Summary
Cerebral perfusjon overvåking har vist seg å forbedre nøyaktigheten i iskemiske hjerneslag modeller. Tekniske problemer ofte begrense bruken av denne viktig verktøy for cerebrovaskulær forskning. I denne videoen blir et optimalisert system som er vist for å oppnå en enkelt-eller multi-site hemodynamiske overvåking under intraluminal midtre cerebralarterie okklusjon hos rotter.
Abstract
Den translasjonelle potensialet prekliniske hjerneslag forskning avhenger av nøyaktigheten av eksperimentell modellering. Cerebral perfusjon overvåking i dyremodeller av akutt hjerneinfarkt tillater å bekrefte vellykket arteriell okklusjon og inkluderer subaraknoid blødning. Cerebral perfusjon overvåking kan også brukes til å studere intrakranial sikkerhet sirkulasjon, som fremstår som en kraftfull determinant av hjerneslag utfall og en mulig terapeutisk mål. Til tross for en anerkjent rolle Laser Doppler perfusjon overvåking som en del av de gjeldende retningslinjer for eksperimentell cerebral iskemi, en rekke tekniske problemer eksisterer den grensen utstrakt bruk. En av de store spørsmålene er å skaffe en sikker og langvarig feste av en dyp-penetrasjon Laser sonden til dyret skallen. I denne videoen viser vi vår nettside optimalisert system for cerebral perfusjon overvåking under forbigående midten cerebral arterie okklusjon av intraluminal filament i rotte. Vi utviklet jegn-huset en enkel metode for å få en skreddersydde holder for twin-fiber (dyp-penetrasjon) Laser Doppler sonder, som tillater multi-site overvåking hvis nødvendig. En kontinuerlig og langvarig overvåking av cerebral perfusjon kan lett bli oppnådd over den intakte skallen.
Introduction
Translasjonsforskning på hemodynamiske faktorer som påvirker slag patofysiologi og behandling må iverksettes, ettersom dette viktige spørsmålet blir ofte paradoksalt neglisjert av grunnleggende forskningsstudier en.
Cerebral perfusjon overvåking er en viktig, men lite brukt, verktøy for nøyaktig hjerneinfarkt modellering 2. Bortsett fra bekreftelse av arteriell fartøy okklusjon og utelukkelse av subaraknoidalblødning 3, kan kontinuerlig cerebral perfusjon overvåking gir nyttige data om graden og konsistensen av perfusjon underskudd, funksjonell status av intrakranielle sikkerhet skip og hemodynamiske effekten av nye terapeutiske tilnærminger.
En fersk studie fra vår gruppe indikerer at multi-site hemodynamiske overvåking kan brukes til å vurdere intrakraniell sikkerhetsstillelse sirkulasjon og kan forutsi infarktstørrelsen og funksjonell underskudd 4. Disse eksperimentelle funnene er consistent med kliniske studier som viste at den funksjonelle ytelsen cerebral sikkerhetsstillelse sirkulasjon er logisk av kliniske utfall i iskemisk slagpasienter 5, 6. Av denne grunn, har cerebral collaterals blitt anbefalt som et potensielt legemiddelselskap mål i den akutte fasen av hjerneinfarkt 7.
Laser-Doppler (LD) instrumentene er det vanligste verktøyet brukes til å måle cerebral perfusjon i eksperimentell hjerneinfarkt og bruken er anbefalt av siste retningslinjer på dette temaet 8. LD instrumentene måler mikrovaskulær perfusjon i en liten kortikale volum, dybden av det innspilte signal er avhengig av bredden på fiber separasjon, med twin fiber LD sonder slik at en dypere penetrasjon sammenlignet med enkelt fiber LD sonder 9. Blodstrøm verdiene uttrykkes som vilkårlige perfusjon enheter (PU) som indikerer relativ snarere enn absolutt cerebral blodstrøm. Kalibrering av PU er vanligvis utføres using motilitet, i henhold til produsentens instruksjoner. LD flowmetry tillater en kontinuerlig dynamisk overvåking og generering av kvantitative data innenfor den samme økten.
