Summary
En halvautomatisk micro-electro-fluidic metod för att inducera on-demand locomotion i
Abstract
Nematoden Caenorhabditis elegans är en mångsidig modell organism för biomedicinsk forskning på grund av dess bevarande av sjukdomsrelaterade gener och vägar samt dess enkla odling. Flera C. elegans sjukdomsmodeller har rapporterats, inklusive neurodegenerativa sjukdomar såsom Parkinsons sjukdom (PD), vilket innebär degeneration av dopaminerga (DA) nervceller 1. Både transgener och neurotoxiska kemikalier har använts för att inducera DA neurodegeneration och därav defekter rörelse i Worms, vilket möjliggör undersökningar utifrån neurodegeneration och skärmar för nervskyddande gener och föreningar 2,3.
Skärmar i lägre eukaryoter som C. elegans tillhandahålla ett effektivt och ekonomiskt sätt att identifiera föreningar och gener som påverkar neuronal signalering. Konventionella skärmar är vanligen utförs manuellt och görs genom visuell inspektion, varför de är tids-consuming och benägna att mänskliga fel. Dessutom, de flesta fokuserar på cellnivå analys och bortser locomotion, vilket är en särskilt viktig parameter för rörelsestörningar.
Vi har utvecklat en ny mikroflödessystem screening systemet (Figur 1) som styr och kvantifierar C. elegans 'locomotion användning av elektriska fält stimuli inuti mikrokanaler. Vi har visat att en likström (DC) fält klart kan inducera on-demand locomotion mot katoden ("electrotaxis") 4. Reversering fältets polaritet bringar masken för att snabbt ändra sin riktning. Vi har också visat att brister i dopaminerga och andra sensoriska neuroner förändrar simning svar 5. Därför kan avvikelser i neuronal signalering bestämmas med användning av förflyttning som en utlästa. Rörelsen svaret exakt kan kvantifieras med hjälp av en rad parametrar såsom simning hastighet, kropp böjning frekvens och återföring tid.
4. Dessa fynd ledde oss att utforma en ny mikrofluidikanordning att passivt sortera maskar efter ålder och fenotyp 6.
Vi har även testat svaret av maskar till pulsad DC och växelström (AC) elektriska fält. Pulsade DC fält av olika arbetscykler effektivt genererade electrotaxis i både C. elegans och dess kusin C. briggsae 7. I ett annat experiment, immobiliserade symmetriska AC fält med frekvenser mellan 1 Hz till 3 kHz maskar inuti kanalen 8.
Genomförande av det elektriska fältet i en mikroflödessystem miljö möjliggör snabb och automatisk exekvering av electrotaxis analysen. Detta tillvägagångssätt lovar att underlätta hög genomströmning genetiska och kemiska skärmar för faktorerpåverkar neuronal funktion och lönsamhet.
Protocol
Ett. Fotolitografi för Mästare Mögel Fabrication
- Bada en 3 i. kiselskiva i aceton under 30 sekunder och därefter metanol i 30 sek. Skölj med dH 2 0 vatten i 5 min.
- Torka skivan yta med en N2 luftblåspistol. Värm skivan på en varm platta vid 140 ° C under 2 min.
- Plasma oxidera ytan av kiselskivan (1 min, 50 W).
- Spin-coat rånet yta med 3 ml SU-8 100 fotoresist (40 sek; 1.750 rpm).
- Pre-baka det belagda wafern på en het platta vid 65 ° C under 10 min, sedan ramp upp temperaturen till 95 ° C under 2 min. Behåll denna inställning under ytterligare 1 timme.
- Rikta en fotomask innehållande önskad kanal designen. Exponera motstå 550-600 mJ / cm 2 av UV-ljus (350-400 nm). Fotomasker kan utformas i AutoCAD och tryckt på en öppenhet med hög upplösning utskrift.
- Post-baka skivan på en varm platta vid 65 ° C under 1 min och 95 ° C under 10 min, rampning tHan temperatur som innan.
- Sänk rånet i SU-8 utvecklare lösning för 10-15 min. Kontrollera för slutförande av utvecklingen av sköljning med isopropanol. Om en vit fällning bildas, fortsätta utveckla. Den huvudsakliga gjutformen visas i figur 2A.
2. Mjuk litografi för Microchannel Fabrication
- Blanda 35 ml polydimetylsiloxan (PDMS) elastomer bas med 3,5 ml PDMS härdare.
- Placera den tillverkade huvudsakliga gjutformen (mönster uppåt), och ett tomt kiselskiva i petriskålar fodrade med aluminiumfolie.
- Häll 20 ml PDMS prepolymer i master mögel skålen och 15 ml i den andra skålen. Eliminera luftfickor under skivorna genom att försiktigt trycka på dem med en disponibel trä applikator.
- Täck båda skålarna och ställ åt sidan för en dag för att bota. Alternativt, för snabbare härdning, avlägsna luftbubblor från PDMS med hjälp av en vakuum-avgasning och får sedan ligga rätter på en värmeplatta vid 80 ° C under 2tim.
