用于成像和膜片钳电生理学研究的巨型脂质体的制备

摘要

将功能性膜蛋白重构到特定组分的巨型脂质体中，结合膜片钳电生理技术，是一种强大的研究方法。然而，传统的巨型脂质体制备方法可能不利于蛋白质的稳定性。本文描述了从纯脂质或含有离子通道的小型脂质体制备巨型脂质体的实验方案。

摘要

将离子通道重构到化学成分明确的脂质膜中以进行电生理记录，是一种用于鉴定和研究这些重要蛋白质功能的强大技术。然而，传统的制备方法（如平面双层膜）限制了对重构通道及其膜环境所能进行的操作和实验。而更大、更类似细胞结构的巨脂质体则能够在不牺牲对脂质环境控制的前提下，实现传统的膜片钳实验。

电穿孔法是制备巨型脂质体的有效方法 >直径为10 μm，其原理依赖于在电极表面施加交流电压，作用于一层薄而有序的脂质膜。然而，由于经典方案要求脂质从有机溶剂中沉积，因此不适用于离子通道等结构较脆弱的膜蛋白，必须进行改进。近期已发展出从部分脱水的小型脂质体电形成巨型脂质体的实验方案，我们在实验室中已将其改进并应用于含蛋白质的脂质体。

本文介绍了由小脂质体分散液通过电场形成法制备巨型脂质体的背景知识、仪器设备、技术要点及注意事项。我们首先讲解经典实验方案，建议在掌握此基础方法后再尝试后续更具挑战性的方案。我们将演示利用饱和盐溶液的蒸气平衡对小脂质体进行可控部分脱水的过程。最后，展示电场形成法本身的实施步骤。文中将描述一种结构简单、成本低廉、可自行搭建的实验装置，用于制备高质量脂质体，并介绍在各个制备阶段如何通过显微观察来确保最佳结果。

引言

巨型脂质体（通常称为巨型单层囊泡，或 GUVs）主要被用于研究脂质双分子层的物理及物理化学性质，包括双分子层形变、侧向相共存（“脂筏”）、膜融合等。 等等^1-4它们具有明显的细胞样结构：由膜构成的球形外壳包裹着内部的水相环境，该水相环境可轻易地与周围缓冲液的组成不同。根据定义，其直径约为 ≈1–100 μm，因此可采用多种光学显微镜技术进行成像。通过渗透压梯度或施加机械张力，可使这些囊泡保持紧绷状态，从而在总体柔软的同时具备可调控的物理特性，便于操作。特别是，通过调控脂质体的“刚度”，可简便地形成用于电生理记录的“脂质体附着”或“游离膜片”。过去，离子通道的重构主要在平面脂双层中进行。如今，得益于能够从巨型脂质体上形成膜片，并结合常规电生理技术所发展出的丰富工具集（如荧光显微镜、微管吸吮、快速灌流和温度控制）， 等等。使得巨型脂质体在重建研究中日益具有吸引力^5,6.

人们已采用多种策略制备巨型脂质体。事实上，当干燥的脂质膜被重新水化时，巨型脂质体会通过溶胀过程自发形成^4,7,8。为了更快地制备尺寸更大、更均一的脂质体，研究人员开发了其他方法，其中最主要的是电场诱导成脂法^1,9。该方法同样依赖于对干燥脂质膜的水合作用，但通过在脂质膜两侧施加交变电场来加速成脂过程。电场通过两个电极施加，电极可以是铂丝，也可以是涂有氧化铟锡（ITO）的玻璃载片，两者之间由水或....