Blant de tekniske problemer som i dag begrenser bruken av LD, er et stort problem å få en sikker og langvarig festing av en dyp-penetrasjon Laser sonden til dyret skallen. Dette er avgjørende for langvarig overvåking og hvis flere sonder brukes til ulike cerebrale arterielle territorier, som vi utfører i vårt laboratorium.
I særdeleshet er forlenget kirurgisk tid nødvendig dersom prober er festet til skallen ved bruk av Burr hull eller kraniale skruer, mens dårlig signal og usikkert vedlegg oppstår hvis enkelt fiber (lav-penetrasjon) LD prober festet til skallen ved enkel kirurgisk lim. Twin fiber (dyp-penetrasjon) LD sonder gi en høyere og jevnere signal, men de er større enn enkelt fiber prober og kan ikke være påret til skallen med kirurgisk lim bare.
I denne videoen viser vi vår nettside optimalisert system for cerebral perfusjon overvåking under forbigående midten cerebral arterie okklusjon av intraluminal filament i rotte. Vi beskriver en enkel metode for å oppnå en effektiv, skreddersydde, lavpris holder enkelt-eller multippel twin-fiber (dyp-penetrasjon) LD prober, som skal brukes for langvarig overvåking av cerebral perfusjon over intakt skallen.
Den kirurgiske prosedyre for forbigående MCAO i rotte kunne ses i video-artikkel av Uluc og kolleger 10 og er ikke vist i denne videoen.
Protocol
1. Hvordan lage Probe Holder (Single nettstedet eller Multi-site)
- Materialer som kreves er naturgummi, små plastrør og et metall stylet. Sonden holderen kan tilpasses til størrelsen av dyret, antallet og størrelsen av laser Doppler probene, og den cerebrale vaskulære territorium som må overvåkes.
- Skjær naturgummi av den nødvendige størrelse (ca 10 mm x 10 mm for en 300 g rotte).
- Marker posisjonene til sonden (e) og bregma på naturgummi, i henhold til de ønskede stereotaksiske koordinater, for middels cerebral arterieokklusjon, blir den typiske koordinatene til iskemisk kjerne kl bregma -1 mm, 5 mm lateralt for midtlinjen, for en perifer iskemisk borderzone territorium, kan de forventede koordinatene være bregma 2 mm, 2 mm lateralt for midtlinjen.
- Marker svært tydelig posisjonen til bregma med en X, er dette landemerke for feste sonden holderen til skallen. </ Li>
- Sett stylet i en liten plastrør (størrelsen må samsvare med størrelsen på sonden).
- Sett stylet i naturlig gummi på det punktet der sonden må posisjonert; skyv stylet inn gummi inntil plastrøret har blitt satt inn i gummi for.
- Trekk stylet.
- Hvis flere sonder er nødvendig, gjenta trinn 01.05 til 01.07 for andre probe stillinger.
- Valgfritt for flere sonder: vikle en tape rundt plastrør for å sikre en bedre stabilisering av sonder.
- Valgfritt: utføre kjemisk sterilisering av flere probe holdere for fremtidig bruk.
2. Presurgical Forberedelse
- MCAO firetaktsmotor utføres vanligvis som en overlevelse kirurgi. I dette tilfellet, som vist i filmen (overlevelsestid 24 hr etter kirurgi), bruker kirurgen en aseptisk teknikk med steriliserte instrumenter og utstyr.
- Anesthetize rat med isofluran (3% inductioN fase 1,5% vedlikehold).
- Plasser rotte i liggende stilling på operasjonsbordet.
- Forsiktig barbere hodet av rotte.
- Påfør en antiseptisk løsning til en kompress og desinfisere huden.
