Summary
الزرد هي نظام لنمذجة الاضطرابات الناشئة الإنسان من العضلات والهيكل العظمي. نحن تصف طريقة سريعة وفعالة لعزل myofibers العضلات والهيكل العظمي من الزرد الجنينية واليرقات. هذه الطريقة تعطي عالية الكثافة إعداد ليف عضلي مناسبة لدراسة مورفولوجية واحد من الألياف العضلات والهيكل العظمي، والبروتين توطين التحت خلوية، وعلم وظائف الأعضاء العضلات.
Abstract
وقد ثبت الزرد أن يكون نظام نموذجا قيما لاستكشاف وظيفة العضلات والهيكل العظمي والعضلات لدراسة الأمراض البشرية. على الرغم من العديد من المزايا التي تقدمها في الجسم الحي تحليل الهيكل العظمي والعضلات في الزرد، تصور معقد ومنظم بدقة البروتين الوسط مسؤولة عن وظيفة العضلات، وخصوصا في الأجنة كله، يمكن أن يكون مشكلة. ينبع هذا عائق من صغر حجم العضلات والهيكل العظمي الزرد (60 ميكرون)، وحجم أصغر من قسيم عضلي. نحن هنا وصف وشرح طريقة بسيطة وسريعة لعزل myofibers الهيكل العظمي من الأجنة الزرد واليرقات. نحن تشمل أيضا البروتوكولات التي توضح تقنيات إعداد المنصب مفيدة لتحليل بنية العضلات وظيفة. على وجه التحديد، ونحن من التفصيل توطين immunocytochemical اللاحقة للبروتينات العضلات والهيكل العظمي والتحليل النوعي لإطلاق الكالسيوم عبر حفز التصوير الكالسيوم الخلية الحية. عموما، هذا الفيديوتنص المادة طريقة مباشرة إلى الأمام وكفاءة لعزل وتوصيف myofibers الهيكل العظمي الزرد، وهو الأسلوب الذي يوفر ممرا للدراسات اللاحقة لا تعد ولا تحصى من بنية العضلات وظيفة.
Introduction
العضلات والهيكل العظمي هو النسيج درجة عالية من التخصص مسؤولة عن توليد القوى مقلص اللازمة لحركية. يبدأ الانكماش من خلال عملية تعرف باسم الإثارة الانكماش (EC) اقتران الذي يحول الإشارات الكهربائية إلى إطلاق الكالسيوم من مخازن داخل الخلايا 1،2. الافراج الكالسيوم داخل الخلايا ينشط قسيم عضلي لتقصير وتوليد القوة. والعديد من مكونات محددة من الآلات الجزيئية المسؤولة عن التوسط انتقال العصبية والعضلية تقاطع 3، EC اقتران 4،5، وأكتين-الميوسين تقلصات تعتمد 6 الاستمرار في أن تكون موضوع بحث مكثف الجارية. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد البروتينات التي استقرار غشاء العضلات خلال 7،8 الانكماش والتي تتوسط بين إشارات ليف عضلي والمصفوفة خارج الخلية 7،9 ودرس بقدر كبير من التفصيل.
الطفرات في عدد من الجينات الهامة للبنية العضلاتوقد تم تحديد وظيفة الثانية كأسباب للأمراض العضلات والهيكل العظمي البشري ( http://www.musclegenetable.org/ ). هذه الأمراض، تصنيفها كما الاعتلالات العضلية الهيكلية وضمور العضلات على أساس الخصائص السريرية والنسيجية، وترتبط مع ضعف العضلات، والعجز مدى الحياة، و10،11 الوفيات المبكرة. وقد ثبت الزرد أن يكون نظاما غير المسددة لنمذجة ودراسة الأمراض العضلات والهيكل العظمي البشري 8،12،13. واستخدمت ذلك للتحقق من صحة طفرات جينية جديدة 8، وتحديد جوانب جديدة من الفيزيولوجيا المرضية المرض 14،15، وتحديد النهج العلاجي الجديد 15،16. قوة الزرد لدراسة مرض في العضلات الإنسان يتصل عدد كبير من النسل، والتطور السريع للبنية العضلات وظيفة، والوضوح البصري للجنين الزرد، وسهولة التلاعب الجيني والدوائية للحمار وحشي الناميةالأسماك 17.
