RNA secundaire structuur Voorspelling behulp van High-throughput SHAPE

Samenvatting

High-throughput selectieve 2-hydroxyl acylering geanalyseerd door primerverlenging (SHAPE) gebruikt een nieuwe chemische indringende techniek, reverse transcriptie, capillaire elektroforese en secundaire structuur predictie software om de structuren van RNA bepalen van enkele honderden tot enkele duizenden nucleotiden aan nucleotide resolutie.

Samenvatting

Inzicht in de functie van RNA betrokken zijn bij biologische processen vereist een grondige kennis van de structuur van RNA. Voor dit doel wordt de methode genaamd "high-throughput selectieve 2-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie" of SHAPE, maakt voorspelling van secundaire structuur van RNA met enkele nucleotide resolutie. Deze aanpak maakt gebruik van chemische stoffen die bij voorkeur indringende acyleren enkelstrengs of flexibele gebieden van RNA in waterige oplossing. Sites van chemische modificatie worden gedetecteerd door reverse transcriptie van het gemodificeerde RNA en de producten van deze reactie worden gefractioneerd door geautomatiseerde capillaire elektroforese (CE). Aangezien reverse transcriptase onderbroken op de RNA nucleotiden gemodificeerd door de SHAPE reagentia, de resulterende cDNA-bibliotheek indirect mapping die ribonucleotiden die enkel zijn gestrand in de context van de gevouwen RNA. Gebruik ShapeFinder software, worden de elektroferogrammen door geautomatiseerde CE verwerkt en omgezet tot nucleotide reactiviteit tabellen die zich omgezet in pseudo-energie beperkingen die in de RNAStructure (v5.3) voorspelling algoritme. De tweedimensionale RNA structuren verkregen door het combineren SHAPE probing met in silico RNA secundaire structuur voorspelling is gevonden dat veel nauwkeuriger dan structuren verkregen bij procedure alleen.

Inleiding

Om de functies van katalytische en niet-coderende RNA's die betrokken zijn bij de regulatie van splicing, vertaling, virusreplicatie en kanker te begrijpen, is een gedetailleerde kennis van RNA structuur vereist ^1,2. Helaas, nauwkeurige voorspelling van RNA vouwen vormt een enorme uitdaging. Klassieke indringende agenten lijden veel nadelen, zoals toxiciteit, onvolledige nucleotide dekking en / of doorvoer beperkt tot 100-150 nucleotiden per experiment. Zonder hulp secundaire structuurvoorspelling algoritmen zijn eveneens nadelig, vanwege onnauwkeurigheden als gevolg van hun onvermogen om effectief onderscheid tussen energetisch soortgelijke structuren....

Protocol

Primerontwerp en uitbreiding van de RNA 3 'terminus

Om lange RNA analyse door high-throughput SHAPE, moet een reeks van primer hybridisatie sites dat ze (i) worden gescheiden door ~ 300 nt, (ii) 20-30 nt in lengte, en (iii) dat RNA / worden geselecteerd DNA hybriden gemaakt door het gloeien DNA om deze sites een verwachte smelttemperatuur van> 50 ° C. Bovendien moeten segmenten van RNA die voorspeld hoge mate bepaald worden vermeden, maar die constatering vereist enige voorkennis van de structuur van RNA, die vaak niet beschikbaar. DNA-primers die hybridiseren aan deze sites moet dan worden ontworpen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat zij....

Resultaten

RNA die het HIV-1 rev-responselement (RRE) en een 3'-eindstandige structuur cassette ⁴ werd bereid uit een gelineariseerd plasmide door in vitro transcriptie, waarna het werd gevouwen door verwarming, koeling, en incubatie bij 37 ° C in aanwezigheid _MgCl2. RNA werd blootgesteld aan NMIA en vervolgens reverse getranscribeerd van een 5'-eindstandig gemerkt DNA primer gehybridiseerd aan het 3 'terminale structuur cassette. De resulterende cDNA-bibliotheek SHAPE, en controle-en seq.......

Discussie

We presenteren hier een gedetailleerd protocol voor high-throughput SHAPE, een techniek die secundaire structuur wordt het mogelijk om single-nucleotide resolutie voor RNA's van elke omvang. Bovendien koppeling SHAPE experimentele data met secundaire structuurvoorspelling algoritmen vergemakkelijkt generatie RNA 2D modellen met een hogere nauwkeurigheid dan mogelijk is met deze methoden alleen is. De combinatie van fluorescent gemerkte primers en geautomatiseerde CE biedt aanzienlijke voordelen boven de traditionele.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
REAGENTS
N-methylisatoic anhydride (NMIA)	Life technologies	M25	Los op in anhydrisch DMSO
1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7)	zie ref. 22
Superscript III Reverse Transcriptase	Life technologies	18080044	10.000 eenheden
Thermo sequenase cyclus sequencing kit	Affymetrix	78500
Materialen geleverd door de gebruiker
RNA van belang			6 pmol per reactie (de detectielimiet wordt bepaald door het instrument)
Sets van vier 5' gelabelde primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 en WellRed D1/Licor IR800)			Primers zijn complementair aan het RNA en worden gebruikt in reverse transcriptie- en sequencingreacties. De vermelde fluoroforen zijn optimaal voor de Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers kunnen worden gekocht of in huis worden gesynthetiseerd.
DNA-sjabloon			DNA wordt gebruikt voor sequencingreacties en moet de sequentie van het bestudeerde RNA bevatten - inclusief eventuele 3'-terminale extensie, indien aanwezig. Waar van toepassing, is het vaak handig om de RNA-transcriptiesjabloon te gebruiken.
Buffers
10x RNA-renaturatiebuffer			100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA
5X RNA-vouwbuffer			200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2,5 mM EDTA, 650 mM KCl. (Deze buffer kan worden gewijzigd afhankelijk van het geval (bijv. pH, EDTA, Mg, RNase-remmer)
2,5X RT-mix			4 μl 5X buffer, 1 μl 100 mM DTT, 1,5 μl water, 1 μl 10 mM dNTPs, 0,5 μl SuperScript III. Merk op dat de 5X buffer en 100 mM DTT worden geleverd bij de aankoop van SuperScript III (Invitrogen).
GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter)			Let op: Vermijd meerdere vries-ontdooicycli
APPARATUUR
Capillaire elektroforese	Beckman	CEQ8000
Thermocycler	varieert