הערכה של ריקון קיבה בעכברים סוכרתיים ללא שימוש בשמנים [ Published: March 23, 2013 doi: 10.3791/50301

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Christopher T. Creedon¹, Pieter-Jan Verhulst¹, Kyoung M. Choi¹, Jessica E. Mason¹, David R. Linden¹, Joseph H. Szurszewski¹, Simon J. Gibbons¹, Gianrico Farrugia¹

¹Enteric Neuroscience Program, Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

Summary

קביעת ריקון קיבה עם לא פולשנית [

Abstract

מחקרי ריקון קיבה בעכברים היו מוגבלים על ידי חוסר היכולת לעקוב אחר שינויי ריקון קיבה באותה בעלי החיים מאז הטכניקות הנפוצות ביותר דורשות הרג של בעלי החיים וההתאוששות שלאחר מוות של ^1,2 ארוחה. גישה זו מונעת מחקרים ארוכים טווח על מנת לקבוע שינויים בהתרוקנות קיבה עם גיל והתפתחות המחלה. שימוש נפוץ ^[13 C]-octanoic בדיקת נשימת חומצה לבני אדם ³ כבר שונה לשימוש בעכברים וחולדות ^{4-6 7} והראינו בעבר כי המבחן הזה הוא אמין ומגיב לשינויים בהתרוקנות קיבה בתגובה לתרופות ובמהלך התקדמות מחלה סוכרתית ^8. במצגת וידאו זה העיקרון והיישום מעשי של מבחן שונה זה הסביר. כמו במחקר הקודם, עכברי NOD LtJ משמשים, מודל מהסוג 1 ⁹ סוכרת. חלקם של עכברים אלו מפתחים תסמינים של gastroparesis, סיבוך של diabetes מאופיין על ידי עיכוב בהתרוקנות קיבה ללא חסימה מכאנית של הקיבה ^10.

מסמך זה מדגים כיצד לאמן את העכברים לבדיקה, כיצד להכין את ארוחת מבחן ולקבל נתוני 4 hr קיבה מרוקנת וכיצד לנתח את הנתונים שהתקבלו. מנתח איזוטופ פחמן השתמש במחקר הנוכחי הוא מתאים לדגימה האוטומטית של דגימות אוויר מהמרחק של עד 12 עכברים באותו הזמן. טכניקה זו מאפשרת אורך מעקב של ריקון קיבה מקבוצות גדולות של עכברים הסובלים מסוכרת או מחלות אחרות כבר שנים רבות.

Introduction

כתב יד זה מתאר את השיקולים הטכניים ומתודולוגי מעורבים במדידה לא פולשנית של ריקון קיבה בעכברים. על ידי ביצוע הפרוטוקול מתואר כאן, חוקרים יכולים לעקוב באופן מהימן וreproducibly שינויים בקיבה מרוקנת בשל התפתחות המחלה, ללמוד את ההשפעה של סוכנים תרופתיים בהתרוקנות קיבה ובצע את התגובה של ריקון קיבה לטיפול במחלות או מומי ^{6,8 בסיסיות, 11,12.} בפרסומים קודמים, היישום של ¹³ C מבחני נשימה octanoic חומצה הוצג להיות דרך יעילה למדידת ריקון קיבה בבני אדם ובעלי חי ^3,8. מאמר זה מתאר בפירוט, לצעדים הדרושים כדי להשיג נתונים אמינים על 6-8 חודשים דרושים למחקר אורך של ריקון קיבה בעכברים עם סוכרת. היתרונות של ביצוע פרוטוקול זה בהשוואה לשיטות שפורסמו בעבר הם שהחוקר יכול להיות סמוך ובטוח הנתונים obtaineד יהיה אמין ושחזור. בנוסף, המערכת האוטומטית לאיסוף והניתוח של דגימות הגז שתוארה כאן מגדיל את מספר בעלי החיים שניתן בעקבותיו זמנית במחקר. בסך הכל, המטרה של מאמר זה היא לזהות את גורמי המפתח ששומרים התרגלות של העכברים לבדיקה וכי הפחתת שונות בתוצאות שהתקבלו.

