Summary
Descrevemos aqui um método eficaz para o estudo da dinâmica de depuração de células apoptóticas
Abstract
A eliminação adequada de células indesejáveis ou aberrante através de apoptose e fagocitose subseqüente (clearance celular por apoptose) é crucial para o desenvolvimento normal em todos os organismos metazoários. Recarga celular por apoptose é um processo altamente dinâmico intimamente relacionado com a morte das células, as células apoptóticas unengulfed são mal vistas in vivo sob condições normais. A fim de compreender as diferentes etapas de depuração de células apoptóticas e comparar os fagócitos "profissionais" - macrófagos e células dendríticas em 'não profissional' - células vizinhas tecido residente, in vivo de imagens em directo do processo é extremamente valiosa. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar a liberação celular por apoptose em embriões de Drosophila ao vivo. Para acompanhar a dinâmica das diferentes etapas da fagocitose usamos marcadores específicos para células em apoptose e fagócitos. Além disso, podemos monitorar dois sistemas em paralelo fagócitos: macrófagos 'profissionais' e 'semi-profeglia ssional 'no sistema nervoso central em desenvolvimento (SNC). O método aqui descrito emprega o embrião de Drosophila como um modelo excelente para estudos de depuração de células apoptóticas em tempo real.
Introduction
A eliminação adequada de células indesejadas ou aberrante através de apoptose e fagocitose subsequente é crucial para o desenvolvimento embrionário, bem como para a homeostase dos tecidos no adulto. A fagocitose de células apoptóticas ou na depuração de células apoptóticas é um processo altamente dinâmico, que prossegue em quatro passos: (1) o recrutamento de fagócitos para a célula apoptótica ('encontrar-me'), (2) reconhecimento da célula como um alvo para a fagocitose ( 'comer-me') e (3) imersão, seguido de (4) e da maturação do fagossoma e degradação da partícula apoptótica 1-5. Existem dois tipos de fagócitos: macrófagos "profissionais" e as células dendríticas imaturas, e os "não-profissional" células vizinhas tecido residentes, que são cruciais para a liberação celular por apoptose durante metazoan desenvolvimento 6,7.
No desenvolvimento de Drosophila, a eliminação de células supérfluas por apoptose ocorre em três metrosfases Ain, pela primeira vez em meados da década de embrião e, em seguida, em meados pupa, e novamente na adulta. Durante a embriogênese partículas apoptóticos são removidos por fagócitos "profissionais", macrófagos e pelo "não-profissional" ectoderma e glia 8,9.
No nosso trabalho anterior, identificaram um receptor fagocitária, de seis mícrons, sob (SIMU), que é expresso exclusivamente em células fagocíticas durante a embriogénese. Usando o promotor simulação que gerou um marcador específico para as populações de células fagocíticas (simular cytGFP) que nos permite monitorar macrófagos, ectoderma e glia simultaneamente em um embrião em desenvolvimento ao vivo 8. Além disso, por utilização de marcadores específicos para células apoptóticas em diferentes fases da apoptose, que é capaz de seguir as dinâmicas de depuração de células apoptóticas in vivo.
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Protocol
Para seguir as dinâmicas de depuração de células apoptóticas in vivo duas populações de células deve ser rotulada: células fagocitárias e células apoptóticas.
Para marcar populações de células fagocíticas usamos uma linha de Drosophila que contém o marcador simular cytGFP, que rotula as células fagocíticas exclusivamente no embrião: macrófagos, células gliais e ectoderma 8. Pode-se usar diferentes marcadores de células fagocíticas, incluindo linhas contendo um driver Gal4 específico hemocyte (CRQ-Gal4) ou glia específico Gal4 condutor (repo-Gal4) e um repórter fluorescente geneticamente codificado sob controle UAS (uas-GFP).
Para monitorar as células apoptóticas durante a remoção de células apoptóticas usamos diferente apoptose / marcadores de fagocitose. A anexina V (Molecular Probes), que serve como um marcador precoce de células apoptóticas 10; Phiphilux (OncoImmunin) é um f luorogénico de substrato caspase-3, o qual é utilizado como um apopto depoissis marcador e Lyso Tracker (Molecular Probes) funciona como um marcador phagosome. Nós injetar estes reagentes usando o sistema de microinjeção PicoPump PV 820.
1. Preparando-se
- Heptano cola:
Desenrole a fita dupla face e colocar tanto quanto você pode em um frasco de cintilação, encha com heptano, vedar o frasco com Parafilm e rock por 24 horas. Adicionar heptano se a cola é muito espesso. - Nós permitimos que as moscas para colocar em uma placa de ágar suco de uva pré-aquecido + levedura colar de 2 horas, e depois transferir a placa a 25 ° C por 10-12 horas (depende do estágio desejado) antes da microinjeção e gravações lapso de tempo de embriões injetados. Nós recolher embriões a partir das placas de agar mantido a 25 ° C, proporcionando, assim, a partir de embriões de estágio de 15 ou 16 anos de desenvolvimento.
