Riesen-Liposomen-Herstellung für Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie

Summary

Reconstituting funktionellen Membranproteinen in riesige Liposomen definierter Zusammensetzung ist ein leistungsfähiges Konzept, wenn es mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie kombiniert. Dagegen dürfen herkömmliche Riese Liposomen Produktion unvereinbar mit Proteinstabilität. Wir beschreiben Protokolle zur Herstellung Riese Liposomen aus reinem Lipide oder kleine Liposomen, die Ionenkanäle.

Abstract

Die Rekonstitution von Ionenkanälen in chemisch definierten Lipidmembranen für elektrophysiologische Aufzeichnung wurde eine leistungsfähige Technik zu identifizieren und erkunden Sie die Funktion dieser wichtigen Proteinen. Jedoch begrenzen klassischen Zubereitungen, wie planare Doppelschichten, die Manipulationen und Experimente, die auf dem rekonstituierten Kanal und seine Membran Umgebung ausgeführt werden können. Je mehr Zellen Struktur von Riesenliposomen ermöglicht traditionelle Patch-Clamp-Experimente ohne Steuerung des Lipidumgebung.

Elektroformation ist ein effizientes Mittel zur Erzeugung Riesenliposomen> 10 um im Durchmesser, die auf der Anwendung von Wechselspannung in eine dünne, geordnete Lipid Film, der auf einer Elektrodenoberfläche beruht. Da jedoch die klassische Protokoll fordert der Lipide aus organischen Lösungsmitteln aufgebracht werden, ist es nicht mit weniger robust Membranproteine ​​wie Ionenkanäle und modifiziert werden muss. Kürzlich protocols wurden entwickelt, um Riesenliposomen von partiell dehydratisierten kleinen Liposomen, die wir Protein-haltigen Liposomen in unserem Labor angepasst haben Elektroform.

Wir stellen Ihnen hier den Hintergrund, Ausrüstung, Techniken und Fallstricke Elektroformation riesiger Liposomen aus kleinen Liposomendispersionen. Wir beginnen mit dem klassischen Protokoll, das erste sollte, bevor die größere Herausforderung Protokolle, die gemeistert werden folgen. Wir zeigen den Prozess der kontrollierten teilweisen Wasserentzug aus kleinen Liposomen mit Dampf-Gleichgewicht mit gesättigten Salzlösungen. Schließlich zeigen wir den Prozess der Elektroformation sich. Wir beschreiben einfache, kostengünstige Geräte, die in-house gemacht werden können, um qualitativ hochwertige Liposomen zu produzieren, und beschreiben Sichtprüfung der Vorbereitung auf jeder Stufe, um die besten Ergebnisse zu erzielen.

Introduction

Riesen-Liposomen (oft als Riese einschichtigen Vesikeln oder GUVs) wurden in erster Linie verwendet, um die Physik und der physikalischen Chemie von Lipid-Doppelschichten, einschließlich Studien der Doppelschicht Verformung, seitliche Phase Koexistenz ("Rafts"), Membran-Fusion, etc ^1-4 studieren. Sie haben einen grob Zell-Struktur: Kugelschale Membran umgibt einen wässrigen Innenraum, die leicht gemacht werden, anders als die umgebenden wässrigen Puffer werden. Sie sind per definitionem ≈ 1-100 &mgr; m im Durchmesser, so dass sie abgebildet mit einer Vielzahl von Lichtmikroskopie Ansätze werden. Sie können gestrafft durch osmotischen Gradienten od....

Protocol

1. Ablagerung von Lipiden aus organischen Lösungsmitteln: Klassische Protocol

1. Entfernen von Lipiden aus der Lagerung bei -20 ° C oder -80 ° C, auf RT erwärmt. Achtung: Lipide sind extrem hygroskopisch, und viele sind empfindlich gegenüber Sauerstoff. Titelbild Lipide in trockenem Argon oder Stickstoff und in allen Schritten Minimierung der Exposition gegenüber Luft.
2. Wenn erforderlich, zur Aussetzung der Lipide in Chloroform oder Cyclohexan bei 1-10 mg / ml; beachten Sie, dass vom Hersteller angegebenen Konzentrationen in der Regel sind nur nominal ACHTUNG: Tragen Sie geeignete Handschuhe und andere persönliche Schutz....

Results

In unseren Beispielen bereiten wir Liposomen aus einem Gemisch von etwa 55 Mol-% POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphocholin), 15 mol% erscheint (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-Phosphoserin , 30 mol% Cholesterin und 0,1 mol% Texas Red-markierten 1,2-dipalmitoyl-sn-Phosphoethanolamin (TxR-DPPE). Diese Zusammensetzung wie etwa Vertreter der Spinalganglien Lipide ¹⁸ gewählt wurde. Wir bemerken, dass 15 mol% geladen Lipid (hier POPS) ist in der Nähe der Grenze dessen, was in El.......

Discussion

Elektroformation riesiger Liposomen wurde in eine flexible Technik kompatibel mit verschiedenen Lipiden, Zubereitungen und Puffer entwickelt. Eine sorgfältige Steuerung der Lipidablagerung-Verfahren ist sehr entscheidend für den Erfolg. Wir haben einfache Werkzeuge vorgestellt, um eine kontrollierte Abscheidung von Lipiden aus kleinen Liposomenzubereitungen ein einfacher Prozess zu machen. Die relative Feuchtigkeit ist für die einwandfreie Entwässerung der ersten Liposomen, und der optimale Wert wird mit der anfängliche.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitales Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A oder ähnlich	Jedes Multimeter ist geeignet, aber vermeiden Sie analoge Ohmmeter im alten Stil, die viel mehr Strom an den zu prüfenden Widerstand anlegen.
	Fluke	117 oder 177	Jedes Multimeter ist geeignet, aber vermeiden Sie analoge Ohmmeter alter Bauart, die viel mehr Strom auf den zu prüfenden Widerstand anlegen.
Funktionsgenerator Agilent	Technologies, www.agilent.com	33210A oder ähnlich	meisten Funktionsgeneratoren arbeiten für einfache Protokolle. Dieses programmierbare Modell ist nützlich für fortgeschrittene Elektroformationsprotokolle. Stellen Sie sicher, dass der Generator 10 V Spitze-Spitze in einen 50 Ω treiben kann; Laden Sie
ITO beschichtete Glasobjektträger	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 oder ähnlich	Brechen Sie diese in zwei Hälften, um zwei Objektträger herzustellen, 25 mm x 37 mm
Temperaturregler	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 oder ähnlich
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silikonkautschukplatte	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Verwendung von USP Grade VI Silikon für seine hochreine
EMI-Dichtung	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 oder ähnlich	Vertrieb durch Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Andere fluoreszenzmarkierte Lipide sind verfügbar, aber TxR-DHPE ist eines der hellsten und photostabilsten.
POPC	Avanti Polar Lipide, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P oder 850457C	Lipide können als Pulver (P) oder in Chloroform (C)
POPS	werden Avanti Polar Lipide	840034P/C
Cholesterin	Sigma-Aldrich	C8667