方案

1. 从有机溶剂中沉积脂质：经典方案

1. 从 -20 °C 或 -80 °C 条件下取出脂质，升温至室温。 注意： 脂质具有极强的吸湿性，且许多脂质对氧气敏感。应以干燥的氩气或氮气覆盖脂质 所有步骤中均应尽量减少暴露于空气.
2. 必要时，将脂质悬浮于氯仿或环己烷中，浓度为1-10 mg/ml；注意，厂家提供的浓度通常仅为标称值。 警告：使用有机溶剂时应佩戴适当的手套及其他个人防护装备。若溶剂溅到防护装备上，应迅速脱除，因为大多数材料对这些溶剂仍具有渗透性，只能提供暂时的保护。
3. 用乙醇清洁两片25 × 37.5 mm的ITO镀膜玻璃载玻片的两侧
4. 按所需摩尔比例混合脂质。每1 cm² 根据需包被脂质的ITO载玻片面积，混合约15–20 μg脂质。例如，若要完全包被两张25 × 37.5 mm的载玻片，通常使用30 μl浓度为10 mg/ml的脂质混合物。 注意： 加入0.1 mol% Texas Red-DPPE用于荧光成像，荧光染料的使用注意事项见下文。
5. 使用欧姆表或万用表测量玻璃载片上ITO涂层一侧的表面电阻，以确认其朝上放置。
6. 将脂质吸入耐溶剂的注射器中。 注意： 除聚四氟乙烯（PTFE）外，不得使用任何胶水或塑料接触有机溶剂。
7. 在注射器....

结果

在我们的示例中，我们使用约55 mol% POPC（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-磷胆碱），15 mol% POPS（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-磷脂酰丝氨酸，30 mol% 胆固醇，以及 0.1 mol% 德州红标记的 1,2-二棕榈酰-sn-磷脂酰乙醇胺（TxR-DPPE）。该组分的选择旨在大致代表背根神经节脂质的组成¹⁸我们注意到，15 mol%的带电脂质（此处为POPS）已接近电穿孔法成脂质体时可使用的上限例如 Walde 等⁴).

通过水解和过氧化作用导致的脂质降解对许多脂质混合物以及许多敏感性实验而言是一个尤为重要的问题（见讨论部分）。仅为了视频演示的清晰起见，本实验未使用惰性气体环境。从下图可以明显看出，这并不会显著影响脂质体的质量；但在进行敏感性研究或使用高度不饱和脂质时，防止脂质降解至关重要。

由于电形成过程中的主要难点是在氧化铟锡（ITO）基底上形成良好的脂质膜，因.......

讨论

巨噬脂质体的电形成技术已发展为一种灵活的方法，可兼容多种脂质、制备方式和缓冲液体系。脂质沉积过程的精确控制是实验成功最关键的环节。我们已提供了一些简单工具，使得从小规模脂质体制备中实现可控的脂质沉积变得简便易行。相对湿度对于初始脂质体的充分脱水至关重要，而最佳湿度值将随脂质体悬液中初始溶质浓度的不同而变化。浓度较高的样品需要更低的相对湿度才能充分脱水至适当程度。

精确的水合方案以及用于电场成形的电场参数仍是当前讨论的焦点^{1,4,7,10,11,22}。在尝试于高盐浓度、带电脂质或高相变温度脂质的高浓度条件下进行脂质体电场成形之前，应首先掌握最基础的实验方案。一旦掌握这些基本技能，更高级的方案通常将电场成形过程分为三个阶段：初始溶胀、生长和脱离。初始溶胀阶段似乎更有利于在缓慢增加外加电场强度的条件下进行¹¹。第二个可选阶段是在固定电场强度下进行，有助于调控脂质体的最终尺寸。最后，降低交变电场的频率可能有助于脂质体从ITO表面脱离。在生理盐浓度条件下进行脂质体电场成形需要更高的频率¹¹，但脂质体可在极宽范围的电场频率和振.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
数字万用表	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A 或类似型号	任何万用表均可使用，但应避免使用老式模拟欧姆表，因其会对被测电阻施加过大的电流。
	Fluke	117 或 177	任何万用表均可使用，但应避免使用老式模拟欧姆表，因其会对被测电阻施加过大的电流。
函数发生器	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A 或类似型号	大多数函数发生器适用于简单实验方案。该可编程型号适用于高级电致形成实验方案。请确保发生器能够在 50 Ω 负载下输出 10 V 峰峰值电压。
氧化铟锡（ITO）镀膜玻璃载片	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 或类似型号	将这些载片对半掰断，制成两个尺寸为 25 mm × 37 mm 的载片。
温度控制器	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 或类似型号
湿度计	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
硅橡胶片	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	使用 USP VI 级硅胶，因其具有高纯度。
电磁干扰（EMI）密封垫	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 或类似型号	由 Mouser 分销 www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	其他荧光标记脂质也可获得，但 TxR-DHPE 是其中最亮且光稳定性最好的之一。
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P 或 850457C	脂质可订购粉末形式（P）或氯仿溶液形式（C）
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
胆固醇	Sigma-Aldrich	C8667