Summary
Complessi proteici catalizzano le funzioni cellulari fondamentali. Caratterizzazione funzionale e strutturale dettagliata di molti complessi essenziali richiede la produzione ricombinante. MultiBac è un sistema di celle di baculovirus / insetto particolarmente adattato per esprimere proteine eucariotiche e dei loro complessi. MultiBac è stato implementato come una piattaforma open-access, e le procedure operative standard sviluppati per massimizzare la sua utilità.
Abstract
Ricerca proteomica ha rivelato l'impressionante complessità del proteoma eucariotiche in dettaglio senza precedenti. Ora è un concetto comunemente accettato che le proteine nelle cellule esistono per lo più non come entità isolate, ma esercitano la loro attività biologica in collaborazione con molte altre proteine, nell'uomo dieci o più, formando catene di montaggio della cella per la maggior parte se non tutte le funzioni vitali. 1 , 2 Conoscenza della funzione e l'architettura di queste assemblee multiproteici richiede la loro disposizione in una qualità superiore e la quantità sufficiente per l'analisi dettagliata. La scarsità di molti complessi proteina nelle cellule, in particolare negli eucarioti, vieta loro estrazione da fonti native, e richiede la produzione ricombinante. Il sistema di vettore di espressione di baculovirus (BEVS) ha dimostrato di essere particolarmente utile per produrre proteine eucariotiche, la cui attività si basa spesso su elaborazione post-traduzionale che altri sistemi di espressione comunemente usati spesso puònon supportano. 3 BEVS utilizzare un baculovirus ricombinante in cui è stato inserito il gene di interesse per infettare colture cellulari di insetto che a loro volta producono la proteina di scelta. MultiBac è un BEVS che è stato particolarmente su misura per la produzione di complessi di proteine eucariotiche che contengono molte subunità. 4 Un prerequisito fondamentale per una produzione efficiente di proteine e loro complessi sono protocolli affidabili per tutte le fasi coinvolte in un esperimento di espressione che idealmente può essere implementato come procedure operative standard (SOP) e seguito anche da utenti non specializzati con relativa facilità. La piattaforma MultiBac al Laboratorio europeo di biologia molecolare (EMBL) utilizza POS per tutti i passaggi necessari per un multiprotein esperimento un'espressione complessa, a partire dalle inserimento dei geni in un genoma baculoviral ingegnerizzato ottimizzato per la produzione di proteine eterologhe proprietà di analisi su scala ridotta della proteina esemplari prodotti. 5-8 La piattaforma diè installato in una modalità di accesso aperto presso l'EMBL di Grenoble e ha supportato molti scienziati del mondo accademico e industria per accelerare i progetti di ricerca complessi proteici.
Introduction
Attività biologica è controllata da gruppi di proteine e altre biomolecole che agiscono di concerto per catalizzare le funzioni cellulari. Tipici esempi sono i macchinari che trascrive l'informazione ereditaria contenuta nel DNA in RNA messaggero. Negli esseri umani, più di 100 proteine si uniscono in un processo definito e disciplinato a trascrivere i geni, formando grandi complessi multiproteici con 10 e più subunità tra RNA polimerasi II e dei fattori di trascrizione generali come TFIID, TFIIH e altri. 9 Altri esempi sono il ribosoma, composto di molte proteine e molecole di RNA, che catalizza la sintesi proteica, o il complesso nucleare del poro che è responsabile della spola biomolecole attraverso la membrana nucleare negli eucarioti. Una dissezione dettagliata architettonico e biochimici di sostanza, tutte le macchine multicomponente nella cella è fondamentale per capire la loro funzione. La delucidazione struttura dei procarioti e eukarribosomi yotic, per esempio, costituivano eventi caratteristici che producono visione senza precedenti di come queste macchine macromolecolari svolgere le loro funzioni indicate nella cella. 10,11
Ribosomi possono essere ottenuti in qualità e quantità sufficiente per studio dettagliato purificando il materiale endogeno da cellule in coltura, dovuta al fatto che fino al 30% della massa cellulare consiste di ribosomi. RNA polimerasi II è già meno abbondante di ordini di grandezza, e molte migliaia di litri di coltura di lievito dovevano essere elaborati per ottenere una dettagliata vista atomico di questo complesso essenziale centrale per la trascrizione. 12 La stragrande maggioranza degli altri complessi essenziali sono comunque presenti in molto più bassi importi in cellule native, e quindi non possono essere adeguatamente purificati da materiale di origine nativa. Per rendere tali complessi accessibili per l'analisi strutturale e funzionale dettagliata richiede produzione eterologa mediante te ricombinantechniques.