- Administrer Lidokain 2% 5 mg / kg subkutant i den kraniale området.
3. Probe Posisjonering og Sikring Over Intakt Skull
- Ta av til høyre paramedian hud innsnitt (for høyre MCAO) og dissekere underhud å nå cranial fascia (Galea aponeurotica).
- Foreta en rett paramedian innsnitt i kraniale fascia og utføre sløv disseksjon å nå skalleben; forberede en skalleben område som er stort nok for anvendelsen av sonden holderen.
- Vennligst merk: ikke behov for boring eller bein tynning.
- Påfør Merbromin løsning for å desinfisere og tørke skallen overflaten.
- Bruk en hårføner (satt for kald luft) for å akselerere tørking skallen overflaten. På dette punktet, den kraniale suturer og bregma er klart synlig.
- Tilpass sonden holder ved å kutte kantene med steril saks.
- Påfør en liten mengde av kirurgisk lim (Cyanoakrylat, veterinær-godkjent) til overflaten under sonden holder, nøye unngå mindreverdig åpningen av plastrør (Merk: Hvis en betydelig mengde lim forblir mellom den optiske overflaten av sonden og skallen, kan dette gi en lav-signal og kan skade sonden etter flere bruksområder).
- Påfør sonde holder til skallen overflaten, nøye samsvarer med bregma med X landemerke. Påfør lett trykk over sonden holderen.
- Bruk en hårføner (satt for kald luft) for å akselerere tørking kirurgisk lim.
- Fest sonden holderen ved å binde en kirurgisk tråd rundt sonden holder og hodet av dyret, være forsiktig med å plassere den kirurgiske tråden over mandibula, unngå submandibular regionen og the halsen.
- Valgfritt: fyll plastrøret (e) av sonden holder med en optisk gel (f.eks en felles ultralyd eller elektrokardiografi gel), og dette vil øke kvaliteten på LD signalet.
- Plasser sonden (r) i sonden holderen og å kontrollere den faktiske avlesningen av LD strømningsmåleren. Bruk LD strømningsmåleren i henhold til produsentens instruksjoner.
- Fest sonden (e) binde dem rundt hodet på dyret, være forsiktig med å plassere den kirurgiske tråden over mandibula, unngå submandibular regionen og nakke.
4. Cerebral perfusjon Overvåking Under MCAO
- Plasser rotte i ryggleie, nøye unngå tractional krefter på sonden (e) eller probe holderen.
- Starte cerebral perfusjon overvåking under MCAO.
5. Fjerning av probe (r) og Probe Holder
- Skjær suturene rundt proben (e), sonden holderen og hodet av dyret.
- Forsiktig sløv dissekere kraniale bløtvev og huden rundt naturgummi base av sonden holderen.
- Fjern sonden holderen.
- Påfør en antiseptisk oppløsning til skallen overflaten.
- Suture skallen huden.
6. Postoperativ pleie
- Administrer 2,5 ml saltvannsløsning subkutant å forhindre dehydrering og holde dyret varm ved hjelp av en varmepute etter seponering gassformig anestesi.
- For å overleve kirurgi: gi preemptive analgesi med Ketoprofen 4 mg / kg subkutant og gjenta den samme dose på 12 timers postoperativt
- Under våre eksperimentelle forhold, ble dødshjelp utført ved 24-timers post-kirurgi ved CO 2 innånding.
Representative Results
Forbigående MCAO (60 min) ble indusert ved å sette inn en silikon-belagt filament i den eksterne karotidarterien. Filament ble deretter presset gjennom terminalen enden av den interne carotisar opp til opprinnelsen av MCA, under LD overvåking. Arteria carotis communis og pterygopalatin arterie ble midlertidig okkluderes under kirurgisk innsetting av filamentet. En skjematisk fremstilling av den kirurgiske prosedyren er vist i figur 1A.