- Ta bort folien och dra av PDMS från skivorna.
- Använd Harris Uni-Core (2,5 mm) för att stansa portar fluidåtkomst i båda ändarna av kanalen. Skär kanalen och tomma PDMS i liknande storlek remsor.
- Ladda kanalen, den tomma PDMS band och en glasskiva (75 × 25 mm 2) i en plasma oxidationsmedel, sannolikt beläget i ett renrum. Utsättas för syre plasma under 40 sekunder vid 40 W effekt.
- Stick kanalstycket och glasskiva till motsatta sidor av ämnet remsan. Ställ åt sidan i 2 timmar för att slutföra bindningen.
- Placera aggregatet på en värmeplatta vid 120 ° C. Fäst plaströr (innerdiameter 1/32 ", ytterdiameter 3/32"), var och en åtminstone 6 tum lång, till de stansade reservoarer med PDMS prepolymer. Fäst en fluidisk plast-kontakt till en eller båda rören så att sprutan kvarstad, eller använda kommersiellt tillgängliga kopplingar.
- Tillåt PDMS fästa slangen att bota. Sätt 3 "längder av 22 gauge isolerad koppartråd i EACh reservoar, mellan inloppsröret och kanalen, och säkert med PDMS prepolymer. Den färdiga produkten visas i figur 2B.
Tre. Electrotaxis Experiment
- Placera mikrokanalen på scenen (företrädesvis XY-lös) av ett mikroskop med en monterad kamera kopplad till en bildskärm (Figur 1).
- Anslut strömförsörjningen eller förstärkarens kablar utgång till mikrokanalen elektroder. En enkel DC strömförsörjning är tillräckligt om bara en DC-signal önskas, men en förstärkare kopplad till en funktion generator tillåter tillämpning av pulsad DC och AC-signaler också.
- Fäst mikrokanalen s utloppsröret till en engångsspruta. Sänk mynningen av inloppsröret i M9-fysiologisk buffert och försiktigt aspirera vätska in i kanalen genom att applicera ett negativt tryck inuti sprutan (antingen manuellt eller med användning av en sprutpump). När in-och utlopp rören är båda fyllda med M9, koppla sprutan from röret. Nivå båda rören på samma höjd för att förhindra hydrostatiskt driven strömning.
- Applicera en likspänning till kanalen och se till att resistansen (R = V / I) är cirka 0,6 Mohm (för en 50 mm lång, 0,3 mm bred och ~ 0,1 mm djup mikrokanal).
- Om du är nöjd med kanalens integritet, följa ovanstående steg för att fylla maskar från en utspädd suspension i kanalen.
- Koppla sprutan och hydrostatiskt manipulera flödet genom att justera rörens relativa höjden. Använd denna metod för att placera en mask i mitten av kanalen och sedan lägga båda rören platt på samma höjd.
- Ställ in strömmen till rätt spänning: 4-12 V / cm för L3 arrangerar djur, 4-10 V / cm för L4s och 2-4 V / cm för unga vuxna. Aktivera den elektriska signalen och tillåta en min av förexponering för masken att acklimatisera till fältet. Masken ska börja gå mot katoden. När minuten har gått, använd kameran för att starta inspelningen.
- För AC och pulsD DC experiment, kan den maximala lyhörd elektriska fältet antas uppifrån och frekvens och arbetscykel för signalen kan moduleras returresa 7, 8.
- När experimentet är klar, ta bort all vätska (och maskar) från kanalen, skölj den med dH 2 0, och lämna enheten på en värmeplatta vid 125 ° C för att torka.
- Utdrag motoriskt uppgifter från inspelade videor manuellt med NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) eller anpassade MATLAB-baserad mask spårningsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En representativ video av en vild-typ unga vuxna nematod s electrotaxis och dess ställning och utgångar hastighet från masken spårningsprogram visas i kompletterande Video 1 och Figur 3. Rörelsen analysprogram själv erkänner inte riktningen på fältet polaritet och tiden för polvändning, utan måste denna information erhållas från källan video. Detta skulle kunna göras med hjälp av en ljud-eller visuell på video eller skriva ner experimentella förhållanden och manipulationer.
Electrotaxis hastighetsdata från en uppsättning av vildtyp (N2) och transgena djur (NL5901) visas i figur 4. De NL5901 djur bär humant α-synuclein-genen under kontroll av unc-54 (myosin tung kedja-gen) promotom. Den uttryckte α-synuklein i kroppen väggen muskler aggregat 9 och våra resultat visar att det orsakar avvikelser i elektrotrotactic svar. Hastigheten på NL5901 maskar är betydligt långsammare än vild typ. För att rita grafen, beräknade vi hastigheten på enskilda maskar och ritas resulterar i ett lådagram med Minitab statistisk programvara ( http://www.minitab.com ). Förutom hastigheten, andra parametrar i rörelse, såsom svarvning svar (tid det tar att slutföra återföring svar på elektriskt fält polaritet förändring) och kropp böja frekvens (genomsnittligt antal sinusvågor per sekund), kan också analyseras som beskrivs på annat håll fem.