Produzione di proteina ricombinante ha avuto un grande impatto sulla ricerca di scienze biologiche. Molte proteine sono state prodotte ricombinante, e la loro struttura e funzione sezionati ad alta risoluzione. Programmi di genomica strutturale hanno approfittato della delucidazione dei genomi di molti organismi per affrontare il gene prodotto repertorio di interi organismi in modalità high-throughput (HT). Migliaia di strutture proteiche sono state così determinato. Ad oggi, il sistema più prolifico utilizzato per la produzione di proteina ricombinante è stata E. coli, e molti sistemi di espressione sono stati sviluppati e perfezionati nel corso degli anni per la produzione di eterologa in questo host. I plasmidi che ospitano un gran numero di funzionalità per consentire la produzione di proteine in E. coli riempiono interi cataloghi di fornitori commerciali.
Tuttavia, E. coli ha alcune limitazioni che rendono non adatti per produrre molte proteine eucariotiche e in pcomplessi proteici articolari con molte subunità. Pertanto, la produzione di proteine in ospiti eucariotici è diventata sempre il metodo di scelta negli ultimi anni. Un sistema particolarmente idoneo per produrre proteine eucariotiche è il sistema di vettore di espressione di baculovirus (BEVS) che si basa su un baculovirus ricombinante che trasportano i geni eterologhi per infettare colture di cellule di insetto coltivate in laboratorio. Il sistema è un MultiBac BEVS recentemente sviluppate, particolarmente su misura per la produzione di complessi proteici eucariotiche con molte subunità (Figura 1). MultiBac è stato introdotto nel 2004. 13 Dalla sua introduzione, MultiBac è stato continuamente perfezionato e snella per semplificare la gestione, migliorare la qualità delle proteine bersaglio e in generale rendere il sistema accessibile agli utenti non specialisti per la progettazione di procedure operative standard (SOP efficienti). 4 MultiBac è stato implementato in molti laboratori in tutto il mondo, in academia e industria. Alla EMBL di Grenoble, programmi di accesso transnazionali sono state messe in atto dalla Commissione europea per fornire formazione di esperti presso la piattaforma MultiBac per gli scienziati che hanno voluto utilizzare questo sistema di produzione per far progredire la loro ricerca. La struttura e la funzione di molti complessi proteici che erano fino a quel momento non accessibile è stato spiegato, utilizzando campioni prodotti con MultiBac. 4 Nel seguito, le fasi essenziali della produzione MultiBac sono riassunti in protocolli come sono in funzione presso l'impianto MultiBac presso l'EMBL di Grenoble.
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Protocol
1. Recombineering Tandem (TR) per la creazione di multigenica costrutti di espressione
- Pianificare la strategia di co-espressione. Approccio progettuale per l'inserimento dei geni di interesse in donatori e accettori. Potenziali moduli fisiologici del vostro complesso dovrebbero essere raggruppati insieme su Aderenti ei donatori specifici. Utilizzare Modulo Moltiplicazione composto da endonucleasi Homing (HE) - coppie BstXI combinare cassette di espressione sul singolo donatore e plasmidi Acceptor 7,8 Crea tutti i costrutti rilevanti in silico e validare accuratamente la strategia prima di procedere al lavoro sperimentale.. Per esempio, geni di interesse dovrebbero essere controllati per non contenere HE o altri siti di restrizione e la presenza di corrette fasi di lettura aperta (ORF) dovrebbe essere convalidato. Considerare l'ordinazione geni sintetici ottimizzati per insetti cella codon usage e struttura secondaria dell'mRNA per migliorare i livelli di produzione di proteine così come la rimozione di qualsiasi esisting HE siti dei geni di interesse. Provare a inserire i tag di depurazione sulla base dei dati della letteratura sulla N-o flessibili o esposti C-terminali delle vostre proteine di scelta. Si consideri l'applicazione di strategie poliproteici che mirano a produrre diverse subunità proteiche nel complesso se le quantità relative di singole proteine devono essere controllati a causa di problemi di stechiometria del complesso. 4 Preparare dettagliato "How-To" del documento (si consiglia di prenotare laboratorio elettronico) contenente tutte le fasi proiettate sperimentali del progetto che porta al costrutto multigene completa (s). Creare file elettronici dei Cre-LoxP plasmidi fusi per esempio utilizzando il software di Cre-ACEMBLER che può essere scaricato dalla home page Berger gruppo ( multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / CRE-acembler ).
