifieke informatie en houdt geen aanbeveling of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van Landbouw.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