Den electrotaxis protokollet fungerar bäst med en synkroniserad population, som kan erhållas via behandling med blekmedel (natriumhypoklorit och 4 N natriumhydroxid i ett 2:3 volymförhållande) 10. Alla data som presenteras här har erhållits från synkroniserade populationer att utesluta ålder-och scen-beroende variation. Medan vi har använt unga vuxna (69 h efter L1 på200C), kan andra faser (L2 och framåt) också testas.
Figur 1. Schematisk av mikroflödessystem screening plattform för nematod electrotaxis analys. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Huvudsakliga gjutformen (A) och fullt monterade PDMS mikrokanal enhet (B).
Figur 3. Position vs tid (A) och momentan hastighet (B) utgångar anpassade mask tracking program. Source video är kompletterande Video 1 nedan. Programmet beräknar hastighetskurvan från läget-tidkurvan men bortser från de spikar vid beräkning medelhastighet.
Figur 4. Electrotaxis hastighet av vildtyp kontroll N2 och transgena NL5901 maskar. NL5901 maskar är betydligt långsammare än kontrollen med p> 0,0001. Signifikans fastställs med användning av icke-parametriska Mann-Whitney-testet. n = 10 för N2 och n = 23 för NL5901.
Kompletterande Video 1. Electrotactic beteende unga vuxna nematoder i en mikroflödessystem kanal. Video börjar med katoden till höger. Utseende av glas pipett indikerar förestående polvändning, efterföljande avlägsnande av pipetten signaler ögonblick av återföring. Klicka här för att sefilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dra nytta av den beteendemässiga fenomen som först beskrevs av Gabel och kolleger och bygga på dielektroforetiska manipulation arbete Chuang och kollegor 11,12, erbjuder vår mikroflödesbaserade electrotaxis analys en enkel, robust och känslig metod för att undersöka neuronal aktivitet i maskar med rörelse som en utgång. Analysen av rörelseparametrar möjliggör kvantitativ jämförelse mellan olika genotyper. Precisionen i microchannel tillverkning och elektriska fält ansökan tillsammans ger både en kontrollerbar miljö och ett sätt att kommunicera med masken för transport kontroll. Olika elektriska signal vågformer har olika beteendemässiga reflektioner i masken och har använts för att både stimulera och hämma förflyttning.
Den enda kanal utformning av föreliggande mikrofluidanordning kräver att endast en enda mask görs vid en tidpunkt. För detta måste masken lösningen späds ut tillräckligt med M9buffert innan du försöker ladda maskar i kanalen. Det är viktigt att påpeka att kanalen operationer kan kompliceras av närvaron av luftbubblor och andra oegentligheter som påverkar det hydrostatiska trycket. Detta skulle kunna elimineras genom att spola kanalen med M9 och manipulera höjden av inlopps-och utloppsrören.
Analysen som beskrivs här kan förbättras ytterligare. En flerkanalig mikroflödessystem chip kunde accelerera masken screening, även om det kommer att kräva integration av andra kontrollmekanismer såsom mask lastning, positionering och spårning. Ytterligare automatisering av electrotaxis protokollet, särskilt datorstyrda flow management, kommer att öka effektiviteten. Dessa förbättringar är för närvarande under utveckling i vårt laboratorium.
Extraktion av locomotion uppgifter från electrotaxis videor utfördes ursprungligen manuellt med ImageJ, som är en långsam och mödosam process. För att öka effektiviteten och eliminera hUman fel, har vi börjat använda ett program mask spårning anpassas från en original MATLAB-baserade paket som utvecklats vid California Institute of Technology 13. Programvaran bearbetar för närvarande singel-mask videor. Den senaste versionen är lämplig för ett brett spektrum av analyser inbegripet kemiskt behandlade maskar och neuronala och mutanter muskel. En av dess begränsningar är att spontana återföringar, som observerats i vissa neuronala mutanter (t.ex. OSM-5) 5, inte tolkas korrekt. Sådana maskar måste analyseras manuellt.
Begränsningar Trots kan mikrofluidiska electrotaxis tillämpas i otaliga sammanhang, inklusive analyser läkemedelsutveckling med mask modeller av rörelse-relaterade sjukdomar. Med tanke på dess mottaglighet för parallellisering är electrotaxis särskilt väl lämpade för high-throughput screening program. Genetisk och åldersberoende analys av electrotactic beteende och neuronal degeneration kan också studeras med dennasystemet. Dessutom kan maskar sorteras efter ålder eller fenotyp att bilda synkroniserade prover eller att identifiera nya mutanter för framåt genetiska skärmar 6,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den mikroflödessystem electrotaxis assay teknik har ansökt om patent i USA och Kanada.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för naturvetenskap och teknisk forskning Council of Canada, Kanada Research Chairs Program, Canadian Institutes of Health Research, och Ontario ministeriet för forskning och innovation genom sin tidiga Forskare Award Program för ekonomiskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
- Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
- Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).
- van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
- Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5 (2005).
- Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).