- Inserisci i tuoi geni di interesse in donatori selezionati eAccettori utilizzando enzimi di restrizione e ligasi, o, in alternativa, mediante legatura metodi indipendenti seguenti protocolli pubblicati. 5,6,14 Se si ha accesso a una gestione dei liquidi stazione di lavoro e se si prevede un gran numero di costrutti da generare ( ad esempio, per gli approcci combinatori) considerare l'utilizzo di script robotica sviluppate e attuate dal gruppo Berger (Figura 2). 14,15 Se una manipolazione dei liquidi stazione di lavoro non è disponibile, il funzionamento manuale utilizzando micropiastre permette l'inserimento del gene in un HT come la moda.
- I vincoli imposti dalla necessità di controllare la stechiometria delle subunità espresse potrebbero materializzarsi. Nel caso di stechiometricamente livelli di espressione squilibrate di singole subunità di un complesso proteico, è consigliabile applicare strategie poliproteici di coniugare diverse subunità del vostro complesso e una proteasi specifica (ad esempio tabacco etch virus NIA proteasi) in singoli grandi ORF distanziati di ssiti proteolitici specifici applicabili. 4,8 considerare co-esprimono uno o più poliproteine con cassette di espressione singoli, se si dispone di un grande complesso con numerose subunità e ampiamente che vanno pesi molecolari delle singole unità. Considerare co-esprimono diversi geni che codificano per la stessa proteina in una poliproteina o come diversi cassette di espressione identici se tale proteina è caratterizzata da una bassa resa di produzione. 4,13
- Convalidare tutti i costrutti del donatore e l'accettore clonati da mappatura di restrizione (a scelta in high-throughput) e sequenziamento. Procedere a fondere combinazioni donatore-accettore di Cre-loxP ricombinazione per generare i multigeniche espressione costrutti di scelta. Confermi purificata Acceptor-donatori plasmidi fusione di mappatura di restrizione, utilizzare sequenze elettroniche create da Cre-ACEMBLER o programmi simili come riferimento.
- Conservare purificati e convalidato I donatori, accettori e fusioni donatore-accettore a -20 ° C o -80 ° C. Archivio plasmids e le loro sequenze (Microsoft Excel, Filemaker, altri) con cura per un utilizzo successivo.