Cranial koordinater for å posisjonere de to LD prober ble valgt i henhold til den underliggende arteriell territorium. Foreløpige forsøk med gelatin-blekk perfusjon (figur 1B), viste at den ischemiske kjernen ventes i det sentrale MCA territorium (bregma -1 mm, 5 mm fra midtlinjen; Probe 1), mens pantet flyten ventes i borderzone territorium mellom kortikale grener av midtre og fremre cerebrale arterier (bregma 2 mm, 2 mm fra midtlinjen; Probe 2).
Cerebrale hemodynamikk ble studert ved hjelp av multi-reiser Laser Doppler sonder under hele perioden av den kirurgiske prosedyren, dvs. før, under og etter MCAO (figur 2). Cerebral perfusjon underskudd i løpet av MCAO var mindre og viste en høyere grad av variasjon i Probe 2 sammenlignet med Probe 1, tyder inter-individuelle forskjeller i funksjonelt ytelsen intrakranielle collaterals henhold iskemiske tilstander. Den multi-site Laser Doppler overvåking kan også studere cerebral hemodynamiske endringer i løpet av okklusjon av proksimale ekstra kraniale cerebrale arterier (felles carotisar, interne carotisar, pterygopalatin arterie).
Strek utfall ble vurdert 24 timer etter reperfusjon av infarktvolum, beregnet på 19 påfølgende seksjoner farget med Cresyl fiolett (figur 3), og Garcia funksjonell neuroscore 11. Immunhistokjemi for spesifikke markører assodering iskemisk hjerneskade ble utført, for å oppnå et topografisk fordeling av neuronal tap (microtubule forbundet 2 protein, MAP2) og iskemisk penumbra (heat shock protein-70, hsp70) i forhold til multi-site hemodynamiske overvåking av intrakranielt sirkulasjon (figur 4).
Figur 1. Cerebral perfusjon overvåking under intraluminal MCAO i rotte. A. Skjematisk fremstilling av den kirurgiske prosedyren for forbigående MCAO. En silikon-belagt filament ble brukt til occlude opprinnelsen av MCA, etter å ha blitt innført i den ytre halspulsåre og presset gjennom den interne karotidarterien. Proksimale livmorhalsen arterier ble enten ligert (ekstern carotisar) eller forbigående okkludert (pterygopalatin arterie og felles carotisar) under prosedure. B. En representant hjernen vises etter gelatin-ink farging. Transcardiac perfusjon av gelatin-Blekkoppløsningen ble utført 60 min etter starten av iskemi, uten reperfusjon. Den normalt perfused hjernen ble farget av gelatin-blekk og fremsto som grå-farget med svarte flekker fartøy, mens iskemisk (ikke-perfusjon) området forble unstained (rosa-farget). Kraniale koordinater for å posisjonere de to LD probene er vist. Probe 1 = -1 mm fra bregma, 5 mm fra midtlinjen; Probe 2 = 2 mm fra bregma, 2 mm fra midtlinjen.
Figur 2. Cerebral hemodynamiske opptak ved hjelp av multi-site Laser Doppler sonder. En typisk hemodynamiske mønster som tyder funksjonelt aktive intrakraniale collaterals henhold iskemiske tilstander vises. I dette dyret, viste LD tracings en litenER perfusjon underskudd i Probe 2 kanal mot Probe 1 kanal, under både CCA okklusjon og MCA okklusjon. MCA-O = middels cerebral arterieokklusjon. CCA-O = felles carotisar okklusjon. PU = perfusjon enheter.