- Preparação da agulha:
Para preparar agulhas para injeção, nós usamos um "instrumento Sutter 'extrator de agulhas e finos filamentos de vidro de paredes (tubo capilar FHC). A ponta do capilar agrupada está quebradon a um diâmetro de 0,5-2 mM. - Lamela com cola:
Utilizando uma ponta de pipeta de dispersar uma gota de cola de heptano numa linha no meio da lamela. Deixe secar por alguns segundos. Prepare algumas dessas lamelas.
2. Preparação embrião
- Coletar embriões a partir de placas de ágar e transferi-los para um filtro de células (SPL Life Sciences), utilizando um pincel limpo e água corrente. O filtro é realizada ao longo de um copo para recolher águas residuais.
- Lavar os embriões no filtro de células usando água até que toda a pasta de levedura é removida.
- Seca-se o excesso de água, limpando o exterior do filtro utilizando Kimwipes.
- Colocar o filtro de células numa placa de Petri limpo e adicionar 50% de branqueador suficiente para cobrir os embriões no filtro celular. Dechorionate os embriões para 2 min ocasionalmente (2-3 vezes), misturando-os.
- Enxágüe com água extensivamente até embriões soltos o odor lixívia.
- Coloque o filtro de células em um ambiente limpoPlaca de Petri e cobrir os embriões com água para evitar ressecamento.
- Antes de iniciar a configuração embriões, carregar 1 ul do reagente desejado para as duas agulhas (por vezes, uma agulha pode ser obstruído). Demora cerca de 5 min para o líquido atinja a ponta da agulha.
- Corte um pedaço retangular de ágar suco de uva e coloque-o sobre uma lâmina de microscópio. Transferência de embriões dechorionated da placa de Petri para a peça de agar usando um pincel limpo.
- Sob um microscópio de dissecção fluorescente seleccionar adequadamente encenado embriões que expressam o marcador GFP usando um pincel molhado e colocar cada embrião perto da borda da peça de ágar numa linha um após o outro (Figura 1A). Os embriões devem ser colocadas com o lado ventral para cima para a fagocitose imagiologia por glia no Sistema Nervoso Central (SNC).
- Configure cerca de 10 embriões em uma linha.
- Anexar os embriões para uma lamela revestida no meio, com uma tira de cola heptano (Figura 1B, C
- Coloque a lamela na câmara de desidratação por aproximadamente 5 minutos (isso depende da umidade da sala ea quantidade a ser injetada).
- Após a secagem até cobrir os embriões com óleo halocarbono 700 (Sigma) para evitar a desidratação.
- Coloque a lamela numa lâmina de microscópio com os embriões voltados para cima. Você pode colocar uma gota de água sobre a lâmina para evitar que se deslocam da lamela. Os embriões estão prontos para injeção. Local de injecção é tipicamente na face lateral no meio do embrião.
3. Injeção de embrião
- Coloque a agulha de um micromanipulador.
- Para quebrar a ponta da agulha de colocar a extremidade da lamela no campo de visão e ajustar a agulha para o mesmo plano focal. Muito se mover cuidadosamente a lamela até atingir a ponta da agulha e quebra.
- Incidindo sobre os embriões, coloque a agulha no óleo e certifique-se de obter uma gota de líquido da agulha. Isso significa que a ponta da agulha foiassim quebrada.
- Sem tocar o suporte de agulha move o embrião dentro da agulha e injectar uma gota para o embrião. Mova o embrião longe e avançar para a próxima até que todos os embriões são injetados.
4. Imagem
Nós imagem os embriões em um microscópio confocal invertido com objetiva de 40X ou 100X. Procuramos um embrião bem posicionado com o sistema nervoso central, no meio, o que demonstra uma forte expressão da GFP e uma boa marcação das células apoptóticas após a injecção.
Para o período de gravações lapso de embriões vivos costumamos escolher 5 ou 6 fatias confocal (2 mm de espessura cada). Depois, fazemos uma projecção de 3 fatias (6 m de espessura), a fim de observar as células inteiras.
Nós usamos marcadores de células em apoptose, que são estáveis e não lixívia facilmente. Para evitar GFP branqueamento fazemos gravações em intervalos de 60 seg.
Em alguns casos, os embriões podem começar a rolardurante o tempo de gravação de vídeo. Portanto, vamos dar uma olhada de vez em quando na gravação, a fim de parar e começar de novo, se necessário.