2. Composito multigene Baculovirus Generation, Amplificazione e conservazione
- Integrare vettori di trasferimento multigeniche genoma baculoviral MultiBac trasformandosi in DH10 cellule che ospitano il genoma virale e le funzionalità necessarie per la TN7 trasposizione. Si noti che il genoma baculoviral MultiBac può essere precaricato con particolari geni di interesse (YFP marcatore, accompagnatori, ecc) nel proprio sito loxP (costruito nel genoma distale al sito di attacco TN7) da una reazione in vivo Cre precedente TN7 integrazione. Dopo 13 TN7 trasposizione, cellule con baculovirus composito contenente i geni di interesse sono selezionati mediante screening blu / bianco (successo TN7 risultati trasposizione in perdita di α-complementazione della β-galattosidasi, pertanto, colonie con TN7 corretta trasposizione rimangono bianco su una selettivapiatti gar contenenti X-gal) e il genoma è preparato da lisi alcalina e etanolo / isopropanolo precipitazioni. 5,6
- Trasfezione e produzione di virus iniziale. Posto 6 pozzetti coltura tissutale in cappa sterile. Dal log-fase SF21 coltura di cellule di insetto, seme fuori aliquote di cellule nei pozzetti e trasfezione con l'aggiunta del genoma purificata baculoviral e un reagente di trasfezione mescolato in terreni di coltura, come descritto. 6 Harvest virus iniziale dopo 48-60 ore rimuovendo il materiale ( alta qualità, basso titolo virale V 0, tipicamente 3 ml per pozzetto). Supplemento mezzi freschi e di prova per la produzione di proteine (e, se un marcatore YFP è presente, per fluorescenza) dopo altri 2-3 giorni. 6,7
- Amplificazione di virus, basso MOI regime. Utilizzare V 0 virus per infettare 25-50 ml di cellule in fase logaritmica (densità cellulare <1x10 6 cellule per ml) in piccolo (100-250 ml) Erlenmeyer palloni shaker agitatosulla piattaforma agitatori orbitali (Figura 3). Contare le celle e dividere ogni hr 24 fino le cellule smettono di raddoppio (proliferazione arresto). Seguire un regime basso MOI (molteplicità di infezione cioè il numero di particelle virali per cellula): Le cellule devono raddoppiare (almeno) una volta (MOI <1), altrimenti ripetere esperimento con un volume minore di V 0 aggiunti. Normalmente, 3 ml di 0 V sono usati per infettare 25 ml di cellule di insetti Sf21 ad una densità di 0.5x10 6 cellule / ml. Ciò è essenziale per evitare dannose sovra-amplificazione e cancellazione automatica di virus che può causare la perdita di geni eterologhi di interesse. Harvest V 1 virus (25-50 ml) dopo 48-60 ore dal pellet cellule e rimuovendo i supporti contenenti il virus. Integrare con mezzi freschi e test di YFP e la produzione di proteine, eliminando 6 celle 1x10 ogni 12 o 24 ore, pellet e convalidare la produzione di proteine e di segnale proteina marker (YFP). 6, Amplifica virus (perV 2) ulteriormente se volumi di espressione più grandi sono finalizzate a infettando fino a 400 cellule in 2 ml L shaker beute con V 1 virus rispettando il basso sopra MOI regime (cellule devono raddoppiare almeno una volta dopo l'infezione con V 1). Rigorosamente testare la produzione di proteine e di segnale proteina marker durante l'amplificazione per evitare l'accumulo di virus difettosi contenenti non più i tuoi geni di interesse. 5-7 Utilizzo pellet cellulari si accumulano ad ogni amplificazioni passo già per stabilire protocolli di purificazione per il complesso proteina espressa di interesse.
- Stoccaggio BIIC produzione del virus. Si consiglia vivamente di memorizzare virus V 2 come il virus di produzione utilizzando il BIIC (B aculovirus-i nfected i nsect c ell) metodo, per evitare modifiche (ad esempio la perdita del gene di interesse) del virus ricombinante e per preservare l'alta espressione livellos 16 pellet cellule infette è osservata 24 ore dopo l'arresto della proliferazione -. di questo stadio le cellule contengono particelle virali complete poco prima che sarebbero stati rilasciati (per gemmazione) nei mezzi di comunicazione. Rimuovere i supporti e le aliquote congelamento del pellet di cellule in azoto liquido e conservare a tempo indeterminato. 7,16
3. Produzione di proteine e trattamento a valle
- Infettare grandi culture (R) e di monitoraggio YFP. Utilizzare V 1, V 2 o congelati aliquote BIIC di infettare colture cellulari più grandi per i cicli di produzione (in genere 400 ml a 2 l fiaschi). Aderire a basso regime di MOI (regolare il volume virus utilizzato per l'infezione in modo che la cultura infetto raddoppia almeno una volta). Ingrandire volumi di coltura infetti, se necessario in base al numero di flaconi moltiplicando. Se YFP proteina marker è presente, recedere in definiti intervalli di 1x10 6 celle, pellet e lisare le cellule e monitorare l'evoluzione del segnale YFP fino a un plateau viene raggiunto indicating massima produzione di proteina ricombinante. YFP livelli possono essere misurati in un pozzo lettore di piastra di serie 96 in grado di registrare segnali di fluorescenza (ad esempio Tecan SPECTRAFluor). Celle di raccolta in questa fase. Pellet cellulari conservare a -20 ° C (breve termine) o -80 ° C (a lungo termine).