Figur 3. Representative hjernen seksjoner for beregning av infarktvolum Histologiske koronale seksjoner (50 um, n = 19 med 250 um intervall; bregma +2,5 mm til -3,0 mm). Er fiksert i 4% paraformaldehyd og farget med Cresyl fiolett 0,1%. Infarktvolum er beregnet ved hjelp ImageJ bildebehandling, korrigert for inter-hemisfærisk asymmetrier grunn cerebral ødem, og uttrykkes i mm 3. Klikk her for å se større figur
Figur 4. Farging av molekylære markører for neuronal tap og penumbra Representative påfølgende hjernen som skal vises, som var farget med Cresyl fiolett 0,1% (A) eller immunostained med markører for neuronal tap (microtubule forbundet 2 protein, MAP2, B). Og iskemisk penumbra (varme sjokk protein-70, hsp70, C).
Discussion
Vi utviklet in-house en enkel og rimelig system for en sikker festing av en eller flere twin-fiber (dyp penetrasjon) LD sonder til intakt skallen av rotter under MCAO prosedyren. Riktignok tilsynelatende et trivielt problem, få en pålitelig feste av LD sonde til skallen er faktisk et stort problem i denne eksperimentelle omgivelser, siden det er en forutsetning for en jevn signal deteksjon og en vellykket overvåking av cerebral perfusjon.
Invasive prosedyrer, for eksempel graden hull og bein skruer, vanligvis forlenge kirurgisk tid og innføre mer eksperimentelle variabler knyttet til kraniotomi, og dette kan motvirke forskere og avstå dem fra å bruke LD overvåking. På den annen side, gir bruken av enkelt fiber (lav penetrasjon) prober, som er tynnere og relativt lettere å limes direkte til skallen overflaten, lav kvalitet signal og kan ikke brukes pålitelig med voksne rotter uten å bore eller tynning skallen.
Vi brukte enkle og rimelige materialer, slik som naturgummi, plastrør og en metall stylet. En skreddersydd probe holderen kan fremstilles i noen få minutter og tilpasset de eksperimentelle betingelser. Disse probe holdere kan romme én eller flere dype penetrasjon LD sonder, for klassisk enkelt nettsted overvåking på iskemisk kjernen eller for flere site overvåking i ulike arterielle territorier i samme halvkule eller over de to halvkuler. Mange probe holdere kunne produseres, kjemisk sterilisert, og lagret for fremtidig bruk. Veterinær-godkjent kirurgisk lim (cyanoacrilate), akselereres av kald luft, blir brukt til å feste proben holderen til intakt overflate av rotte skallen, ifølge de ønskede kraniale koordinater. Endelig, Proben er oppsettet ytterligere sikret på plass av felles suturer.
Den totale tiden for denne LD probe satt opp, etter å mestre denne teknikken, er ca 10 min.
Som vist in denne videoen vi rutinemessig cerebral perfusjon i det sentrale MCA territorium (LD sonde 1: iskemisk kjerne) og i den perifere MCA territorium (LD probe 2: hovedsakelig en penumbral område). I vårt nylig studie viste vi at variabiliteten av blodstrøm endringer i LD probe 2 (gjennomsnittlig 52% ± 16% SD, i forhold til grunnlinjen) er høyere i forhold til LD probe 1 (gjennomsnittlig 31% ± 6% SD, sammenlignet med grunnlinje) og kan brukes til å forutsi hjerneslag utfallet 4.
Vi kan gi noen feilsøking råd for forskere som ønsker å bruke våre egenutviklede system. I begynnelsen av forsøket, være forsiktig med å tørke godt skallen overflaten (med Merbromin og kald luft) før du fester sonden holder å hindre for tidlig avløsning. Videre, være sikker på å påføre limet på den naturlige gummi, unngå kontakt med den åpne enden av plastrøret og den optiske overflate LD proben, for å hindre dårlig signal og potensiell skade på sonden. Når binde sutur rundt hodet av dyret, være forsiktig for å unngå luftveisobstruksjon (dette er forhindret ved å plassere sutur over underkjevens bein). Når du har plassert og sikring sondene, være forsiktig så du ikke traction probe kabler når du slår dyret i liggende stilling for cervical kirurgi, dette trinnet vanligvis krever to personer, en person som holder dyr og en annen person som holder sonden kabler og forsiktig plassere dem til ønsket posisjon. Endelig er eventuell blodsmitte av twin-fiber LD probe letthåndterlig følge rengjøring instruksjonene fra produsenten.