למדידה בvivo של ריקון קיבה, עכברים הם צמים לילה והכניסו לתוך תאי בדיקת הפלסטיק השקופים עם זרימת אוויר קבועה. לאחר שהעכברים מקבלים מורגלים לחצוצרות, נקודת פתיחת נשף ¹³ CO ₂ רמות נחושות וזרימת אוויר בהתאם. בשלב בא, ואנחנו נותנים ארוחת מבחן המורכב מחלמון ביצה מעורבבת עם octanoic ¹³ חומצה ג שכותרתו. מאחר שהעכברים הם צמו ומאומנים, הם בדרך כלל אוכלים את ארוחת מבחן בתוך 2 דקות. octanoic החומצה מנוהלת לא נספגה בבטן, אבל תילקח בתריסריוןד יקבל חילוף חומרים בכבד ^ל13 CO _2, אשר שוחרר ונשף, וכתוצאה מהעשרה של ¹³ CO ₂ באוויר שמסביב. דגימות אוויר נאספות במרווחי זמן שנקבעו והם נותחו על ידי מנתח איזוטופ פחמן. צעד שער ההגבלה בכל התהליך הזה הוא ריקון קיבה ואת הפרשת הריאה של ¹³ CO ₂ ישירות מתכתב עם ריקון קיבה של הארוחה המסומנת.

איור 1. סכמטי של מנגנון ריקון קיבה. לאחר צום בן לילה, עכברים ממוקמים בתאים שקופים המאפשרים להם לנוע ולהפוך באופן חופשי. צינור יניקה מאפשר זרימת אוויר צחה ומתמדת ושקע מוביל למנתח איזוטופ למדוד ¹³ C-ל- ¹²יחס C בנשיפה. הקאמרי יש גם יציאה מרכזית למשלוח של מזון המכיל ^[13 C]-octanoic חומצה.

Protocol

1. הדרכה והרגלה של העכברים

1. לפני הניתוח, שם את כל העכברים בתאי הבדיקה עבור 2-4 שעות עם זרימת אוויר קבועה כדי להרגיל אותם לתנאי הבדיקה. זה משמעותי מפחית את רמות לחץ שעלול לגרום לזיהוי חריג של עיכוב בהתרוקנות קיבה. פנק את העכברים באותו אופן כאילו ניסוי ריקון הקיבה היה פועל. הכן את חלמון ביצה (ראה עוד) מבלי להוסיף octanoic חומצה ולהאכיל 0.2 גרם לכל עכבר.
2. חזור על תהליך זה עד לעכברים מאומנים במידה מספקת (בדרך כלל 2-3 פעמים). העכברים בדרך כלל הם מורגלים בקלות, כל עוד התנאים הסביבתיים נשמרים אותו הדבר.

הערה: עכברים ללא מורגלים ימשיכו לנוע סביב כ 1 שעות לאחר העברה לתא, ולחרבן ולהשתין בתדירות גבוהה, ואילו עכברים מורגלים להסתפק במהירות בסביבה החדשה שלהם והמנוחה בשקט.

לאטה: במהלך הניסוי: בעלי חיים לפקח על סימנים של אובדן של התרגלות כגון הטלת שתן עודפת, עשיית צרכימים, חוסר העניין באכילת הביצה. אם זה מקרה לשקול מחדש הרגלה במחסנית ריקה לפני 1-2 פעמים לקבלת נתוני התרוקנות קיבה. עקביות היא חשובה מאוד בזמן ביצוע ניסוי זה. לעשות דברים באותו אופן בדיוק בכל פעם שהיא הדרך היחידה להשיג תוצאות מהימנות ושחזור. זה כולל מתן טיפול (למשל אינסולין) בכל יום באותו הזמן, ולא להפריד את העכברים מ- חבריהם לכלוב שלהם אלא אם כן הכרחית, צום העכברים ותחילת בדיקת ריקון הקיבה באותו הזמן, וטיפול בעכברים באותה הדרך.

