Summary
Genetisch gecodeerd optogenetic tools kunnen niet-invasieve manipulatie van specifieke neuronen in de
Abstract
Steeds genetisch gecodeerde hulpmiddelen steeds beschikbaar waarmee non-invasieve manipulatie van de neurale activiteit van specifieke neuronen in Drosophila melanogaster 1. De belangrijkste zijn optogenetic tools, die de activering of silencing van specifieke neuronen in de intact en vrij bewegende dieren met behulp van helder licht mogelijk te maken. Channelrhodopsin (ChR2) is een door licht geactiveerde kation kanaal dat, wanneer geactiveerd door blauw licht, veroorzaakt depolarisatie van neuronen die het uit te drukken. ChR2 effectief is geweest voor het identificeren van neuronen van cruciaal belang voor specifieke gedragingen, zoals CO 2 vermijden, proboscis uitbreiding en reuze-vezels gemedieerde schrikreacties 2-4. Aangezien de sterke lichtbron gebruikt om ook stimuleren ChR2 fotoreceptoren stimuleren, zijn deze technieken optogenetic niet eerder toegepast in het visuele systeem. Hier combineren we een optogenetic aanpak met een mutatie die fototransductie schaadt de demonstrate dat activering van een cluster van loom-gevoelige neuronen in de vlieg optische kwab, Foma-1 neuronen, rijdt een vluchtgedrag gebruikt om botsing te voorkomen. We gebruikten een nul-allel van een essentieel onderdeel van de fototransductiecascade, aan fosfolipase C-β, gecodeerd door het gen norpA, dat zij de blinde vliegt en ook de Gal4-UAS transcriptionele activator systeem expressie van ChR2 rijden in de Foma-1 neuronen. Individuele vliegen worden geplaatst op een klein platform omringd door blauwe LED's. Wanneer de LEDs branden, de vliegen snel opstijgen in vlucht, op soortgelijke wijze visueel gedreven loom-vluchtgedrag. Wij geloven dat deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast aan andere gedrag onderzocht in vrij bewegende vliegen.
Introduction
Een groeiend arsenaal van genetisch gecodeerde instrumenten zijn ontwikkeld om neurale activiteit in specifieke cellen in Drosophila melanogaster 1 manipuleren. Deze tools stellen de niet-invasieve activering of silencing van specifieke neuronen in de intact en vrij bewegende dieren. Onder deze, Channelrhodopsin2 (ChR2), een door licht geactiveerde kation kanaal, biedt belangrijke voordelen, omdat het kan tijdelijk worden gecontroleerd en snel geïnduceerd. Wanneer neuronen die uitdrukkelijke ChR2 worden blootgesteld aan helder blauw (470 nm) licht dat ze snel depolariseren en vertonen verhoogde werkingsveld 3-5. Dergelijke gerichte activering van specifieke neuronen in vrij bewegende dieren is gebleken dat de toereikendheid van de bijzondere neuronen voor gedrag, zoals CO 2 vermijden 3, proboscis extensie 2,4, en Giant-vezels gemedieerde schrikreacties 4. Echter, zoals de sterke lichtbron nodig is om ChR2 stimuleren ook het stimuleren van fotoreceptoren, de toepassing optogenetic technieken om het visuele systeem is beperkt. Door combinatie van een optogenetic benadering met een mutatie die fototransductie schaadt, hebben we aangetoond dat activatie van een specifieke cluster van neuronen in de vlieg optische kwab de vluchtgedrag gebruikt om botsing te voorkomen 6 rijden.
De meeste, zo niet alle, visuele dieren vertonen een vluchtgedrag om botsingen te voorkomen met tegemoetkomend objecten. Wandelen of stationair vliegen, wanneer voorgesteld met een dreigende botsing, take-off op de vlucht, weg van de naderende botsing 7-9. Deze take-offs worden gekenmerkt door verhoogde vleugels voorafgaand aan de start-en een onstabiele vlucht traject 10,11. Dit antwoord is verschillend van de reus-vezel gemedieerde schrikreactie, sprongen die niet worden voorafgegaan door opgeheven vleugels, en meestal resulteert in een vrije val tuimelen 4,9. De identificatie van een specifiek cluster van weefgetouw gevoelige neuronen in de optische lob, Foma-1 neuronen, die uniquely afgestemd op het naderen van objecten coderen, we probeerden hun betrokkenheid bij weefgetouw van de vlieg vluchtgedrag onderzoeken. Hier laten we zien het gebruik van het selectief activeren optogenetics deze neuronen en opwekken van de vlieg vluchtgedrag.