نحن وآخرون 12،18،19 قد وضعت في الآونة الأخيرة تقنية بسيطة لعزل السريع والفعال للmyofibers من الزرد النامية. وقد مكنت هذه المنهجية في دراسة myofibers بتفصيل أكبر مما يمكن أن تقدمها تحليل الجنين كله. وقد تم استغلال هذه التقنية لتوصيف البروتين توطين التحت خلوية 20 وكذلك لتحديد الخصائص النسيجية هامة كجزء من دراسات التحقق من الصحة في النماذج المطورة حديثا المرض 21. علاوة على ذلك، يمكن بالإضافة إلى ذلك myofibers المعزولة أن تستخدم للتصوير الحي وللدراسات الكهربية 22، التقنيات التي تسمح للاستجواب الجوانب الرئيسية من وظيفة العضلات. بروتوكول محددة لليف عضلي العزلة، جنبا إلى جنب مع اثنين من الأمثلة من التجارب التحليلية اللاحقة، هو مفصل في الأجزاء المتبقية من هذه المخطوطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Coverslips إعداد بولي يسين المغلفة L-(الوقت: 1 ساعة)
coverslips طلاء يسمح لتسوية ليف عضلي السريع والتصاق. هذا يمكن أداؤها أثناء الخطوة تفكك العزلة ليف عضلي (الخطوة 2 أدناه).
- قطع ووضع Parafilm على الجزء السفلي من 60 ملم طبق بتري (أي علامة تجارية).
- وضع زلات غطاء زجاجي المجهر (12 مم) على Parafilm في 60 ملم الأنسجة صحن الثقافة أو وضعها بشكل فردي في الآبار واحد من 24 لوحات جيدة.
ملاحظة 1: هذه coverslips جولة صغيرة تساعد على التركيز أرقام ليف عضلي والحد من استخدام الأجسام المضادة الزائدة.
ملاحظة 2: سوف coverslips غيرها من حجم العمل، ومع ذلك، فإن كميات الكواشف والأجنة المستخدمة هناك حاجة الى تعديلها وفقا لذلك.
- ماصة 50-200 ميكرولتر من بولي-L-يسين حل (0.01٪) على كل غطاء زجاجي في طبق بتري.
- السماح لل coverslips للجلوس واحد على الأقل حواور في 37 درجة مئوية. وسوف تعد حضانات لا تؤثر سلبا النتائج.
- إزالة بولي-L يسين حل من غطاء زجاجي ويغسل مرتين مع حد أدنى من 100 برنامج تلفزيوني 1X ميكرولتر.
- تسمح coverslips لتجف.
- Coverslips هي الآن جاهزة للmyofibers.
ملاحظة 3: لضمان العقم، ويمكن أن يتم طلاء في غطاء وcoverslips على تعقيمها.
ملاحظة 4: حافظ على طبق بتري 60 ملم مع parafilm في القاع. سيتم استخدام هذا الإعداد أثناء ليف عضلي الطلاء وimmunolabeling (في وقت لاحق الخطوات).
البديل 1: بدلا من طلاء coverslips مباشرة قبل الاستخدام، ويمكن استخدام الأوراق المالية ساترة المغلفة. طبق بيتري 60 ملم تحتوي على ما لا يقل عن 2 مل بولي-L-يسين يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية تحتوي على العديد من coverslips. مع هذا البديل بدء في الخطوة 1.5 لمعالجة لل coverslips لmyofibers.
البديل 2: نحن أيضا coverslips معطف في بولي-L-الأورنيثين. Tله أكثر كثيفة العمالة، ولكن من المفيد للزراعة على المدى الطويل لأن coverslips المغلفة بولي-L-الأورنيثين يمكن أن يكون للأشعة فوق البنفسجية المعالجة. مع العلاج بالأشعة فوق البنفسجية وتقنية معقمة حذرا myofibers الحية يمكن عادة أن يستمر في الثقافة من 4-7 أيام.
