I microRNA hanno un ruolo significativo nella struttura del cervello e la funzione. Qui si descrive un metodo per far rispettare miRNA ippocampale iper-espressione utilizzando l'iniezione stereotassica di lentivirus ingegnerizzati miRNA che esprimono. Questo approccio può servire come un modo relativamente rapido per valutare l' In vivo Effetti di miRNA over-espressa in regioni specifiche del cervello.
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Articolo metodologico
Iniezione stereotassica di microRNA-esprimono lentivirus al mouse Hippocampus CA1 regione e valutazione dei risultati Behavioral
In questo articolo
Sommario
Abstract
I microRNA (miRNA) sono piccoli regolatori a singolo filamento molecole di RNA lunghi circa 22 nucleotidi che possono ogni bersaglio numerosi trascritti di mRNA e dim un'intera espressione genica percorso di distruzione che induce e / o traduzione inibizione di questi obiettivi. Molti miRNA giocano un ruolo chiave nel mantenimento struttura e la funzione neuronale e nelle funzioni cerebrali di livello superiore, e si cercano metodi per manipolare i loro livelli per esplorare queste funzioni. Qui vi presentiamo un diretto metodo in vivo per esaminare le conseguenze cognitive di miRNA vigenti in eccesso nei topi tramite iniezione stereotassica di particelle virali miRNA-codifica. In particolare, l'attuale protocollo prevede l'iniezione nella regione CA1 dell'ippocampo, che contribuisce al consolidamento dei mammiferi memoria, l'apprendimento, e le risposte allo stress, e offre un comodo sito di iniezione. Le coordinate sono misurate in base al bregma mouse e perfusione virus viene digitalmente controllata e mantenuta molto lento.Dopo l'iniezione, la ferita chirurgia è sigillato e gli animali recuperare. Lentivirus codificante silenziatori dei corrispondenti obiettivi di mRNA servono a coinvolgere l'interazione miRNA / target specifico responsabile per l'effetto osservato, con topi naive, topi iniettati con soluzione salina e topi iniettati con vettori lentivirus "vuoti" come controlli. Un mese dopo l'iniezione, gli animali sono esaminati nel labirinto ad acqua di Morris (MWM) per valutare il loro apprendimento di navigazione e capacità di memoria. Il MWM è un serbatoio rotondo riempito con acqua colorata con una piccola piattaforma sommersa 1 cm sotto la superficie dell'acqua. Costanti segnali visivi di tutto il serbatoio consentono la navigazione spaziale (il suono e il campo magnetico terrestre può anche aiutare gli animali in navigazione). Monitoraggio videocamera consente la misurazione del percorso della nuotata e il tempo per trovare e ammonterà la piattaforma. Il mouse viene prima insegnato che il montaggio della piattaforma nascosta offre una via di fuga dal nuoto forzato; viene poi testato per l'utilizzo di questa fuga e fzialmente, la piattaforma viene rimosso e test sonda esaminare se il mouse si ricorda la sua posizione precedente. Prove ripetute su più giorni consecutivi evidenziano migliori prestazioni di topi testati a latenze più brevi per trovare e montare la piattaforma, e percorsi come più diretta per raggiungere la piattaforma o la sua posizione. La mancata presentazione di tale miglioramento rappresenta apprendimento e di memoria e / o ansia, che possono poi essere testati specificamente (ad esempio nel elevated plus maze). Questo approccio consente la convalida dei miRNA specifici e le trascrizioni di destinazione nel cognitivo studiato e / o dei processi legati allo stress.
Introduzione
Il ruolo di particolari microRNA nel funzionamento del sistema nervoso è stata recentemente contestata da iniezione lentiviral in diversi studi. MiRNAs sono stati trovati ad essere cruciale per il mantenimento e ri-modellare la struttura delle sinapsi 1, 2 sinaptogenesi e rimodellamento delle sinapsi e manutenzione 3. Questi studi suggeriscono fortemente che miRNAs sono impegnate, tramite effetti regolatori pluristratificato sia nella sagomatura e nel mantenere l'uscita principale del sistema nervoso, funzione cognitiva. Iniezione stereotassica di lentivirus particelle in regioni specifiche del cervello dei roditori permette la ricerca di al....
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Protocollo
1. Lentivirus Preparazione
- Crescere le cellule HEK-293FT al 90% di confluenza.
- Il giorno del cambiamento transfezione cellulare per mezzo privo di siero DMEM supplementato con 1 mM di glutammina e 50 mg / ml di penicillina-streptomicina.
- Co-trasfezione delle cellule con un vettore pLKO.1-Puro e con plasmidi codificanti per il delta R8.2 e VSV-G porzioni e il miRNA di interesse, utilizzando 10 ml di 1 mg / ml polyethylenimine come un vettore 9.
- Raccogliere lentivirus confezionati in 24 ore e 48 ore dopo la trasfezione, filtro attraverso il filtro di 0,45 micron.
- Concentrare i lentivirus con ultracentrifugaz....
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Risultati
Iniezione di 0,5 microlitri lentivirus nella regione CA1 nell'ippocampo topo, con il tasso di flusso indicato nella sezione del protocollo produce una sfera infetto di circa 1 mm nell'asse rostrale-caudale, e circa 0,5 mm in mediale-laterale e anteriore -posteriore assi (Figura 3).
Figura 1. Punto bregma e apparato di iniezione. (A) indicata .......
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Discussione
Iniezione stereotassica di lentivirus è un metodo relativamente rapido per la valutazione in vivo sia per il down-regolazione dei geni e miRNA diversi up-o. L'alternativa principale è un topo geneticamente modificato che è una tecnica consuma molto più laboriosa e poi iniezione diretta lentivirus. Inoltre, il regolamento su, a iniezione lentivirus, si verifica in un momento specifico nel topo adulto e non prevede alcuna possibilità di leakiness durante lo sviluppo, come è il caso più frequente nei topi gene.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal Edmond e Lily Safra Center for Brain Sciences (SB fellowship), The Heritage Biomedical Science Partnership Program Legacy of the Israel Science Foundation (Grant No. 378/11, per HS) e la Fondazione israeliana tedesca per Scientifica Ricerca e sviluppo (GIF) (Grant No. 1093-32.2/2010, a HS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Bilancia per roditori | Burtons (UK) | 115-455 | |
| termoforo | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimmer | machine Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Bisturi e lame | Kent scientific | ||
| Siringa Harland | Hamilton | 7632-01 | |
| perforatore | Stoelting | 51449 | |
| pompa digitale | Harvard apparato | 704507 | |
| Serbatoio dell'acqua e piattaforma | Stoelting | 60135 | |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | ||
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer salute animale | 24751 | |
| unguento idratante - Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| soluzione salina | Sigma Aldrich | D8662 | |
Riferimenti
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al.
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Ristampe e permessi