We gebruiken de Gal4-UAS transcriptionele activator systeem om de expressie van ChR2 rijden in de Foma-1 neuronen. ChR2 vereist de cofactor all-trans-retinal en als deze is te vinden in lage concentraties in het Drosophila centrale zenuwstelsel moet worden aangevuld in het vliegen 'dieet. 3,4 als fel licht wordt gebruikt om ChR2 activeren en vliegen vertonen sterke phototactic gedrag 12, zochten we de mogelijkheid van een visuele reactie op de stimulus te elimineren. Hiervoor gebruikten we dieren die homozygoot mutant waren voor een nul-allel van het norpA gen, dat een essentieel onderdeel van de fototransductiecascade, fosfolipase C-β codeert. Fotoreceptoren in een dergelijke mutant vliegen in staat zijn om verantwoorded tot 13 licht. Om de optogenetic stimulatie van de ontsnapping respons te testen, moeten we een enkele vlieg te isoleren en te baden in helder blauw licht. Om dit te doen, plaatsen we de individuele vliegen in pipetpunten. Een pipet tip wordt geplaatst in een aangepaste houder, zodanig dat de vlieg geotactically loopt de tip en uit op een rechthoekig platform. De vlieg is in staat om vrij rond te lopen op de top van dit platform. Het platform wordt omringd door vier blauwe LED arrays, elk 3 LEDs, gericht op de bovenkant van het platform. Na de vlieg op het platform, worden de LED's branden, en de vlieg reactie wordt opgenomen met behulp van een high-speed camera 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genereer Channelrhodopsin Flies
- Cross UAS-ChR2 vliegen met de Gal4 driver van uw keuze maken wij gebruik van G105-Gal4, die wordt uitgedrukt in Foma-1 neuronen in de optische lob.
- Om de mogelijkheid van een visuele reactie op het blauwe licht stimulatie te elimineren, zowel vlieg lijnen zijn in aw + norpA achtergrond.
- Eindresultaat: w + norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Na volwassen vliegt Eclose, zet geselecteerd vrouwen aan vers voedsel, aangevuld met 10 uM all-trans-retinal (een co-factor die nodig is voor ChR2) en beschermd tegen licht, gedurende 3 dagen voor het uitvoeren van de gedrags-test.
2. Maak 10 pM All-trans-retinal Enhanced Eten
- Los 100 mg all-trans-retinal in 17,6 ml 95% ethanol om 20 mM netvlies. Houd all-trans-retinal beschermd tegen licht te allen tijde.
- Smelt standaard maïsmeel vlieg voedsel in de magnetron, en laat het afkoelen tot warm om aan te raken.
- Mix 50 pi 20 mMall-trans-retinal in flesjes van 10 ml van vlieg voedsel.
- Laat flacons afkoelen en bewaar beschermd tegen licht.
3. Uitrusting
- Pipet tips: Standaard 1.000 ul pipet tips worden gesneden in de buurt van de top, het creëren van een porie diameter van ~ 2,25 mm.
- Platform (zie figuur 1).
- Een Delrin basis, werd 17 cm X 25 cm, uitgevoerd met schroefgaten op elke hoek naar ¼ "NPT koelvloeistofslang connectoren passen.
- Een verticale houder, gemaakt van Delrin, is bevestigd aan het midden van de basis. De afmetingen zijn 25 mm X 40 mm X 65 mm (breedte x diepte x hoogte). Een 10 mm brede groef loopt de lengte van de houder, met een vleugelmoer aan de onderkant. Een platform is aan de bovenzijde van de houder 25 mm X 40 mm X 10 mm met een 3,5 mm diameter gat uitgelijnd met de groef in de houder.
- LED arrays (zie figuur 1).
- Vier armen van de koelvloeistof slang, ~ 18 cm lang, zijn aangebracht op het platform base het gebruik van de koelvloeistof slang connector. Koelvloeistofslang wordt alleen gebruikt als structurele ondersteuning en wordt niet gebruikt voor koeling.
- Goed geplaatste groeven gesneden in het laatste stukje van de koelvloeistof schoonspuiten van elke arm aan te brengen een koellichaam aan het einde van elke arm.
- Een blauwe LED Rebel Tri-Stars is gemonteerd aan elk koellichaam met behulp van pre-cut thermische plakband. Een Carclo 18 ° Tri-lens is aangebracht op elke Tri-Star.
- LED Tri-Stars zijn aangesloten op de BuckPuck DC drivers en een voeding zoals gespecificeerd. We hebben geregeld onze set-up met elke BuckPuck voeden twee Tri-Stars in serie.
- Verlichting van alle vier de Tri-Stars LED bij 700 mA leverde een instraling van 713 W / m 2 op ons platform.