2. تفكك الزرد الأجنة وتصفيح من Myofibers (الوقت: 1-3 ساعة)
ملاحظة: بروتوكول قياسي ينطبق أفضل ل3 DPF (الإخصاب أيام آخر) الأجنة.
- نقل الأجنة الزرد إلى مستوى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي وإزالة الكثير من أسماك المياه الزائدة وقت ممكن. عادة، 10-20 الأجنة في أنبوب، وإن كان أقل يمكن استخدامها. باستخدام أكثر من 20-25 الأجنة في كثير من الأحيان يؤدي إلى إعداد الكثافة المفرطة.
- إزالة chorions قبل التفكك، يدويا باستخدام ملقط # 5. بدلا من ذلك، ويتحقق إزالة المشيماء الكيميائية مع 10-15 دقيقة Pronase العلاج. عادة، لا بد من إزالة السابقة من المشيمه فقط عند تأكيد مسبق من موتمطلوب النمط الظاهري النمل أو التشكل، أو عند استخدام مراحل حيث يتم فقس الأجنة بشكل طبيعي من المشيماء بهم.
- إضافة 900 ميكرولتر من CO 2 وسائل الإعلام المستقلة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأجنة.
- إضافة 100 ميكرولتر من نوع كولاجيناز الثاني والنهائي تركيز 3.125 ملغ / مل (حل الأسهم في كولاجيناز 31.25 ملغ / مل مخففة في برنامج تلفزيوني 1X) لبدء التفكك. ويمكن أيضا أن تستخدم كولاجيناز الرابع لتفارق.
- تدوير الأجنة على شاكر المداري، ويسحن كل 30 دقيقة في RT باستخدام P1000 Pipetman للسحن.
ملاحظة 2: مراقبة الجنين بعناية التفكك؛ فوق أو تحت التفكك (وخاصة فوق) هي الأسباب الأكثر شيوعا لفشل البروتوكول. سوف تختلف مرات للهضم اعتمادا على شدة سحن، عدد الأجنة في الأنبوب، والعمر الأجنة. كما أنها غالبا ما تكون أقل (بالمقارنة مع أنواع البرية) لأجنة من المسوخ العضلات والهيكل العظمي.
مذكرة3: متوسط زمن الهضم في سن الجنين: 1 DPF = 1 ساعة، 2 DPF = 1.5 ساعة، 3 DPF = 2 ساعة، و 4 DPF = 2-2.5 ساعة.
- وقف الهضم عندما لا الأجنة كلها واضحة، ولكن القطع الصلبة لا تزال مرئية - وهذا أمر ضروري لمنع overdigestion.
- أنابيب الطرد المركزي مع الأجنة فصلها في 0،8-2،3 x ج لمدة 3-5 دقيقة لخلايا بيليه.
- إزالة طاف من الخلايا مكعبات وغسل 2X مع CO 2 وسائل الإعلام المستقلة.
- إضافة جديدة CO 2 وسائل الإعلام المستقلة ل resuspend الخلايا. 1 عادة ما تستخدم لمحضرات مل من 10-20 الأجنة. يمكن تحجيم حجم يعتمد على عدد الأجنة.
- باستخدام ماصة P1000، يمر الجنين تعليق من خلال مرشح 70 ميكرون. هذا يساعد على إزالة الحطام غير المرغوب فيها من الإعدادية.
ملاحظة 4: تعليق الأجنة يمكن أن تتم تصفيته للمرة الثانية خلال مرشح 40 ميكرون إلى مزيد من إزالة الحطام غير المرغوب فيها. من الترشيح المزدوج، والانتعاش هو approximately 800 ميكرولتر من حجم ابتداء من 1 مل.
- إضافة حوالي 50-100 ميكرولتر من ليف عضلي التعليق على كل بولي-L-يسين المغلفة ساترة.
