Summary
Cerebral perfusion övervakning har visat sig förbättra noggrannheten i ischemiska stroke modeller. Tekniska svårigheter begränsar ofta användningen av denna viktiga verktyg för cerebrovaskulär forskning. I den här videon är ett optimerat system visat att erhålla en enkel eller multi-site hemodynamisk övervakning under intraluminala mellersta cerebral artärocklusion hos råttor.
Abstract
Den translationella potential preklinisk strokeforskning beror på noggrannheten av experimentell modellering. Cerebral perfusion övervakning i djurmodeller av akut ischemisk stroke kan bekräfta framgångsrik arteriell ocklusion och omfattar subarachnoidalblödning. Cerebral perfusion övervakning kan också användas för att studera intrakraniella säkerheter cirkulation, vilket framstår som en stark faktor för stroke utfall och ett möjligt terapeutiskt mål. Trots en erkänd roll Laser Doppler perfusion övervakning som en del av de nuvarande riktlinjerna för experimentell cerebral ischemi, ett antal tekniska svårigheter finns att begränsa dess utbredda användning. En av de viktigaste frågorna är att få en säker och långvarig fastsättning av en djup-penetration Laser Doppler sonden till djuret skallen. I den här videon visar vi vårt optimerade för cerebral perfusion övervakning under övergående mellersta cerebral artär ocklusion av intraluminal glödtråden hos råtta. Vi utvecklade jagN-huset en enkel metod för att få en skräddarsydd hållare för dubbla fiber (djup penetration) Laser Doppler prober, som gör multi-site övervakning om det behövs. En kontinuerlig och långvarig övervakning av cerebral perfusion kan lätt erhållas under det intakta skallen.
Introduction
Translationell forskning om hemodynamiska faktorer som påverkar stroke patofysiologi och terapi måste genomföras, eftersom denna viktiga fråga ofta paradoxalt försummas av grundläggande studier 1.
Cerebral perfusion övervakning är en viktig, men underutnyttjade, verktyg för noggrann ischemisk stroke modellering 2. Bortsett från bekräftelsen av arteriell kärlocklusion och uteslutning av subarachnoid blödning 3 kan kontinuerlig cerebral perfusion övervakning ge värdefulla uppgifter om graden och konsekvens perfusion underskott funktionella status intrakraniella säkerheter fartyg och hemodynamiska effekten av nya behandlingsmetoder.
En färsk studie från vår grupp visar att multi-site hemodynamiska övervakning kan användas för att bedöma intrakraniella säkerheter cirkulation och kan förutsäga infarktstorlek och funktionell underskott 4. Dessa experimentella resultat är consistenten med kliniska studier som visade att den funktionella prestandan av cerebral kollateral cirkulation förutsäger kliniskt utfall i ischemiska strokepatienter 5, 6. Av detta skäl har cerebrala kollateraler förespråkats som en potentiell läkemedel mål i den akuta fasen av ischemisk stroke 7.
Laser-Doppler (LD) instrument är det vanligaste verktyg som används för att mäta cerebral perfusion i experimentell ischemisk stroke och deras användning rekommenderas av nya riktlinjer för detta tema 8. LD instrument åtgärd mikrovaskulär perfusion i en liten volym kortikal, djupet av den inspelade signalen är beroende på bredden på fiberseparering, med dubbla fiber LD prober möjliggör en djupare penetration jämfört med enkel fiber LD prober 9. Blodflödet uttrycks som godtyckliga perfusion enheter (PU), vilka anger relativa snarare än absoluta cerebralt blodflöde. Kalibrering av PU utförs vanligtvis using motilitet standarder, i enlighet med tillverkarens anvisningar. LD flowmetry tillåter en kontinuerlig dynamisk övervakning och generering av kvantitativa data inom samma session.
Bland de tekniska problem som för närvarande begränsar användningen av LD, är en viktig fråga att få en säker och långvarig fastsättning av en djupt penetration Laser Doppler sonden till djuret skallen. Detta är viktigt för långvarig övervakning och om flera prober används för olika cerebrala arteriella områden, som vi utför i vårt laboratorium.
I synnerhet, är förlängd kirurgisk tid krävs om sönder är fästa vid skallen med burr hål eller kranial skruvar, medan dålig signal och osäker fastsättning uppstår om enstaka fiber (låg-penetration) LD prober kopplade till skallen genom enkel kirurgiskt lim. Twin fiber (djupt penetration) LD sonder ger en högre och jämnare signal, men de är större än enstaka fiber sonder och kan inte påbifogad till skallen med kirurgisk lim bara.