2. הכנת ארוחה המכיל איזוטופ מבחן

1. התחל עם המשקל מתוך 5 גרמו חלמון ביצה בצינור 50 מ"ל בז. חזור על שלבים אלה בכל יום ניסיוני להכין ארוחת מבחן טריה.
2. הוסף 10 μl של octanoic חומצה עם concentration של 2 μl / g לצינור המכיל 50 המ"ל הבז ביצה ומערבב נמרצות ל1 דקות עם מרית בצינור הבז.
3. אז הביצה מועברת לכוס זכוכית ומחוממת מעל מבער בונזן עד שcoagulates והעקביות שלו היא מתאימה כדי להפוך את כדורים קטנים. זה בדרך כלל לוקח בערך 30 שניות.

הערה: כדורי חלמון ביצה צריכים לשקול 0.2 גרמו לעכבר. זה חשוב כדי לשמור על המינון מצטבר מתמיד בכל העכברים.

3. החל הניסוי

1. אחרי הכשרה ומוכן לריקון קיבה, מהיר עכברי הלילה (12 שעות) על "רשת בתחתית" מדף צום מתכת כדי למנוע אכילת צואה. ודא שיש להם גישה חופשיה למי שתייה. מאז עכברים סוכרתיים נמצאים בשימוש בניסוי הנוכחי, הם לא צריכים להיות צמו במשך יותר מ 16 שעות.
2. התחל על ידי הקמת תאי התרוקנות הקיבה. השתמש בתאים נקיים וכיסויים שהיו באוויר יבש. כמו כן, כלצינורות המחברים את התאים למנתח או אספקת אוויר CO ₂ צריכים להיות לחות חופשיות; מים יכולים להפריע לאות לקרוא על ידי המנתח
3. חבור את התאים לצינורות היניקה המספקים זרימת אוויר קבועה. ואז לחבר את הצינורות העודפים מהתאים למכונה. סגור את הצינורות ולהפעיל את זרימת האוויר.

הערה: למרוח כמות קטנה מאוד של וזלין בסוף מכסי הכיסוי אז הם סוגרים בקלות ובאופן מאובטח האטומים. חותם חזק זה נחוץ כדי לאסוף את כל הפחמן הדו חמצני המיוצר על ידי העכברים.

4. פרוצדורות

1. התחל על ידי שקילה כל עכבר. משקל גוף הוא מדד לבריאות הטובה המתמשכת שלהם. ואז למקם כל עכבר בתא המתאים. זה כמובן חשוב שהאוויר זורם לתוך התאים בשלב זה.
2. כדי להתחיל את המדידה, לאפשר לעכברים להסתגל לתאים להסתגל לפניing רמות האוויר.
3. ברגע שהעכברים להיראות רגועים, שעשוי לקחת כמה דקות, להתאים את קצב זרימת אוויר לכל אחד מתאי עכבר. זה עשוי להיות שונה עבור כל עכבר. בדרך כלל, את זרימת האוויר מותאמת בתחילת הניסוי, כדי לוודא שנשף CO ₂ מגיע לרמות ניתנות לזיהוי על ידי כל ציוד נמצא בשימוש, וכדי לוודא שהרמה נשארת נמוכה מספיק כדי להבטיח תחלופת אוויר בריאה. אנו משתמשים ₂ רמות CO ראשוניות בין 1000 ו 1500 חלקים למ'.
4. אם נתקל בקשיים עם התאמות, לבדוק דליפות אוויר. ואז לחזור על התהליך עבור כל אחד מהתאים ולצפות לעוד סיבוב של מדידות כדי לראות אם התאמות שבוצעו לזרימת אוויר תקנו את רמת ₂ CO. חשוב לקבל בסיס יציב לקרוא לפני האכלת העכברים. אנו משתמשים במכונה עם תכונת כיול עצמית. אם זה לא מקרה הכיול צריך להיות מסומן.
5. כאשר זו מושגת, לנהל את ארוחת ביצהלעכבר ולרשומה הראשון הזמן כל עכבר מקבל את המזון.
6. אנו מפעילים נוהל 4 שעות כדי להשיג מספיק ערכים להתאמה עקומת ¹³ CO ₂ העשרה לכל עכבר. בדקו על עכברים בכל 30-60 דקות כדי לוודא שאת ₂ רמות CO עדיין בטוחות לעכברים.
7. הכן את התיבות חדשות המכילות מזון לפני סוף המבחן, כך שהעכברים יכולים להתחיל לאכול מייד אחרי הבדיקה היא למעלה.