ملاحظة 5: نفذ الخطوة 2.9 في أطباق بتري مع parafilm على الجزء السفلي، الذي أعد سابقا. وParafilm تحافظ على تعليق ليف عضلي من يلوذ بالفرار لل coverslips المغلفة. الحفاظ على أطباق بتري مغطاة لمنع التبخر.
- تسمح myofibers لتسوية ما يقرب من 1 ساعة على لل coverslips المغلفة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة 6: ستبدأ Myofibers لتسوية في غضون 5-10 دقيقة. ومع ذلك، لمرفق ليف عضلي جيد، فمن المستحسن الحد الأدنى من 1 ساعة (1-2 ساعة). وسوف يسمح myofibers لتسوية لفترة أطول لا تضر الإعدادية. للحضانات أطول (بما في ذلك بين عشية وضحاها)، والمضادات الحيوية يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام. مع المضادات الحيوية وتقنية معقمة الثقافات الحية يمكن عادة أن يستمر لمدة 1-2 أيام.
- الحية مyofibers يمكن ملاحظتها عند هذه النقطة. Myofibers من أجنة DPF 2 وبعد ذلك سوف ينظر إليها على أنها خلايا مخططة وممدود (الشكل 1). عند هذه النقطة، myofibers هي الآن جاهزة للتحليل حية أو لimmunolabeling.
ملاحظة 7: العضلات الهيكلية من 1 DPF الأجنة لا لوحة ألياف كما ممدود ومخططة بشكل واضح. بدلا من ذلك، myoballs كبيرة مرئية. بالإضافة إلى ذلك، خلال آخر مرحلة التفكك التكوير (الخطوة 2.6)، 1 DPF بحاجة myoballs إلى أن طرد لمدة لا تقل عن 8 دقائق في 5،000 x ج لتحقيق بيليه. لتحليل الأجنة في هذه المرحلة، فمن المستحسن لاستخدام خط المعدلة وراثيا معربا عن EGFP تحديدا في العضلات والهيكل العظمي 23. وهذا سوف يسمح تحديد الخلايا من أصل العضلات مقابل مصادر أخرى.
3. مضان المناعية من تنفصل الزرد Myofibers (الوقت: حوالي 1 اليوم)
3.1. Immunolabeling
- إزالة جزء منوسائل الإعلام من myofibers انضمت إلى ساترة المغلفة
- إصلاح الخلايا باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ أو الميثانول. لمنهاج العمل، وإزالة ½ حجم وسائل الإعلام واستبدالها مع نفس الكمية من PFA. إصلاح لمدة 10 دقيقة في RT، ثم إزالة الحجم الإجمالي، مع استبدال 50-100 ميكرولتر من PFA، وإصلاح لمدة 10 دقيقة إضافية. يمكن لتثبيت الكحول، والميثانول الجليد الباردة أو الأسيتون تطبيقها في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أو 5 دقائق، على التوالي.
- غسل myofibers ما لا يقل عن 3-5X مع برنامج تلفزيوني 1X أو برنامج تلفزيوني 1X بالإضافة إلى 0.1٪ توين. متوسط حجم غسل هو 50-100 ميكرولتر في ساترة.
- إضافة إلى عرقلة الحل myofibers (الأسهم العمل)، واحتضان 20-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. سوف عرقلة الحل تختلف اعتمادا على الأجسام المضادة الأولية والثانوية. وهما الأكثر شيوعا التي تستخدم في المختبر هي (1) برنامج تلفزيوني 1X، 2 ملغ / مل جيش صرب البوسنة، 1٪ مصل الأغنام، 0.25٪ تريتون X-100 والنهائي (2) 0.2٪ تريتون X-100، 2 ملغ / مل (0.2 ٪ BSA) و 5٪ مصل الأغنام / الماعز.
- إزالة عرقلة الحل وإضافة الأجسام المضادة الأولية مخففة في إما بتأمين حل أو برنامج تلفزيوني. احتضان myofibers بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تأكد إما Parafilm أو التفاف ساران التفاف في طبق بتري تحتوي لل coverslips محملة ليف عضلي المغلفة مع الأجسام المضادة. يمكن إضافة قطع صغيرة من منشفة ورقية مبللة لإنشاء غرفة ترطيب.