- Camera: De camera is gemonteerd op een statief en gericht op de bovenkant van het platform.
4. Behavioral Assay
- Kort verdoven vliegen op ijs.
- Plaats individuele vliegen in pipetpunten, met behulp van tape te sluitenBeide uiteinden van de tip.
- Na de vliegen hebben gewekt en actief verkennen van de pipet tip, verwijdert u de tape en plaats een pipet in de groef in verticale houder. De schroef wordt gebruikt om de pipet te vergrendelen en de onderkant van de tip sluiten.
- Als de vlieg verkent de pipet tip (meestal 30 - 60 sec), start de camera de opname net voor de vlieg blijkt uit de punt op het platform.
- Na de vlieg is ontstaan op het platform, Wacht 1-2 seco, en zet de blauwe LED's. Gebruik een timer om handmatig meten van de tijd totdat de vlieg initieert vlucht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blind vliegt die ofwel ChR2 of de G105 driver alleen laten een laag percentage van de start na hun verlichting met helder blauw licht. Blind vliegt vertoonde hetzelfde percentage van de start, ongeacht de verlichting (Figuur 2), wat suggereert dat deze take-offs spontane waren in plaats van als gevolg van de belichting met blauw licht. Wanneer de ChR2 wordt uitgedrukt in de Foma1 neuronen echter belichting met blauw licht roept de escape response. Meer dan 50% van de geteste vliegen nam binnen 1 sec van verlichting, en 75% binnen 5 sec (figuur 2). Daarentegen, slechts 10% van de controle vliegen nam binnen 1 sec, en 20% binnen 5 sec. De G105 driver zich zowel in Foma-1 neuronen en in de γ-kwab van de paddestoel lichaam we een driver specifiek uitgedrukt in dit deel van de paddestoel lichaam (201Y-Gal4) als extra controle. Deze vliegen vertoonden een percentage van de start vergelijkbaar met de uitgevoerde andere regelaars (figuur 2), Waarin zij met name dat de optogenetic activering van Foma-1 neuronen de ontsnapping respons die wordt opgewekt.
Hoge snelheid beeldvorming genomen op 200 frames per seconde van de optogenetically geïnduceerde responsen bleek dat deze responsen waren vergelijkbaar met het weefgetouw-opgeroepen vluchtgedrag (figuur 3). Namelijk, gefilmd 90% van de vliegen hieven hun vleugels voorafgaand aan de start (n = 30) 6. Verder de daaropvolgende vluchtbaan was minder stabiel dan vrijwillige starts 10, met de vlieg lichaam zijn in een enigszins verticale oriëntatie (figuur 3), maar stabieler dan giant fiber gemedieerde responsen 9.
Figuur 1. Experimentele opstelling met het platform met de verticale houder en de vier koelvloeistof schoonspuiten armen die koellichamen met LED-arrays speelgoed aangebracht. EenDe set-up omgevingsverlichting. B, de opstelling als de lampje branden. C, een close-up bekijken van een Tri-Star LED op het koellichaam. D, een close-up van de Tri-Star met de tri-lens bevestigd. E, een schema van het Buckpuck Driver en LED circuit. F, schakelschema voor BuckPuck en LED circuit.
Figuur 2. Cumulatieve histogram van de tijd van ontsnapping sprong voor experimentele en controle vlieg lijnen. Alle vliegen express w + norpA voorkomen dat ze visueel blind. "Foma-1" vliegen de G105-Gal4 bestuurder; "MB" vliegen hebben de 201Y-Gal4 driver die uitdrukking rijdt in de paddestoel lichaam.
Figuur 3. Hoge snelheid videoframes van ChR2 geïnduceerde ontsnapping reacties. Frames zijn genummerd sequentially met 5 msec tussen frames.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben aangetoond optogenetic stimulatie van ontsnapping gedrag door te baden vrij wandelen vliegen in helder blauw licht. Deze benadering kan eenvoudig worden aangepast aan andere gedrag onderzocht vrijlopende vliegen en kan worden geschaald naar grotere platforms door eenvoudig betegelen de LED-reeksen we over een groter gebied. Met behulp van de goedkope camera beschrijven we, of andere beschikbare camera systemen, kan de gebruiker op maat van de frame rate en de ruimtelijke resolutie van de beelden die op het gedrag van belang aan te passen. Bovendien is onze imaging beperkt tot de tijd na de LED branden, de blauwe LED's de verlichting van de camera en de activering van ChR2. Dit is voldoende voor ons gedrag, maar als de positie of beweging van de vlieg vóór LED verlichting moet worden opgenomen, kunnen extra lichtbronnen die signalen in het infrarood, gecombineerd met passende filtering van de camera worden opgenomen.