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Representative Results
Representativos de fotogramas de um filme em que as células apoptóticas são rotulados com anexina V, e as células gliais, ectoderme e macrófagos são rotulados com simular cytGFP são mostrados na Figura 2. Cada quadro é uma projeção de três fatias de 2 m cada.
O embrião de fase 15 está adequadamente posicionada mostrando o SNC embrionárias em meio com células gliais bem marcado (g). Macrófagos (m), que são na sua maioria fora do SNC, mostram forte expressão GFP citoplasmática. Ectodérmica células são também marcadas com GFP citoplasmática (e). Muitas células positivas para anexina V são vistas dentro e fora do SNC. Para seguir o evento imersão não é fácil. Destacamos um evento com um retângulo branco, onde uma célula glial está engolindo uma partícula apoptose. Note-se a sondagem do comportamento das células da glia: tocar a partícula apoptótica algumas vezes sem engolindo-a e, em seguida, termina-se com a imersão de anexina V marcada celular por apoptose (Figura 2
Outros marcadores para diferentes fases de apoptose podem ser usados com o mesmo procedimento.
Figura 1. Representação esquemática da preparação embrião para microinjeções. A. Uma lâmina de microscópio que contém um pedaço de ágar-ágar na qual embriões são transferidos após dechorionation. Cerca de 20 embriões são colocados em linha, perto da borda da peça de ágar com o lado ventral para cima, para a imagiologia do SNC. B. Uma lamela contendo uma faixa de cola de heptano no meio. C. A lamela de B com embriões ligado à tira de cola heptano.
Figura 2. Análise dinâmica de folga celular por apoptose. Gravação Time-lapses de folga celular por apoptose em um estágio de 15 embriões. Glia (g), macrófagos (m) e ectoderma (e) são rotulados com simular cytGFP (verde). Células em apoptose são marcados com o fluorescente anexina V (vermelho). A. quadros selecionados de um filme representativo são mostrados. A célula glial engolindo um celular por apoptose é representado por um retângulo. B. Close up vista do retângulo marcado.
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Discussion
Desembaraço celular por apoptose é um último estágio crítico de apoptose, que é altamente dinâmico. Portanto, estudos sobre o processo em tempo real são de extrema importância. Aqui nós descrevemos um protocolo que permite o monitoramento de folga celular por apoptose no desenvolvimento de embriões de Drosophila vivendo. Neste processo, duas populações de células deve ser marcado com marcadores específicos: células apoptóticas e fagócitos. O repórter simular cytGFP é adequado para monitorizar fagocíticas macrófagos, células gliais e ectoderme simultaneamente no mesmo embrião, hich w torna possível seguir diferentes populações de células fagocíticas, ao mesmo tempo. Esta é uma grande vantagem para o estudo "profissional" e "não-profissional" de apuramento ao mesmo tempo, comparando aspectos específicos do processo, tais como taxa, especificidade e capacidade de degradação. Uma desvantagem desta abordagem é que simula cytGFP marcador é expresso muito fortemente em macrófagos e muito mais fraco emglia, o que pode ser complicado para ajustar no mesmo filme. No entanto, uma folga pode imagem apoptótica celular por macrófagos, separadamente, a partir deste processo no SNC, por conduzir a expressão da GFP com Gal4s específicos (CRQ-Gal4 para macrófagos e repo-Gal4 para a glia).
Marcadores diferentes para células em apoptose refletindo alterações moleculares e morfológicas específicas são de grande valor para a compreensão da dinâmica e reversibilidade da apoptose e desembaraço celular. Além disso, a gravação em tempo real de depuração de células apoptóticas usando estes marcadores de adicionar informação adicional sobre fenótipos mutantes, que não poderiam ser obtidos através de técnicas convencionais de imuno-histoquímica em embriões fixos.
O passo mais difícil do protocolo descrito, quando imagiologia do SNC em desenvolvimento, é o posicionamento extremamente preciso dos embriões antes da injecção. Mesmo um ligeiro movimento da lamela durante a fixação do preparadoembriões para a cola poderia mudar a sua posição, o que não seria adequado para a imagiologia do SNC. O embrião anexando passo deve ser feito com o máximo de atenção.
O desenvolvimento de marcadores adicionais para as fases específicas na apoptose e fagocitose seria extremamente desejável para dissecção mais finas e possível manipulação de depuração de células apoptóticas. O protocolo apresentado aqui serve como uma boa base para o desenvolvimento futuro.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma Marie Curie Reintegração Grant (IRG249084). Agradecemos a todos os membros do laboratório Kurant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
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