- إزالة الأجسام المضادة الأولية من coverslips وغسل coverslips 3-5X لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني أو حل حظر.
- إضافة الأجسام المضادة الثانوية في التركيز المناسب مخففة في برنامج تلفزيوني 1X أو عرقلة الحل لمدة 1-2 ساعة على RT.
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل myofibers 3-5X في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل في RT.
3.2. coverslips تصاعد
- تطبيق 1-2 قطرات من كاشف antifade إلى شريحة المجهر.
- البيك اب بعناية ساترة المغلفة وimmunolabled باستخدام ملقط ومكان (myofibers أسفل) ساترة على كاشف antifade على شريحة المجهر.
ملاحظة 1: الانتباه إلى التوجه للجساترة oated أمر بالغ الأهمية.
- وضع 1-2 Kimwipes على سطح صلب الثابت. عكس بسرعة الشريحة مع لل coverslips المغلفة يستريح على كاشف antifade ووضعه (ساترة لأسفل) على Kimwipes.
- تطبيق الضغط الخفيف إلى زوايا الشريحة المجهر لإزالة antifade الزائدة وتشكيل ختم ضيق بين الشرائح وساترة
- السماح للantifade المتبقية لتجف لمدة 5-10 دقائق على RT، ثم myofibers مستعدون للصورة (أرقام 2A وباء) أو تخزينها في 4 درجة مئوية.
4. خلية الحية التصوير الكالسيوم عن طريق GCaMP3
التجارب الخلية الحية لا يمكن أن يؤديها على myofibers قبل التثبيت (الخطوة التالية 2.10). يصف بروتوكول التالية التصوير الحي في التعبير عن myofibers GCaMP3 24، وهو مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا، التي أعرب عنها العضلات والهيكل العظمي محددة الزرد-α أكتين المروج (pSKM) 23. بدلا من ذلك،هذه التقنية يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام الأصباغ مؤشر الكالسيوم مثل FURA-2.
- حقن الأجنة مع pSKM: GCaMP3 بناء في مرحلة 1-2 خلايا
- في 3 DPF، وجمع اليرقات وإعداد myofibers كما هو موضح في المقاطع 1 و 2. تسمح myofibers الالتزام لمدة لا تقل عن 1 ساعة. لهذه التقنية، مطلوب إعداد coverslips في أطباق 24 أيضا.
- إزالة بعناية أي وسائط الزائدة، وإضافة 300 ميكرولتر من الطازجة CO 2 وسائل الإعلام المستقلة في RT.
- مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب. وينبغي أن تكون إيجابية myofibers GCaMP3 مرئية تحت مضان أخضر.
- إعداد الكاميرا للتسجيل، وإذا رغبت في ذلك.
- يعد حل الكافيين 30 ملم في CO 2 وسائل الإعلام المستقلة. لتحفيز الخلايا، ماصة بلطف 300 ميكرولتر من محلول مادة الكافيين في البئر تحت التكبير. في غضون 5-10 ثانية، ينبغي myofibers إيجابية GCaMP الرد على الكافيين مع الزيادة السريعة في مضان (الشكل 3). Myofibالمتطلبات البيئية قد تعاقد أيضا. من المذكرة، والكافيين يؤدي الى الافراج الكالسيوم من مخازن شبكية الهيولى العضلية 25. غيرها من العوامل، مثل بوكل 26 وryanodine 4، ويمكن استخدامها لدراسة الافراج الكالسيوم محرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
immunolabeling الفلورسنت من myofibers (الشكل 2)
الصور تظهر نمط وضع العلامات الفلورية المتوقعة من myofibers immunostained بعد العزلة الناجحة والطلاء. وقد وصفت myofibers مع أي المضادة للمستقبلات ryanodine (1:100) (الشكل 2A) أو المضادة للα-actinin (1:100) (الشكل 2B) الأجسام المضادة، وتكشف المناعية للثالوث والموجات Z على التوالي. كانت تستخدم الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور 555 (1:500). الصور التي تم التقاطها باستخدام متحد البؤر المجهري.
