Metabole Labeling van Nieuw Transcribed RNA voor hoge resolutie genexpressieprofilering van RNA synthese, verwerking en Decay in Cell Culture

Samenvatting

Totaal cellulair RNA verschaft een slechte template voor het bestuderen korte termijn veranderingen in RNA synthese en verval en de kinetiek van RNA processing. We beschrijven hier metabolisch merken van nieuw getranscribeerde RNA met 4-thiouridine gevolgd door thiol-specifieke biotinylering en zuivering van nieuw getranscribeerde RNA waardoor deze beperkingen te overwinnen.

Samenvatting

De ontwikkeling van de hele-transcriptome microarrays en next-generation sequencing heeft een revolutie ons begrip van de complexiteit van de cellulaire genexpressie. Naast een beter begrip van de moleculaire mechanismen betrokken zijn nauwkeurige metingen van de onderliggende kinetiek steeds belangrijker geworden. Hier, deze krachtige methodieken staan ​​voor grote beperkingen als gevolg van intrinsieke eigenschappen van de sjabloon monsters ze studeren, dwz totaal cellulair RNA. In veel gevallen optreden veranderingen in totaal cellulair RNA ofwel te langzaam of te snel om de onderliggende moleculaire gebeurtenissen en hun kinetiek vertegenwoordigen voldoende resolutie. Daarnaast wordt de bijdrage van veranderingen in RNA synthese, verwerking en verval niet gemakkelijk onderscheiden.

We hebben onlangs ontwikkelde hoge-resolutie genexpressieprofilering om deze beperkingen te overwinnen. Er wordt gebruik gemaakt van metabolisch merken van nieuw getranscribeerde RNA met 4-thiouridine (dus ook wel 4SU-tagging) gevolgd door strenge zuivering van nieuw RNA getranscribeerd met thiol-specifieke biotinylering en streptavidine beklede magnetische korrels. Het is toepasbaar op een breed scala aan organismen, waaronder gewervelden, Drosophila en gist. Wij hebben met succes 4SU-tagging toegepast om te studeren real-time kinetiek van transcriptiefactor activiteiten, nauwkeurige metingen van RNA halfwaardetijden, en het verkrijgen van nieuwe inzichten in de kinetiek van RNA processing. Tenslotte kunnen computermodellen worden gebruikt om een ​​geïntegreerde, alomvattende analyse van de onderliggende moleculaire mechanismen te genereren.

Inleiding

Genexpressie is een belangrijk instrument dat wordt gebruikt om cellulaire processen en de bijbehorende complexe interactie netwerk bestuderen. Studies over mRNA overvloed hebben meestal al de methode van keuze voor fundamentele inzichten te krijgen in de onderliggende moleculaire mechanismen. De ontwikkeling van de hele-transcriptome microarrays ¹ en, meer recentelijk, next-generation sequencing van RNA (RNA-seq) ^2-4 aangewakkerd deze aanpak. Hoewel deze technologieën ons begrip van de complexiteit van de cellulaire genexpressie hebben een revolutie, waarmee zij worden geconfronteerd grote beperkingen als gevolg van de intrinsieke eigenschappen....

Protocol

1. Metabole Labeling met 4-thiouridine

Maak een gedetailleerd plan van de experimentele opstelling / schema, bijv. bij de 4SU toevoegen aan celkweek en wanneer de monsters te oogsten. Plan ten minste 5 minuten tussen elke conditie. Slechts behandelen cellen van een voorwaarde tegelijk. Handvat max. 3 - 5 gerechten op een gegeven moment. Behandel cellen zo snel mogelijk veranderingen in temperatuur en _CO2 te minimaliseren. Vermijd blootstelling van de cellen aan fel licht na 4SU wordt toegevoegd, omdat dit kan leiden tot verknoping van 4SU-gelabelde RNA aan cellulaire eiwitten.

Start van etikette....

Resultaten

1. Uitgangsmateriaal en verwachte rendementen

Na 1 uur (hr) van 4SU-exposure nieuw getranscribeerde RNA vertegenwoordigt ongeveer 1-4% van de totale cellulaire RNA. Dit zal lager zijn in de groei-gearresteerd cellen als ze niet langer RNA te synthetiseren om rekening te houden voor de celgroei / replicatie. Bij etikettering voor 1 uur, raden wij het starten van de test met 60 - 80 ug totaal RNA. Beginnend met minder dan 30 ug totaal RNA resulteert in kleine RNA pellets die moeilijk te zien na d.......

Discussie

Metabole etikettering van nieuw getranscribeerde RNA aanzienlijk versterkt de kracht van high-throughput technologieën zoals microarrays en RNA-seq door meer geschikte templates om de biologische vraag van belang aan te pakken. Het huidige protocol werd na optimalisatie. Het maakt> 1000-voudige verrijking van nieuw getranscribeerde RNA en biedt zeer reproduceerbare resultaten.