_content "> Optogenetics is op grote schaal geprezen als een niet-invasieve manier om neurale activiteit te manipuleren. Toch heeft deze techniek grotendeels niet beschikbaar voor het visuele systeem als het licht wordt gebruikt om ChR2 te activeren zal ook activeren visuele zenuwbanen. Daarnaast is het gebruik van optogenetics om niet-visuele gedrag sonde kan ook worden belemmerd door de vliegen 'phototactic reacties op felle lichten. Het gebruik van norpA vliegen die visueel blind kunnen we optogenetic tools te gebruiken in het visuele systeem, en voorkomt phototaxis uit verduistert andere gedragingen.Dit protocol vereist dat ChR2 uitgedrukt in de neuronen van keuze, dat de vliegen worden gevoed all-trans-retinal, en dat de vliegen worden gebaad in helder blauw licht. Het protocol heeft voldaan ontwikkelden we deze eisen nog niet volledig geoptimaliseerd. Zo vinden wij de hoeveelheid licht die we gebruiken kan helderder dan nodig is en dat een hogere concentratie van all-trans-retinal, of langer voeden timij, zou kunnen leiden tot een hoger percentage van de start. We hebben niet systematisch onderzocht deze parameters.
De Foma-1 neuronen activeren we zijn in de lobula complex van de vlieg, en dus dicht bij het achteroppervlak van de hersenen ligt. Het is mogelijk dat het succes van dit experiment is gebaseerd op de neuronen dicht bij het oppervlak, als het licht moet dringen door cuticula van de vlieg om ChR2 activeren. Aldus kunnen cellen dieper gelegen in de hersenen niet succesvol geactiveerd met deze methode.
De G105 driver wordt uitgedrukt in een cluster van 5 neuronen aan elke zijde van de optische kwab, de Foma-1 neuronen, alsmede in neuronen in de γ-kwab van de paddestoel lichaam. Gelukkig hadden we een chauffeur de controle-experimenten doen om een rol van de paddestoel lichaam neuronen in de vluchtgedrag te elimineren. Echter, of de activering van alle 10 Foma-1 neuronen voor deze gedrag of dat er slechts een of tweespecifieke cellen voldoende zijn, kan worden bepaald op dit moment. Naarmate er meer specifieke drivers worden ontwikkeld, en intersectionele strategieën ter beperking van expressie worden verfijnd 1,14, verwachten wij te kunnen neuronen met een grotere specificiteit richten.
Cryptochromen zijn fotoreceptoren die betrokken zijn bij circadiane ritmes en gedragingen die gevoelig zijn voor blauw licht. In dit protocol worden cryptochromen waarschijnlijk geactiveerd door het blauwe licht wordt gebruikt om ChR2 te stimuleren. Dit lijkt niet de take-off gedrag waargenomen hier invloed op, zoals het lage take-off waargenomen in de controle vliegen (waarvoor het blauwe licht activeert de cryptochromen maar niet ChR2 in Foma-1 neuronen) nauw overeenkomt met de snelheid van de te nemen -off waargenomen in de controle vliegt zonder verlichting of wanneer verlicht met groen licht (die niet cryptochromen activeren). Voor andere gedragingen die meer direct beïnvloed door cryptochromen, kan dit problematisch zijn. Een potentiëleverbetering dit te voorkomen zou het gebruik van een roodverschoven channelrhodopsin dat wordt geactiveerd door geel, 589 nm, licht 15 zijn.
In onze experimenten, zagen we een laag niveau van spontane starts zodanig dat ~ 10% van de controle vliegen nam binnen 1 sec van LED-verlichting, en 13 tot 28% binnen 5 sec. Zoals we gezien deze zelfde percentage van de start toen de vliegen werden verlicht met groen licht die niet effectief ChR2, evenals vliegen activeren zonder verlichting, zijn wij van mening dat het hier om spontane vluchten in plaats van licht geïnduceerde take-offs. Het effect van ChR2 activering van Foma-1 neuronen op vluchtgedrag moet dus worden gemeten op de top van deze spontane activiteit. Voor andere gedragingen die niet te maken hebben met take-off, maar kan dit leiden tot beëindiging van onderzoeken of vliegen ontsnappen aan het platform voor de uitvoering van de geteste gedrag. De mate waarin deze spontane ontsnapt vormen een experimentele ongemak is Obviously afhankelijk tijdschaal van het gedrag van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een Stanford Dean's Fellowship (SEJdV), een National Institutes of Health Pioneer Director's Award (TRC DP0035350), een McKnight Foundation Scholar Award (TRC) en R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 | |
References
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O'Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