الافراج الكالسيوم الناجم من ليف عضلي (الشكل 3)
سلسلة لوحة تبين الافراج الكالسيوم ممثل من ليف عضلي معزولة تعامل مع مادة الكافيين. باختصار، تم حقن الأجنة الزرد في مرحلة خلية واحدة مع pSKM: GCaMP3 بناء. في 3 DPF، تم فصل الأجنة ومطلي كما هو موضح في العلاقات العامةotocol. للتحليل، تم اختيار GCaMP3 myofibers معربا، كما يتبين من وجود مضان أخضر في الأساس. باستخدام micropipette لإدارة المخدرات، واستحم الألياف مختارة في حل 30 ملي الكافيين للحث على الإفراج الكالسيوم. وقد بدأ تسجيل الفيديو قبل تطبيق الكافيين واستمرت حتى تم التوصل إلى ذروة مضان. يوضح هذا الرقم العادي الناجم عن الكافيين الافراج الكالسيوم، وهذه التقنية يمكن استخدامها لاستجواب جهاز اقتران الإثارة الانكماش عن طريق التصوير الحي.
الشكل 1. الجدول الزمني التخطيطي من الأجنة التفكك. وحات متتالية (من أعلى إلى أسفل) توضيح الخطوات الفردية، والتوقيت، والمعدات اللازمة لتفارق الجنين. A) اختيار الأجنة لتفارق. شريط مقياس 500 ميكرون. B) Iبركه من الإعداد التفكك. الأجنة في وسائل الإعلام وكولاجيناز في حين يجري بالتناوب حتى فصلها بما فيه الكفاية (خطوة بروتوكول 2) C) صورة كل من تقنيات الطلاء ليف عضلي؛ coverslips مستديرة أو 24 لوحات جيدة (بروتوكول الخطوتين 1 و 4 على التوالي) D) A-حقل مشرق. صورة حية فصلها myofibers الزرد مطلي على بولي-L يسين coverslips المغلفة. سهام دلالة myofibers ممدود من 48 HPF الزرد. مقياس شريط 30 ميكرون.
الشكل 2. Immunolabeling من myofibers الفردية المعزولة من 48 الأجنة الزرد HPF. A) ليف عضلي المسمى مع مستقبلات المضادة للryanodine (RyR1)، وكشف عن نمط النطاقات على طول الألياف يتسق مع التعريب إلى ثالوث / EC جهاز اقتران. ب) ليف عضلي المسمى مع المضادة للα -actinin، visualizin ز التصدعات (الحمراء) على طول ليف عضلي توطين لقسيم عضلي وتسليط الضوء على العصابات Z. في كل الصور، وصفت نوى مع دابي، ينظر إليها على أنها الأشكال البيضاوية زرقاء. إظهار إدراج الصور التكبير أعلى من ليف عضلي في صورة كبيرة. A) وباء) شريط النطاق 30 ميكرون.
الرقم 3. ممثل يسببها استجابة إطلاق الكالسيوم من ليف عضلي الزرد معزولة واحد. إظهار كل اللوحات لليف عضلي الزرد pseudocolored معربا عن GCaMP3. يظهر دوام زيادة مضان GCaMP3 (اللون الأحمر) استجابة لطلب من 30 ملي الكافيين. بدأ تسجيل قبل تطبيق الكافيين (0 مللي ثانية) واستمر في الاستجابة مضان الأقصى (992 ميللي ثانية). مقياس شريط 30 ميكرون.NK "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الزرد هي نظام نموذجي الفقاريات قوية لدراسة تنمية العضلات وظيفة في الجسم الحي 25،27،28. ظهرت أنها أيضا رصيدا قيما لنمذجة أمراض العضلات البشرية 14،15،20،29. بينما اتخذت خطوات كبيرة لتعزيز استخدام وتطبيق الزرد لدراسة وظيفة العضلات وأمراض العضلات، وهناك حاجة ماسة مستمرة لتطوير الأدوات التي من شأنها السماح للمزيد من التحليل المتعمق أن تكمل الجيني والمورفولوجي والسلوكية والوظيفية مزايا الزرد تقدم بالفعل 17. وبالتالي فإننا تكييفها وتطوير تقنية بسيطة وقوية لتوصيف myofibers الزرد من أجنة كاملة فصلها.