I den här videon visar vi vårt optimerade för cerebral perfusion övervakning under övergående mellersta cerebral artär ocklusion av intraluminal glödtråden hos råtta. Vi beskriver en enkel metod för att erhålla en effektiv, specialtillverkade, låg kostnad hållare för en eller flera dubbel-fiber (djup-inträngning) LD prober, som skall användas för långvarig övervakning av cerebral perfusion över skallbenet.
Det kirurgiska ingreppet för transient MCAO hos råtta kunde ses i videon-artikel av Uluç och medarbetare 10 och visas inte i den här videon.
Protocol
1. Hur man gör sondhållaren (Single webbplatsen eller Multi-site)
- De material som behövs är naturgummi, små plaströr och en metall styrtråd. Sondhållaren kan anpassas till storleken av djuret, antalet och storleken av de Laser Doppler prober, och cerebral vaskulär territorium som måste övervakas.
- Skär naturgummi av den nödvändiga storleken (approximativt 10 mm x 10 mm för en 300 g råtta).
- Märk positionerna av sonden (er) och bregma på naturgummi, enligt de önskade stereotaktiska koordinater, för arteria cerebri media ocklusion är den typiska koordinaterna för den ischemiska kärnan förväntas vid bregma -1 mm, 5 mm lateralt till mittlinje, för en perifer ischemisk borderzone territorium, kan de förväntade koordinaterna vara bregma +2 mm, 2 mm lateralt om mittlinjen.
- Markera tydligt position bregma med X, är detta ett landmärke för att fästa sondhållaren till skallen. </ Li>
- Sätt nålen i ett litet plaströr (dess storlek måste matcha storleken på sonden).
- Sätt styrtråden i naturgummi vid den punkt där sonden måste positioneras, skjut styrtråden i gummit tills plaströret har förts in i gummit också.
- Dra ut nålen.
- Om flera givare behövs, upprepa steg 1,5-1,7 för övriga sond positioner.
- Valfri för flera givare: linda ett band runt plaströr för att säkerställa en bättre stabilisering av sonderna.
- Tillval: utför kemisk sterilisering av flera sond hållare för framtida bruk.
2. Presurgical Förberedelser
- MCAO stroke modell utförs vanligtvis som en överlevnad kirurgi. I detta fall, som visas i vår video (överlevnadstid 24 timmar efter operationen), använder kirurgen en aseptisk teknik med steriliserade instrument och tillbehör.
- Söva råttan med isofluran (3% inductioN fas 1,5% underhåll).
- Placera råttan i framstupa läge på operationsbordet.
- Försiktigt raka huvudet av råttan.
- Applicera en antiseptisk lösning på ett kompress och desinficera huden.
- Administrera Lidokain 2% 5 mg / kg subkutant i den kraniala området.
3. Sond Placering och säkra Över skallbenet
- Gör rätt snitt paramedian hud (för höger MCAO) och dissekera den subkutana vävnaden för att nå den kraniala fascia (Galea aponeurotica).
- Gör en rätt paramedian snitt i den kraniala fascia och utföra trubbig dissektion för att nå skallbenet, förbereda ett område skallbenet som är tillräckligt stor för tillämpningen av sondhållaren.
- Observera: inget behov av borrning eller ben gallring.
- Applicera Merbromin lösning för att desinficera och torka skallen ytan.
- Använd en hårtork (som för kall luft) för att påskynda torkning av skallen ytan. Vid denna punkt, de kraniala suturerna och bregma är klart synliga.
- Anpassa sondhållaren genom att skära kanterna med steril sax.
- Applicera en liten mängd av kirurgisk lim (Cyanoakrylat, veterinär-godkänd) till ytan under sondhållaren försiktigt undvika sämre öppning av plaströr (observera: om en betydande mängd lim kvar mellan den optiska ytan av sonden och skallen, kan detta ge en låg signal och kan skada sonden efter flera användningsområden).
- Applicera sondhållaren till skallen ytan försiktigt matcha bregma med X landmärke. Tryck lätt över sondhållaren.
- Använd en hårtork (som för kall luft) för att påskynda torkning av kirurgiska lim.
- Säkra sondhållaren genom att knyta en kirurgisk tråd runt sondhållaren och huvudet av djuret, vara noga med att placera den kirurgiska tråden över mandibula, undvika submandibulära regionen och the hals.