Representative Results

נתונים יציגים נקבעו משלושה עכברים שונים מוצגים באיור 2. הגרף השחור מייצג את נקודתי נתונים מעכבר עם התרוקנות קיבה תקינה. זה מראה את החלק היחסי של ¹³ C שהוא התאושש באוויר הננשף המבוטאים כאחוז של המינון מנוהל לשעה הביע כפונקציה של זמן. העקומה הכחולה היא מעכבר עם קיבה מואצת רוקן עם ערך 1/2 T של 40 דקות והעקומה האדומה הוא מעכבר עם ריקון קיבה מעוכבת בשווי 1/2 T של 168 דקות. כפי שנקבע במחקר קודם ^ב7 המעבדה שלנו, במחצית זמן הקיבה הרגילה לרוקן גיל עכבר NOD הלא סוכרתי 9-15 שבועות טווחים 62-131 דקות כפי שהוא מיוצג על ידי התיבה האפורה. נקודתי הנתונים אז מצוידות על ידי עקומת רגרסיה שאינה ליניארי עם המשוואה הבאה: ⁸

y = ^{b בדואר ct}

איפה y הוא האחוז (1 T _{/ 2)}

מחושב מהליך אינטגרציה נומרית באמצעות פונקציית גמא הפוכה. יש לנו להשיג תוצאות מכמה אלף מחקרים בשונות תוך עכבר ביולוגיים של כ 10%.

איור 2. נתונים מייצגים ריקון קיבה משלושה עכברים שונים עם נורמלי (עקום שחור), עכבו (עקומה אדומה) ו( עקומה כחולה) מואצת קיבת התרוקנות. התיבה האפורה מדגישים ערכים נורמלים. המשוואה של עקומות רגרסיה שאינן ליניארי מוצגת בתיבה.

Discussion

הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת חוזר ובלתי פולשנית למדידת vivo של ריקון קיבה המוצקה בעכברים. במערכת זו יש יתרון בכך שבעלי החיים אינם מרוסנים בתא המדידה, המאפשרת להם לנוע בחופשיות ולהפוך. מכיוון שזו סביבה לא מוכרת, העכברים עדיין צריכים להיות מאומנים ומורגל לתאי הבדיקות כדי למנוע תופעות של לחץ בהתרוקנות קיבה. באופן כללי, אנו מניחים את נתוני ריקון הקיבה הם אמינים אם שונות התוך העכבר בין בדיקות רצופות קיבה מרוקנת הן פחות מ 10%.

דו"ח זה הוא תיאור מפורט יותר של הדוחות הקודמים שלנו על מדידות ריקון קיבה בעכברים ^8,11,12 וכולל מידע נוסף על בעיות לפתרון בעיות עם המערכת. השינוי העיקרי הוא השימוש במנתח איזוטופ LGR לרמות גז מדידה. המנתח השתמשנו במחקר הנוכחי מודד ¹² CO 13 CO _2, ו-H ₂ O ריכוזים בכל שנייה. את השסתומים בשליטת המחשב ביחידת הקלט מרובה לעבור באופן אוטומטי לזרימת הגלאי בין תאי עכבר בכל 25 שניות. לכן 12 עכברים יכולים להיות מנותחים בו זמנית עם מרווח 5 דקות בין קריאות. יש לציין כי נתונים יכולים גם להיות מושגת על ידי דגימה ידנית של האוויר הננשף וניתוח שלאחר מכן. אם באופן ידני או באמצעות דגימת מכשיר אחר, ודא קריאות מתקבלות בכ 10 דקות במרווחים. הרגישות של המערכת שלנו ואת תדירות איסוף דגימה אומרת שעקומות ריקון הקיבה הן אמינות יותר, קלות יותר להתאים וכך גילינו שאנחנו מקבלים נתונים לשעתק יותר עם השיטה המשופרת הזה.