استخدام myofibers الفردية هو شائع في الدراسات باستخدام نظام نموذج الفئران. في الفئران وقد سمح هذا للتحقيقات والتحليلات التي هي غير عملي أو مستحيلا في الحيوانات كلها، incluقرع التحت خلوية البروتين توطين يدرس 30، والتصوير الخلية الحية 31، والقياسات الكهربية 32. في الزرد، وتقنيات التفكك مماثلة وضعت في السابق لتحديد على وجه التحديد ودراسة motorneurons 33 وكذلك روهون حية الخلايا العصبية الحسية 34، ومكنت هذه التقنيات تحليل مفصل لهذه الأنواع الفرعية الخلايا العصبية.
وتطبيق واسعة من myofibers معزولة، جنبا إلى جنب مع العديد من المزايا الفريدة يوفر الزرد كنموذج الفقاريات 17، هي ما دفعنا لتطوير تقنية لعزل وتوصيف myofibers الزرد الجنينية واليرقات. لقد استخدمت myofibers المعزولة في الدراسات السابقة لتحديد توطين التحت خلوية من البروتينات في العضلات 20،21، لدراسة توطين الجينات المحورة أعرب chimerically 35 و لتعريف المعلمات ليف عضلي محددة بما في ذلك خصوصا حجم
وقد استخدمت GRABNER وزملاؤه أيضا نظام لليف عضلي نجاحا كبيرا 19،22،36. هم المجموعة الوحيدة أن يقدم زراعة طويلة من الألياف المعزولة. بالإضافة إلى ذلك، أنها كانت قادرة على استخدام الألياف لقياس الخصائص الكهربية من العضلات. على وجه التحديد، فقد اختبرت تأثير فقدان الوحيدات بيتا من مستقبلات ديهيدروبيريدين على اطلاق سراح الكالسيوم وقياس قدرة مجموعة من الجينات المحورة لانقاذ defeسنت في هذا الإصدار. هذه الدراسات إلقاء الضوء على بعض من التطبيقات المحتملة قوية جدا من myofibers معزولة.
مجموعة أخرى أن يقدم استخدام الإعدادية ليف عضلي لدراسة مرض في العضلات هو نيكسون وآخرون الذين استخدموا myofibers لدراسة تأثير morpholino بوساطة caveolin 3 ضربة قاضية على تنمية العضلات وبنية العضلات 18. هؤلاء المؤلفين فحص ليس فقط المعلمات بواسطة المجهر الضوئي، ولكن أيضا درس الألياف باستخدام المجهر الإلكتروني. ويحدد عملهم بعد ميزة أخرى للنظام ليف عضلي معزولة: القدرة على دراسة التركيب الدقيق للليف عضلي في بيئة معزولة والسيطرة عليها.
هذه الدراسات، جنبا إلى جنب مع العمل لدينا، وأشر إلى الفائدة المحتملة واسعة النطاق لهذه التقنية. تطبيقات إضافية من المؤكد أن تكون المتقدمة، مثل قياس ارتفاع الكالسيوم السريع باستخدام مؤشرات مثل FURA-2. بالإضافة إلى ذلك، هذا الإعداد يتيح الفرصة لاملالحظاتلقد النشاط الكهربائي، مثل إمكانات العمل عبر الأصباغ الجهد حساسة (دي-4-ANEPPS) أو تسجيل الكهربية مباشرة. يبدو واضحا أن كل التقنيات الحالية المستخدمة في myofibers الفئران يجب أن تكون قابلة للتطبيق لmyofibers الزرد. بالإضافة إلى ذلك، القدرة على التعبير عن الجينات المحورة المختلفة في الزرد النامية، فضلا عن توافر عدد كبير ومتزايد من الزرد المعدلة وراثيا التعبير عن مختلف البروتينات علامة ( www.zfin.org )، ويضيف طبقة إضافية من التعقيد وتطبيق ل النظام. ونحن لشرح هذه الحقيقة مع myofibers مثقف من GCaMP3 معربا عن الزرد، حيث نستفيد من القدرة على التعبير عن GCaMP3 في العضلات لدراسة التصوير الكالسيوم الناجم في الوقت الحقيقي في الألياف معزولة (الشكل 3).