- Valfritt: Fyll plaströret (er) av sondhållaren med en optisk gel (t.ex. en vanlig ultraljud eller EKG-gel), vilket kommer att öka kvaliteten på LD-signalen.
- Placera sonden (er) i sondhållaren och verifiera den faktiska behandlingen av LD-flödesmätaren. Använd LD flödesmätaren enligt tillverkarens anvisningar.
- Fäst sonden (er) binda dem runt huvudet av djuret, vara noga med att placera den kirurgiska tråden över mandibula, undvika submandibulära region och halsen.
4. Cerebral perfusion Övervakning Under MCAO
- Placera råttan i ryggläge, noggrant undviker tractional krafter på sonden (er) eller sondhållare.
- Starta cerebral perfusion övervakning under MCAO.
5. Avlägsnande av sonden (er) och sondhållare
- Skär suturer runt sonden (s), sondhållaren och huvudet av djuret.
- Försiktigt trubbig dissekera kranial mjukdelar och hud runt naturgummi bas sondhållaren.
- Ta bort sondhållaren.
- Applicera en antiseptisk lösning på skallen ytan.
- Sutur den kraniala huden.
6. Postoperativ vård
- Administrera 2,5 ml saltlösning subkutant för att förhindra uttorkning och hålla djuret varmt med hjälp av en värmedyna efter avslutad gasformig anestesi.
- För överlevnad kirurgi: ge förebyggande smärtlindring med Ketoprofen 4 mg / kg subkutant och upprepa samma dos vid 12 h postoperativt
- Enligt våra experimentella förhållanden var eutanasi utfördes vid 24 timmar efter operationen av CO 2 inandning.
Representative Results
Transient MCAO (60 min) inducerades genom att sätta en silikonbelagd tråd i den yttre halspulsådern. Filamentet därefter skjutas genom den terminala änden av den inre karotidartären till ursprunget av MCA under LD övervakning. Gemensamma halsartären och pterygopalatin artären ockluderades transient under den kirurgiska insättningen av filamentet. En schematisk representation av det kirurgiska förfarandet visas i figur 1A.
Den kraniala koordinaterna för placering av två LD sonderna valdes enligt den underliggande arteriell territoriet. Preliminära experiment med gelatin-bläck perfusion (Figur 1B) visade att den ischemiska kärnan förväntas i centrala MCA territoriet (bregma -1 mm, 5 mm från mittlinjen, Probe 1), medan de säkerheter flödet förväntas i borderzone territorium mellan kortikala grenar av mellersta och främre cerebrala artärer (bregma 2 mm, 2 mm från mittlinjen, Probe 2).
Cerebral hemodynamiken studerades med hjälp av multi-site Laser Doppler prober under hela den kirurgiska ingreppet, dvs före, under och efter MCAO (Figur 2). Den cerebral perfusion underskott under MCAO var mindre och uppvisade en högre grad av variabilitet i Sond 2 jämfört med Probe 1, vilket tyder på inter-individuella skillnader i den funktionella prestandan av intrakraniella säkerheter enligt ischemiska tillstånd. Den multi-site Laser Doppler övervakningen kan också studera de cerebrala hemodynamiska förändringar under ocklusion av proximala extra kraniella cerebrala artärer (vanligt halspulsådern, interna halspulsådern, pterygopalatin artär).
Stroke utfall bedömdes 24 h efter reperfusion av infarktvolymen, beräknat på 19 varandra följande sektioner färgade med kresylviolett (Figur 3), och Garcia funktionell neuroscore 11. Immunohistokemi för specifika markörer intressebolagknippade med ischemisk hjärnskada utfördes för att erhålla en topografisk fördelning av neuronal förlust (mikrotubuli associerat protein 2, MAP2) och ischemisk halvskugga (värmechockprotein-70, Hsp70) i förhållande till multi-site hemodynamisk övervakning av intrakraniell cirkulation (Figur 4).
Figur 1. Cerebral perfusion övervakning under intraluminalt MCAO i råtta. A. Schematisk återgivning av den kirurgiska proceduren för transient MCAO. En silikonbelagd tråd användes för att ockludera ursprung MCA, efter att införas i den yttre karotidartären och trycks genom den inre karotidartären. Proximala livmoderhalscancer artärer antingen ligerades (yttre halspulsådern) eller övergående tilltäppt (pterygopalatin artär och gemensamma halsartären) under förfarandet. B. En representativ hjärna visas efter gelatin bläck färgning. Transkardial perfusion av gelatin-bläck lösning utfördes 60 min efter inträdet av ischemi, utan reperfusion. Den normalt perfusion hjärna färgas av gelatin-bläck och verkade som grå-färgad med svarta färgade fartyg, medan den ischemiska (inte-perfusion) Området förblev ofärgade (rosa-färgad). Kraniala koordinater för positionering av två LD prober visas. Sond 1 = -1 mm från bregma, 5 mm från mittlinjen, Probe 2 = 2 mm från bregma, 2 mm från mittlinjen.