Het experimentele ontwerp van een 4SU-tagging experiment is van cruciaal belang als nieuw getranscribeerde RNA za.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4-thiouridine	Carbosynth	T4509	Bereid een 50 mM stockoplossing in steriel H2O, bewaar bij -20 °C in aliquots van 50-500 μl, gooi ongebruikt reagens weg, bevries niet opnieuw.
Trizol	Invitrogen	15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)	WAARSCHUWING - CORROSIEF en GEVAARLIJK VOOR DE GEZONDHEID! Zorg voor onmiddellijke toegang tot Fenool antidotum (PEG-Methanol); Bewaar bij 4 °C.
Chloroform	Sigma	372978	WAARSCHUWING - GEVAARLIJK VOOR DE GEZONDHEID
Isopropanol	Sigma	650447
Natriumcitraat, nuclease-vrij	Sigma	C8532	Bereid 1,6 M stockoplossing met nuclease-vrij water.
5M nuclease-vrij NaCl	Sigma	71386	Stockoplossing
Nuclease-vrij H2O	Sigma	W4502	Maak 1 ml aliquots in nuclease-vrije buisjes.
RNA precipitatiebuffer			1,2 M NaCl, 0,8 M natriumcitraat in nuclease-vrij water. Bereid van tevoren onder strikt nuclease-vrije omstandigheden. Bewaar bij kamertemperatuur in 50 ml falconbuisjes.
Ethanol	Sigma	459844	Gebruik met nuclease-vrij water om 80% ethanol te bereiden, bewaar bij -20 °C.
1 M nuclease-vrij Tris Cl, pH 7,5	Lonza	51237	Stockoplossing
500 mM nuclease-vrij EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575-020	Stockoplossing
10x Biotinyleringsbuffer (BB)			100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA in nuclease-vrij water, maak 1 ml aliquots.
Dimethylformamide (DMF)	Sigma	D4551
EZ-Link biotin-HPDP	Pierce	21341	Bereid een 1 mg/ml stockoplossing door 50 mg biotin-HPDP op te lossen in 50 ml DMF. Zacht verwarmen bevordert solubilisatie. Bewaar bij 4 °C in 1 ml aliquots.
Phase Lock Gel Heavy tubes 2,0 ml	Eppendorf	0032 005.152	Optioneel voor de chloroform extractiestap.
Zeta membraan	BIORAD	162-0153
10x Dot blot bindingbuffer			100 mM NaOH, 10 mM EDTA
Biotin-oligo			5'-biotine, 25 nucleotiden, willekeurige sequentie
Natriumdodecylsulfaat	Fisher	BPE9738	Voor 100 ml 20% stockoplossing, voeg 20 g SDS toe aan 80 ml PBS pH 7-8 en pas volume aan tot 100 ml. Houd alle hoge percentage SDS oplossingen boven de 20 °C. Verwarm de oplossingen lichtjes als SDS precipiteert.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin	Pierce	21333	Bereid een 1 mg/ml stockoplossing door 50 mg iodoacetyl-biotin op te lossen in 50 ml DMF. Zacht verwarmen bevordert solubilisatie. Bewaar bij 4 °C in 1 ml aliquots. Genereert onomkeerbare, thiool-specifieke biotinylering.
Fosfaatbuffer saline	Gibco	10010-015
Dot blot blokkeringsbuffer			Meng 20 ml 20% SDS met 20 ml 1 x PBS pH 7-8 en voeg EDTA toe tot de eindconcentratie van 1 mM.
Streptavidine-paardenradijs peroxidase	Vector Laboratories	SA5004	Bewaar bij -20 °C. Meng 10 ml 20% SDS met 10 ml 1 x PBS. Voeg 20 μl Streptavidin-HRP toe voor gebruik.
ECL reagens	GE Healthcare	RNP2109	Gebruik volgens de instructies van de fabrikant.
Super RX, X-RA Film, 18x24 cm	Fujifilm	47410 19236
μMacs Streptavidin Kit	Miltenyi	130-074-101	Bewaar de kralen bij 4 °C.
Tween 20	Sigma	P1379
Wasbuffer			100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 in nuclease-vrij H2O.
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	43817	Bereid als 100 mM DTT in nuclease-vrij H2O, bereid altijd vers voor gebruik.
RNeasy MinElute Kit	Qiagen	74204	Bewaar kolommen bij 4 °C, resterende componenten van de kit bij kamertemperatuur.
1,5 ml schroefstoppolypropyleenbuisjes	Sarstedt	72.692.005	Compatibel met Dimethylformamide
2,0 ml schroefstoppolypropyleenbuisjes	Sarstedt	72.694.005	Compatibel met Dimethylformamide
15 ml buisjes	BD Falcon	352096	Compatibel met Dimethylformamide
50 ml buisjes	BD Falcon	352070	Compatibel met Dimethylformamide
Alle oplossingen/reagens moeten bij kamertemperatuur worden bewaard, tenzij anders gespecificeerd.
Apparatuur
UV/VIS spectrofotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 1000	Of equivalent. Gebruik laag volume (1-2 μl) voor metingen van lage RNA concentraties om overmatige monsterverlies te voorkomen.
Polypropyleen 15 ml centrifugebuisjes	VWR International	525-0153	In tegenstelling tot standaard 15 ml buisjes, tolereren deze tot 15.000 × g
Hogesnel