كما هو الحال مع معظم التقنيات، وهناك أيضا بعض القيود واضحة إلى النظام ليف عضلي معزولة. هذه القضايا هي بالإضافة إلى موقفأوجه القصور ارض دراسة نوع من الخلايا في المختبر الذي يعمل بمثابة syncytia ثلاثية الأبعاد في الجسم الحي وإجراء التجارب الكهربية مع المثيرات nonphysiologic. باستخدام منهجية لدينا، واحدة ليست قادرة على الحصول على إعداد نقية من myofibers. هذه ليست مشكلة بالنسبة المناعية أو القياسات الكهربية، لكنه لا يمنع النهج التجريبي معينة. على سبيل المثال، لدينا حتى الآن لتحديد منهجية مناسبة لتحديد السكان نقية من myofibers لتحليل transcriptomic. حاولنا FACS فرز GFP myofibers معربا عن تليها إعداد ليف عضلي، ولكن هذا لم يؤد إلى ثقافة نقية مع عدد مناسب من myofibers إما RNA أو تحليل البروتين.
تحد آخر هو زراعة على المدى الطويل من myofibers. كنا قادرة على الحفاظ على الثقافات لنحو 24 ساعة، وGRABNER وزملاؤه الإبلاغ عن أنه تم إعداد سويتابلي لأيام متعددة من التجريب 19. التحدي المرتبطة بهذا الجانب من تقنية تمنع التلوث، وهذه الثقافات (مثل الكثير من محضرات ليف عضلي الفئران) غالبا ما تكون صعبة للحفاظ على العقيمة. هناك حاجة إلى عناية كبيرة إذا أراد المرء أن يحاول الثقافات لفترات طويلة. نوصي أيضا استخدام مضادات الجراثيم بما في ذلك مضادات الفطريات.
في كل شيء، ونحن لشرح طريقة عملية لعزل myofibers الزرد وكذلك كيفية تنفيذ مخطط immunolabeling الفلورسنت والتصوير الكالسيوم في الوقت الحقيقي على الاستعدادات الألياف المعزولة. سوف المستمرة تعديل وتطوير هذه التقنية توفر ذخيرة الآخذة في التوسع من الأدوات لتجربة على، أنواع الخلايا معزولة محددة في الزرد. قبل الانفصال الأجنة الزرد في myofibers الفردية المعزولة، يمكننا تعزيز فهمنا لتنمية العضلات، وظيفة والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي تضارب المصالح.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر أعضاء المختبر داولنغ (آرون Reifler، ترينت وو، أنجيلا بوستا، ويليام تيلفر) التي ساهمت في تطوير تقنية وإنتاج المخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد توبمان، وقسم طب الأطفال في جامعة ميشيغان، وفي جزء من المنح المقدمة من جمعية الضمور العضلي (JJD MDA186999) والمعاهد الوطنية للصحة (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
References
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).
- Ohno, K. Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction. Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).
- Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Barresi, R., Campbell, K. P. Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease. J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).
- Emery, A. E. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey. Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).
- Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. Congenital myopathies: an update. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).
- Bassett, D. I., Currie, P. D. The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy. Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).
- Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2009).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).
- Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Nixon, S. J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).
- Schredelseker, J., et al. The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy. Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).
- Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit. J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhou, W., et al. Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants. Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).
- Hirata, H., et al. accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1. Development. 131, 5457-5468 (2004).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).
- Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 564, 451-464 (2005).
- Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs. Nature. 346, (1990).
- Sakowski, S. A., et al. A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture. J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).
- Nakano, Y., et al. Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation. Development. 137, 1689-1698 (2010).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).