Figur 2. Cerebral hemodynamiska inspelningar med multi-site Laser Doppler prober. Ett typiskt hemodynamiska mönster som tyder funktionellt aktiva intrakraniella säkerheter enligt ischemiska förhållanden visas. I detta djur visade LD tracings en litenER perfusion underskott i Probe 2 kanals, jämfört med sond 1 kanal, under både CCA ocklusion och MCA ocklusion. MCA-O = mellersta cerebral artär ocklusion. CCA-O = gemensamma halsartären ocklusion. PU = perfusion enheter.
Figur 3. Representativa hjärnan sektioner för beräkning av infarktvolymen Histologiska koronala sektioner (50 um, n = 19 med 250 nm intervall, bregma 2,5 mm till -3,0 mm). Fixeras i 4% paraformaldehyd och färgades med kresylviolett 0,1%. Infarktvolymen beräknas med ImageJ bildbehandlingsprogram, korrigerad för inter-hemisfäriska asymmetrier grund hjärnödem, och uttryckt i mm 3. Klicka här för att se större bild
Figur 4. Immunfärgning av molekylära markörer för neuronal förlust och halvskugga är Representativa konsekutiva hjämsektioner visas, som färgades med kresylviolett 0,1% (A) eller immunfärgades med markörer för neuronal förlust (mikrotubulus associerat protein 2, MAP2, B). Och ischemisk halvskugga (värme chock-protein-70, Hsp70, C).
Discussion
Vi egenutvecklade ett enkelt och billigt system för en säker fastsättning av en eller flera dubbel-fiber (djup penetration) LD sonder till skallbenet hos råttor under MCAO förfarandet. Om än till synes ett trivialt problem, att få en tillförlitlig fastsättning av LD sonden till skallen är faktiskt en viktig fråga i detta experimentella inställning, eftersom det är en förutsättning för en smidig signaldetektering och en framgångsrik uppföljning av cerebral perfusion.
Ingrepp, såsom burr hål och skruvar ben, vanligtvis förlänga den kirurgiska tid och införa mer experimentella variabler relaterade till kraniotomi, och detta kan avskräcka forskare och avstå från att använda LD övervakning. Å andra sidan ger användningen av en enda fiber (låg penetration) prober, vilka är tunnare och relativt enklare att limmas direkt till skallytan, låg kvalitet signal och kan inte användas tillförlitligt med vuxna råttor utan borrning eller förtunning skallen.
Vi använde enkla och billiga material, såsom naturgummi, plaströr och en metall styrtråd. En skräddarsydd sondhållare kan produceras i några minuter och anpassas till de experimentella förhållandena. Dessa sond innehavare rymmer en eller flera djupt penetration LD sonder, för klassisk enda ställe övervakning på ischemisk kärnan eller för flera plats övervakning i olika arteriella områden i samma halvklotet eller över två hjärnhalvorna. Många sond hållare kan framställas, kemiskt steriliseras och lagras för framtida användning. Veterinär-godkänd kirurgiskt lim (cyanoacrilate), påskyndas av kall luft, används för att fästa sondhållaren till den intakta ytan av rått skallen, enligt de önskade kraniala koordinaterna. Slutligen, är sonden installation ytterligare fäst på plats genom vanliga suturer.
Den totala tiden för denna LD prob set-up, efter behärska denna teknik, är ca 10 min.
Såsom visas in denna video följer vi rutinmässigt cerebral perfusion i centrala MCA territoriet (LD sond 1: ischemisk kärna) och i perifera MCA territorium (LD sond 2: främst en penumbral område). I vår senaste studie visade vi att variationerna förändringar blodflödet i LD sond 2 (betyda 52% ± 16% SD, jämfört med baslinjen) är högre jämfört med LD sond 1 (betyda 31% ± 6% SD, jämfört med baslinjen) och kan användas för att förutsäga stroke resultat 4.