Vårt optimalisert system for cerebral perfusjon overvåking, som vist i denne videoen, kunne gi en enklere, raskere og mer pålitelig alternativ til sonden for oppsett systemer som for tiden selges av kommersielle selskaper i dette feltet. Videre tror vi at bruk av dette systemet av andre forskere kan forsterke study av cerebrale hemodynamikk i den eksperimentelle hjerneslag feltet, som fører til utvikling av en ny generasjon av cerebrale sikkerhetsverdier behandlingsformer.
Disclosures
Bevilgningen for produksjon av denne video-artikkelen ble levert av Moor Instruments Ltd (Axminster, Devon, UK), som produserer Laser Doppler instrumenter er vist i vår eksperimentell studie.
Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av komiteen for Animal Care ved University of Milano Bicocca, i samsvar med de nasjonale retningslinjene for bruk av forsøksdyr (DL 116/1992) og EU-direktivet for dyreforsøk (2010/63/EU ), under prosjektet lisens (n. 219/2011-B) fra den italienske helsedepartementet.
Acknowledgments
Vi takker fru Caroline Robertson for voice-over og Mrs. Elena Pirovano for hennes assistanse i videoproduksjon. Denne studien ble støttet av Universitetet i Milano Bicocca, "Fondo di Ateneo 2011".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MoorVMS-LDF 2-channel Laser Doppler Monitor |  Moor Instruments |
||
| VP12 probe | Moor Instruments |
||
| Reagent/Material | |||
| Doccol silicon-coated filament size 4-0, diameter with coating 0.39mm | Doccol Corporation | 403956PK10 | |
| Natural rubber, e.g. common pacifiers for newborns | Multiple suppliers | ||
| Metal stylet, e.g. from spinal needle 18 GA x 90 mm | Multiple suppliers | ||
| Plastic tubes, e.g. from vein set for infusion 25 GA x 20 mm | Multiple suppliers | ||
| Nonabsorbable suture, coated, braided silk | Multiple suppliers | ||
| Cyanoacrylate surgical glue | Multiple suppliers | ||
| Isoflurane (100% v/v) for veterinary use | Multiple suppliers | ||
References
- Sutherland, B. A., Papadakis, M., Chen, R. L., Buchan, A. M. Cerebral blood flow alteration in neuroprotection following cerebral ischemia. J. Physiol. 589, 4105-4114 (2011).
- Prinz, V., Endres, M. Chapter 3 Modeling focal cerebral ischemia in rodents: Introduction and overview. Rodent models of stroke. Dirnagl, U. , Human Press. (2010).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
- Riva, M., Pappadà, G. B., et al. Hemodynamic monitoring of intracranial collateral flow predicts tissue and functional outcome in experimental ischemic stroke. Exp. Neurol. 233, 815-820 (2012).
- Menon, B. K., Smith, E. E., et al. Regional leptomeningeal score on CT angiography predicts clinical and imaging outcomes in patients with acute anterior circulation occlusions. Am. J. Neuroradiol. 32, 1640-1645 (2011).
- Bang, O. Y., et al. Collateral flow predicts response to endovascular therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 42, 693-699 (2011).
- Shuaib, A., Butcher, K., Mohammad, A. A., Saqqur, M., Liebeskind, D. S. Collateral blood vessels in acute ischaemic stroke: a potential therapeutic target. Lancet Neurol. 10, 909-921 (2011).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
- Shepherd, A. P., Öberg, P. A. Laser-Doppler Blood Flowmetry. , Kluwer Academic Publishers. (1990).
- Uluç, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Aktüre, E., Başkaya, M. K. Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
- Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation. Stroke. 26, 627-634 (1995).