- La lisi cellulare e frazionamento. Lyse cellule dal vostro metodo preferito di scelta, su misura per le esigenze della vostra proteina (gelo-disgelo, sonicazione, stampa francese, altri). 5-7 citosol frazionare e di nuclei e di test per la presenza dei vostri proteine di interesse. Sviluppare protocolli di purificazione basati sui risultati di semplificare la purificazione di proteine. Si consideri l'applicazione di procedure di immersione totale per estrarre la vostra proteina dalla frazione nucleare in condizioni di alto KCl se le proteine risiedono nel nucleo. 7,18
- Purificazione della proteina (micro-scala, su larga scala). Si noti che spesso piccoli volumi (10 o 25 ml) di coltura cellulare sono susere sufficienti per ottenere pellet cellulari per la purificazione di notevoli quantità di vostre proteine di interesse a causa dei tipicamente elevati o molto elevati livelli di produzione di proteine eterologhe nei sistemi cellulari baculovirus / insetto (spesso 10-100 mg di proteine per L cultura e altro ancora). In concomitanza con micro-depurazione (piastre a pozzetti multipli, metodi MicroTip, sistema di GE Healthcare ÄKTAmicro, altri) è possibile ottenere dati biochimici e di attività e spesso anche quantità sufficiente di proteine desiderate e complessi per nanolitri scala cristallizzazione high-throughput (HTX ). Considerare l'utilizzo di metallo purificazione di affinità (Clonetech Takara TALON, Qiagen Ninta resine chelante metallo) e un oligo-istidina (6-10 residui) tag su subunità esposte della vostra proteina complessi per facilitare la purificazione, in collaborazione con scambio ionico e cromatografia ad esclusione dimensionale in piccolo volumi usando per esempio la ÄKTAmicro o una simile piccola macchina di purificazione del volume (Figura 4
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Representative Results
Forte co-espressione di proteine eterologhe raggiunti dal sistema MultiBac è mostrato in Figura 1d (sonde prelevati 48 ore dopo infettare una coltura cellulare di sospensione). Le bande proteiche sono overexpressed chiaramente distinguibile nell'estratto cellula intera (SNP) e il lisato eliminato (SN). La qualità e la quantità del materiale di proteina prodotta è spesso sufficiente a consentire la determinazione della struttura di complessi proteici, come il punto di arresto mitotico complesso MCC mostrato in Figura 1e. 17
La Figura 2 mostra il flusso di lavoro di un esperimento di assemblaggio gene recombineering tandem assistita da robot (TR). Protocolli di assemblaggio del DNA robusti erano sceneggiato in routine di robotica per l'assemblaggio parallelizzata di multigeniche costrutti di espressione. I singoli passi robotici sono mostrati in istantanee (Figura 2c, I - IV). I componenti del DNA da assemblare sono generati mediante PCR e qualità controllati dae-gel (Figura 2d, a sinistra), i costrutti multigeniche assemblati sono altresì convalidato mediante PCR con set appositamente progettati di primer (figura 2d, a destra) 14,15.
Generazione baculovirus ricombinante e amplificazione segue le procedure operative standard (schematicamente mostrato in Figura 3a). Istantanee di cellule coltivate in un monostrato sono mostrati (Figura 3b, I. e II.) Infezione segue con un virus MultiBac.
Trattamento a valle dei complessi proteina ricombinante può essere miniaturizzato utilizzando cromatografia multi-ben piatto o microtip-based per la purificazione di affinità seguita dalla dimensione esclusione cromatografia (SEC) dei complessi integrando nei work-flow di sistemi di piccole dimensioni, come la ÄKTAmicro (Figura 4a). Viene mostrato un profilo rappresentativo SEC di un ~ 700 kDa umano complesso fattore di trascrizione. Campione purificato mediantela ÄKTAmicro in piccola scala è tipicamente sufficiente per la caratterizzazione mediante biochimici e biofisici compreso microscopia elettronica (Figura 4b).