Vi kan ge vissa felsökning råd för forskare som vill använda vår egenutvecklade system. I början av experimentet, var noga med att torka mycket väl skallen ytan (med Merbromin och kall luft) innan du ansluter sondhållaren att förhindra för tidig avlossning. Dessutom, se till att tillämpa limmet på naturgummi, undvikande kontakt med den öppna änden av plaströret och den optiska ytan av LD sonden, för att förhindra dålig signal och potentiell skada på sonden. När knyta suturen runt huvudet av djuret, vara försiktig för att undvika luftvägsobstruktion (detta förhindras genom att placera sutur över mandibular ben). Efter positionering och fixering sonderna, vara noga med att inte kablar dragkraft sond när du vrider djuret i ryggläge för livmoderhalscancer kirurgi, detta steg kräver vanligen två personer, en person som innehar djuret och en andra person som sonden kablar och försiktigt placera dem till önskat läge. Slutligen eventuell blodsmitta av dubbla fiber-LD sond lättskött efter rengöring instruktionerna från tillverkaren.
Vårt optimerade för cerebral perfusion övervakning som visas i den här videon, kan ge en enklare, snabbare och mer tillförlitligt alternativ till sonden set-up system som för närvarande säljs av kommersiella företag inom detta område. Dessutom tror vi att användningen av detta system av andra forskare kan förstärka tappeny cerebrala hemodynamik i den experimentella slag fältet, vilket leder till utveckling av en ny generation av cerebrala säkerheter terapeutika.
Disclosures
Finansieringen för produktion av denna video-artikeln från Moor Instruments Ltd (Axminster, Devon, UK), som producerar Laser Doppler instrument som visas i vår experimentell studie.
Det experimentella protokollet godkändes av kommittén för djurs vård vid universitetet i Milano Bicocca, i enlighet med de nationella riktlinjerna om användning av försöksdjur (DL 116/1992) och EU-direktivet för djurförsök (2010/63/EU ) under projektets licens (n. 219/2011-B) från det italienska hälsoministeriet.
Acknowledgments
Vi tackar fru Caroline Robertson för voice-over och fru Elena Pirovano för hennes hjälp i videoproduktion. Denna studie stöddes av University of Milano Bicocca, "Fondo di Ateneo 2011".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MoorVMS-LDF 2-channel Laser Doppler Monitor |  Moor Instruments |
||
| VP12 probe | Moor Instruments |
||
| Reagent/Material | |||
| Doccol silicon-coated filament size 4-0, diameter with coating 0.39mm | Doccol Corporation | 403956PK10 | |
| Natural rubber, e.g. common pacifiers for newborns | Multiple suppliers | ||
| Metal stylet, e.g. from spinal needle 18 GA x 90 mm | Multiple suppliers | ||
| Plastic tubes, e.g. from vein set for infusion 25 GA x 20 mm | Multiple suppliers | ||
| Nonabsorbable suture, coated, braided silk | Multiple suppliers | ||
| Cyanoacrylate surgical glue | Multiple suppliers | ||
| Isoflurane (100% v/v) for veterinary use | Multiple suppliers | ||
References
- Sutherland, B. A., Papadakis, M., Chen, R. L., Buchan, A. M. Cerebral blood flow alteration in neuroprotection following cerebral ischemia. J. Physiol. 589, 4105-4114 (2011).
- Prinz, V., Endres, M. Chapter 3 Modeling focal cerebral ischemia in rodents: Introduction and overview. Rodent models of stroke. Dirnagl, U. , Human Press. (2010).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
- Riva, M., Pappadà, G. B., et al. Hemodynamic monitoring of intracranial collateral flow predicts tissue and functional outcome in experimental ischemic stroke. Exp. Neurol. 233, 815-820 (2012).
- Menon, B. K., Smith, E. E., et al. Regional leptomeningeal score on CT angiography predicts clinical and imaging outcomes in patients with acute anterior circulation occlusions. Am. J. Neuroradiol. 32, 1640-1645 (2011).
- Bang, O. Y., et al. Collateral flow predicts response to endovascular therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 42, 693-699 (2011).
- Shuaib, A., Butcher, K., Mohammad, A. A., Saqqur, M., Liebeskind, D. S. Collateral blood vessels in acute ischaemic stroke: a potential therapeutic target. Lancet Neurol. 10, 909-921 (2011).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
- Shepherd, A. P., Öberg, P. A. Laser-Doppler Blood Flowmetry. , Kluwer Academic Publishers. (1990).
- Uluç, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Aktüre, E., Başkaya, M. K. Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
- Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation. Stroke. 26, 627-634 (1995).
