Жесткость на изгиб измерений биополимеров Использование Gliding Анализы

Краткое содержание

Метод измерения длины сохранение или жесткость на изгиб биополимеров описано. Метод использует кинезин управляемые скольжением микротрубочек анализа экспериментально определить сохранением длины отдельных микротрубочек и адаптируется к актина на основе скользящих анализов.

Аннотация

Микротрубочки цитоскелета являются полимерами, которые играют важную роль в делении клеток, клеточной механики и внутриклеточного транспорта. Каждая из этих функций требует микротрубочек, которые являются жесткими и прямыми достаточно, чтобы охватить значительную часть клетки диаметра. В результате, длина микротрубочек настойчивость, мера жесткости, активно исследуется в течение последних двух десятилетий ^1. Тем не менее, открытыми остаются вопросы: короткие микротрубочки в 10-50 раз менее жесткими, чем длинные микротрубочки ^2-4, и даже долго микротрубочек измерили сохранением длины, которые зависят от порядка ^5-9.

Здесь мы представляем метод для измерения длины микротрубочек настойчивость. Метод основан на кинезин управляемые скольжением микротрубочек анализа ^10. Благодаря сочетанию редких флуоресцентные маркировки отдельных микротрубочек с одной отслеживание частиц отдельных флуорофоров прикреплены к микротрубочек, Glidinг траектории одной микротрубочки отслеживаются с нанометрового уровня точности. Сохранение длины траектории так же, как сохранение длины микротрубочек в соответствии с условиями ^11. Автоматизированное отслеживание используется для создания микротрубочек траекторий из флуорофоров к отдельным микротрубочки, и сохранением длины этой траектории рассчитывается с использованием процедуры, написанные на IDL.

Эта техника быстро реализуемым, и способны измерять сохранение длиной 100 микротрубочек в один день эксперимента. Метод может быть расширен для измерения длины настойчивость в различных условиях, в том числе сохранением длины в зависимости от длины вдоль микротрубочек. Кроме того, анализ процедур, используемых может быть продлен до миозина на основе действующего скольжение анализы, чтобы измерить длину сохранение нитей актина, а также.

Введение

Цитоскелет, сеть биополимеров, обнаруживающаяся в большинстве эукариотических клеток, играет важную роль в организации клетки, внутриклеточном транспорте и механике клетки. Механические характеристики биополимеров цитоскелета (преимущественно актина и микротрубочек) в значительной степени определяют механические характеристики клетки в целом¹². Поскольку механика всей клетки может служить признаком здоровых и больных клеток^13,14, а также участвовать в клеточной подвижности¹⁵, механические свойства лежащих в ее основе компонентов цитоскелета являются активной областью исследований на протяжении последних двух десятилетий¹.

Протокол

1. Микротрубочек Gliding анализа растворов

Подготовка перед анализом скольжения.

1. Полимеризации 0,5 мг микротрубочек редко помечены яркой органических флуорофоров ^22. Концентрацией целевой метки составляет 1 флуорофора в микрометра микротрубочек, или маркировки плотности примерно 1 флуорофора на 1500 димеров тубулина. Хранить при комнатной температуре, защищенном от света алюминиевой, фольги на срок до двух недель.
2. Очищают биотин-кинезин ²¹ на примерно 1 мкм. Хранить при -80 ° C в 5 мкл аликвоты для использования в отдельных экспериментах.
3. Подготовка буфере (AB) 50 мМ imidiazole, 50 мМ х....

Результаты

Снимок из анализа скольжения показан на Рисунке 2. Оптимальная плотность микротрубочек составляет 1-10 микротрубочек на поле зрения; значительно большее количество приведет к ошибкам отслеживания, так как микротрубочки будут пересекаться друг с другом. График 11 траекторий микротрубочек из анализа скольжения на Рисунке 2 представлен на Рисунке 3. Типичные траектории имеют длину от 10 до 30 μm; в некоторых траекториях имеются разрывы в местах пересечения одной микротрубоч.......

Обсуждение

Постоянство измерений длины являются хорошей характеристикой механических свойств отдельных биополимеров. В этой статье мы описали метод измерения с сохранением длины микротрубочек. Как отмечалось во введении, этот метод легко распространить на изучение механических свойств микротрубочек в различных условиях просто путем изменения реагентов, температуры и вязкости в заключительном этапе анализа скольжения, 3,9, или путем полимеризации микротрубочек, шаг 1,1, в различных условиях.

Сама методи.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагенты
imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
хлорид калия	Sigma-Aldrich	P9541
хлорид магния	Sigma-Aldrich	M8266
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
BSA	Calbiochem	126615
биотинилированный BSA	Thermo Scientific	29130
α-казеин	Sigma-Aldrich	C6780
стрептавидин	Thermo Scientific	21125
дитиотрейтол	Sigma-Aldrich	D0632
паклитаксел	LC Laboratories	P-9600
глюкозооксидаза	Sigma-Aldrich	G2133
каталаза	Sigma-Aldrich	C100
глюкоза	Sigma-Aldrich	G8270
АТФ	Sigma-Aldrich	A2383
2-mercapt– танол	Sigma-Aldrich	M3148	Токсичный. Покупайте небольшое количество.
24X60 мм No1 1/2 покровное стекло	VWR	48393-252
22X22 мм No1 покровное стекло Gold	Seal	3306
Высоковакуумная смазка	Dow-Corning	NA
Equipment
Микроскоп TIRF	many	NA	Микроскоп TIRF, использованный в этом методе, был самодельным.
IDL (программное обеспечение)	Exelis	NA	Может заменить MATLAB, ImageJ или другое программное обеспечение для анализа изображений.