החסרונות העיקריים בטכניקה זו מתרחשים כאשר העכברים לא מצליחין לאכול את הארוחה בתוך הזמן המוקצב, כאשר העכברים לאבד התרגלותם לתא ובו בעיות טכניות להתעורר עם זיהוי sysTEM. כישלון לאכול ארוחה ואובדן של התרגלות הוא בדרך כלל תוצאה של לא לאחר השלב הקריטי שיש לוח זמנים קבוע לבדיקה. לאחר 3 בדיקות רצופות מופרדות על ידי 7 ימים או פחות, העכברים שלנו הורגלו למבחן ולאכול ארוחה. הורגל פעם, נתונים אמינים מתקבלים אם העכברים נבדקו לפחות פעם אחת כל שבועות 2 לשארית של הניסוי. אם מסיבה כלשהי את העכברים לא נבדקו במשך 3 שבועות או יותר אז שתי אימונים בתוך שבוע בדרך כלל להבטיח הרגלה. אם האנשים שמטפלים בבעלי החיים ולאחר מכן לשנות את ההסבה של העכברים מומלצות וחשוב במיוחד כדי להרתיע שימוש בסבונים ריחניים חזק ו / או בשמים על ידי אנשים שמטפלים בעכברים. קשיים עם מערכת האיתור הם לעתים קרובות בשל הרמות הנמוכות של ^13-CO ₂ שנוצר על ידי בעלי חיים קטנים כמו עכבר. הגלאי יש לכייל ולגלאים מסוימים כגון מערכות מבוססות אינפרא אדום, זה מאוד שובבortant להפחתת תכולת מים של המדגם למינימום לפני מדידות.

ישנן מספר מגבלות לטכניקה זו, אלא אם כן החוקר מבקש ללמוד ריקון קיבה בתדירות גבוהה יותר מפעם אחת בכל 3 ימים באותו העכבר. זה לא מומלץ לצום עכבר לעתים קרובות כל כך והגבלה תזונתית כגון על בסיס קבוע יכולה לשנות את תפקוד קיבה. שינויים שבוצעו בטכניקה יכולים להתבצע למדוד ריקון קיבה הנוזלי ושהוא יישום פוטנציאל שימושי של השיטה.

שיטות אחרות למדידת ריקון קיבה, כוללים מיפוי או מדידה נשמרות תוכן לאחר זמן קבוע יש יותר מגבלות משמעותיות, כולל בעיות עם הלחץ של התהליך או בשל הצורך להרוג את בעל החיים בסוף כל אחת מבדיקות. לחצים כוללים gavage של ארוחת מבחן או ריסון של בעלי החיים בזמן המדידה. יתרונותיה של בדיקת הנשימה הם שהעכבר נע בחופשיות ולא הרדיםאו מסומם בכל דרך.

לסיכום, ¹³ בדיקת נשימת חומצת C-octanoic מאפשרת הלימוד של התקדמות מחלה עם גיל וטיפול והנתונים האלה אז יכול להיות מתואם עם שינויים בפרמטרים פיסיולוגיים אחרים והערכה היסטולוגית באותו בעל חיים. בין יישומים אחרים, הבדיקה מאפשרת גם מחקר של כמה תרופות יכולות לשנות את התרוקנות קיבה ישירות, כמו גם חוקר את התגובה לטיפול בבעלי חיים המפתחים שינויים בהתרוקנות קיבה עקב מחלה או התערבות אחרת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A source of constant air-supply, flow as well as composition	central air supply in the research facility
130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply	In-house built
Octanoic acid	Cambridge isotope laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
To prepare the egg meal: small beaker 50 ml plastic tube Bunsen burner egg spatula	Any supplier		Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal
Carbon dioxide isotope analyzer	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)