Figura 1. Piattaforma tecnologica MultiBac per multiprotein produzione complessa. (A) geni di interesse sono integrati nel genoma baculoviral MultiBac utilizzando TN7 trasposizione in congiunzione con lo screening blu / bianco. Un sito loxP sul backbone virus consente aggiunta di ulteriori funzionalità come una proteina marcatore fluorescente per monitorare le prestazioni virus e produzione di proteine eterologhe. (B) Il baculovirus adotta una forma chiavetta allungata ed è caratterizzata da un involucro flessibile che può aumentare per accogliere l' grande genoma del DNA a doppia elica (> 130 kb) circolare. Grandi eterologa inserzioni gene nel genoma sono tollerati by allungando la busta. (c) standard beute su agitatore orbitale piattaforme possono essere usati per la coltivazione di colture cellulari di insetto grande scala per la produzione di proteine heterologues. (d) Il sistema MultiBac produce efficientemente proteine ricombinanti che spesso sono chiaramente visibili già in tutta- estratto cellulare (SNP). (e) La struttura del complesso checkpoint mitotico è stato chiarito dalla diffrazione di raggi X da cristalli cresciuti da campione realizzato con il sistema MultiBac 17. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. (Automated) Tandem recombineering (TR). (A) Tandem recombineering utilizza piccoli array di molecole di DNA plasmidico sintetico chiamato donatori e accettori per l'assemblaggio multigene costrutti di espressione, opzionalmente in modalità assistita da robot utilizzando una gestione dei liquidi stazione di lavoro (a destra). (b) Il flusso di lavoro TR è mostrato. SLIC è sinonimo di sequenza e legatura clonazione indipendente, Cre sta per le Cre-LoxP fusione concatenamento di donatori e accettori in cui i geni di interesse sono stati inseriti da SLIC. Espressione multigene costrutti generati da questa procedura recombineering con SLIC e Cre in tandem vengono poi integrati nel genoma baculovirus MultiBac e utilizzato per l'espressione piccola e grande scala in colture di cellule di insetto infettate dal virus ricombinante. (C) Istantanee della TR robot-assistita processo sono mostrati compresa fornitura di DNA stampo e primer (I), preparazione di reazioni PCR in piastre multipozzetto (II), amplificazione PCR del DNA (III) e preparazione di costrutti multigene cresciuti in coltura batterica mediante lisi alcalina in piastre multi-pozzetto ( IV). (d) i prodotti di PCR utilizzati per TR sono visualizzati con noizione del sistema di e-gel (a sinistra). Costrutti multigeniche completati sono convalidati da analitiche reazioni PCR caricati su un e-gel (a destra). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Generazione MultiBac virus, amplificazione, stoccaggio. (A) La procedura operativa standard (SOP) della piattaforma MultiBac al EMBL Grenoble è mostrato in una vista schematica. Ricombinante virus MultiBac è identificato con lo screening bianco-blu e preparato da colture batteriche. Trasfezione iniziale avviene 6 pozzetti seminati con monostrati di cellule di insetto (SF21, Sf9, Hi5, altri). Virus è amplificato e proteina bersaglio prodotta in beuta agitatori. Virus è memorizzata da aliquote di congelamento delle cellule di insetto infettate (BIIC). Florescence viene registrato come strumento analitico, seYFP (o un'altra proteina fluorescente) è stato integrato come proteina marker per esempio nel sito loxP presente sul genoma baculoviral MultiBac. (B) Istantanee di cellule di insetto infettate con baculovirus MultiBac sono mostrati. Le cellule smettono di proliferare, aumentano di dimensione (I.). Si osservano la fusione di cellule (II). Virus sbocciato fuori le cellule infette nei media vengono raccolte e utilizzate per infettare colture cellulari più grandi per la produzione di proteine complesse (III, IV). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Proteina complessa produzione e di trasformazione a valle. Proteine campione complesso possono essere già convenientemente purificati da colture di cellule iniziali di piccole dimensioni, utilizzando metodi di purificazione miniaturizzati come alveolare o microtip-purificazione a base, eventualmente in combinazione con sistemi di cromatografia di piccolo volume (a sinistra). Spesso la resa già queste "analitici" corre depurazione (al centro) è sufficiente per analizzare la struttura e la funzione del complesso purificato da una varietà di mezzi, tra cui la microscopia elettronica (a destra). Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Video istantanee delle figure 2 e 3 illustrano l'intero processo di generazione robot-assistita da cDNA di espressione multigene costruisce fino alla infezione di colture cellulari di insetto per la produzione di proteine. Nuovi reagenti (plasmidi e virus) e protocolli robusti sono stati sviluppati per consentire una pipeline basandosi su SOP. L'intera filiera è stato implementato come una piattaforma tecnologica al EMBL di Grenoble. La piattaforma MultiBac è stata letta da molti scienziati del mondo accademico e dell'industria che sono impegnati nella ricerca multiprotein. L'accesso di formazione è supportata da programmi di accesso dedicati finanziati dalla Commissione Europea (P-CUBE, BioSTRUCT-X).
La disponibilità di POS per effettuare proteina espressione complessa utilizzando il sistema MultiBac ha reso questa tecnologia facilmente riconducibili anche ad utenti non specializzati. Operazione assistita da robot accelera multiprotein produzione complessa in partilare quando un numero sufficientemente grande di complessi, per esempio varianti e mutanti di un campione di interesse, devono essere generati in parallelo. Tuttavia, il funzionamento manuale in basso a velocità medie molto anche beneficia della disponibilità di POS. Nella nostra esperienza, i processi che potrebbero essere successo sceneggiato in routine robotica bisogno di essere raffinato prima con uno sforzo significativo fino a quando sono stati ottenuti protocolli sufficientemente robusti che sono compatibili con l'utilizzo di un robot. Tali protocolli sono alla base delle nostre procedure operative standard. 5,6,14,15, infatti, l'implementazione di questi protocolli robusti per il robot portare ad un notevole guadagno di efficienza anche di operazioni manuali nel nostro laboratorio.
Molte proteine e complessi proteici sono stati e vengono prodotte utilizzando il sistema MultiBac che abbiamo sviluppato, e quasi 500 laboratori in tutto il mondo hanno ottenuto i reagenti. MultiBac ha catalizzato ricerca non solo in biologia strutturale, ma anche in molti OTHaree er delle scienze della vita che indagano o che sfruttano le interazioni tra proteine in grandi assiemi. MultiBac è stato utilizzato anche per la produzione di proteine target di notevole interesse farmacologico comprese particelle virus-simili, che possono diventare utili vaccini candidati. 4 Più di recente, MultiBac è stato utilizzato anche per fornire i geni nelle cellule di mammifero e colture cellulari, o addirittura interi organismi da terapia genica. 4 Anticipiamo che approcci come quelli illustrati in questo contributo si rivelerà utile per molti settori della ricerca che coinvolgono gruppi multiproteici e complessa interazione di macromolecole biologiche che sono alla base dei processi cellulari in salute e malattia.
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Disclosures
IB è inventore di brevetti e domande di brevetto che dettagliano le parti della tecnologia qui descritta.
Acknowledgments
Ringraziamo Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond e tutti i membri passati e presenti del laboratorio Berger per assistenza e consulenza. La piattaforma MultiBac e il suo sviluppo sono stati e sono generosamente sostenuto da enti finanziatori tra cui il Fondo nazionale svizzero (FNS), l'Agence National de Recherche (ANR) e del Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) e la Commissione europea (CE) ai programmi quadro (PQ), 6 e 7. Il supporto per l'accesso transnazionale è fornito dai progetti 7 ° PQ CE P-CUBE ( www.p-cube.eu ) e BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Il Ministero della Scienza francese è particolarmente riconosciuto per sostenere la piattaforma MultiBac al EMBL attraverso l'Investissement d'Avenir progetto FRISBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
