Summary
Die Karzinogenese ist ein Prozess, der Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Krebs Mikroumgebung. Um die molekularen Ereignisse sezieren, muss man verschiedenen Zellpopulationen in verschiedenen Stadien während der Entwicklung von Krebs zu isolieren. Mit einem Maus-Modell für Basalzellkarzinom, beschreiben wir ein Protokoll für die Zell-Analysen bei der Krebsentstehung.
Abstract
Krebs ist eine Entwicklung mehrstufigen Prozess mit vielen Zelltypen, einschließlich Krebs-Vorläuferzellen, Immunzellen, Fibroblasten und Endothelzellen. Jede Art von Zellen erfährt Signalisierung und funktionelle Veränderungen bei der Krebsentstehung. Die aktuelle Herausforderung für viele Krebs-Forscher ist es, diese Änderungen in jeden Zelltyp während des mehrstufigen Prozess in vivo zu sezieren. In den letzten Jahren haben die Autoren eine Reihe von Verfahren, um unterschiedliche Zellpopulationen während Hautkrebs Entwicklung mit K14creER/R26-SmoM2 YFP Mäusen isolieren entwickelt. Das Verfahren wird in 6 Teile aufgeteilt: 1) Erzeugen geeigneter Mäusen der Studie (K14creER + und R26-SmoM2 YFP + Mäusen in diesem Protokoll), 2) Induzieren SmoM2 YFP-Expression in der Haut von Mäusen, 3) Herstellung von Maus Hautbiopsie, 4) Isolieren Epidermis der Haut; 5) Herstellen einzelner Zellen aus Epidermis, 6) Kennzeichnung einzelne Zellpopulationen für die Durchflusszytometrie-Analyse.Erzeugung ausreichender Anzahl der Mäuse mit der rechten Genotyp ist der limitierende Schritt in diesem Protokoll, das kann bis zu zwei Monaten. Der Rest der Schritte zu unternehmen, ein paar Stunden bis zu einigen Tagen. In diesem Protokoll haben wir auch einen Abschnitt zur Fehlerbehebung. Obwohl wir uns auf Hautkrebs, kann dieses Protokoll modifiziert, um für andere Tiermodelle menschlicher Krankheiten anzuwenden.
Introduction
Als häufigste Form von Krebs beim Menschen wirkt Basalzellkarzinom (BCC) über 2 Millionen Amerikaner pro Jahr 1. Es gibt zunehmend Hinweise zeigen, dass abnorme Aktivierung von Hedgehog (Hh)-Signalisierung ist die treibende Kraft zugrunde BCC Entwicklung (Bewertet in 2,3). Veränderungen der Hh-Signalgebung in BCCs gehören inaktivierende Mutationen des PTCH1 4-6, gain-of-function Mutationen SMO 7-9 und aberrante Expression von Hh Weg Transkriptionsfaktoren GLI1 10 und 11 GLI2 oder seltene Mutationen inaktiviert negativer Regulator von Su (Fu ) 12. Durch all diese und andere Studien, hat Federal Drug Administration (FDA) hat vor kurzem die Verwendung von Hh-Signal-Inhibitor zur Behandlung von metastasierendem Vismodegib und lokal fortgeschrittenem BCCs 13-15 zugelassen.
Trotz all dieser Erfolge 16, haben wir noch nicht verstehen, die molekularen und zellulären Mechanismen, durch die das Hh-Signal treibt carcinogenesis. Etablierung von Tiermodellen mit Gewebe-spezifische Aktivierung des Hh-Signal ist immer noch für diese Studien und für unser Verständnis von Resistenzen wichtig. Bei Mäusen weiß Wildtyp-Mäusen nicht entwickeln BCCs, auch unter hoher Dosen von Karzinogene, UV oder ionisierende Strahlung. Im Gegensatz dazu Ptch1 + / - Mäuse sind anfällig für BCC Entwicklung 17,18. Die Penetranz der BCC Entwicklung in Ptch1 + / - Mäusen über 50%, obwohl Ptch1 18,19 + / - Mäuse selten entwickeln ausgewachsenen BCCs wenn unter normalen Bedingungen gehalten. Aufgrund der embryonalen Letalität Ptch1 - / - wird gewebespezifischen Knockout von PTCH1 allgemein zur Untersuchung 20 verwendet. Darüber hinaus bedingten Haut-spezifische Expression der onkogenen SmoM2 YFP (KRT14-Creer: R26-SmoM2 YFP: R26-SmoM2 YFP oder KRT14-cre) führt zur Bildung von mehreren mikroskopischen BCCs in einem sehr frühen Alter, das einen einfachen genetischen Test für Hh-Signal zu tunwnstream von SMO 21.
Es gibt drei wichtige Fragen in unserem Wissen über BCC Biologie. Erstens ist die zelluläre Herkunft des BCCs nicht ganz klar. Während einige Studien unterstützen die von Haarfollikel rühren als Stammzell-Website 22-24, Youssef et al. Den 25 lokalisiert Mäusezelllinie der Herkunft der kutanen Hh-driven Tumoren in der inter-follikulären Epidermis Region sein, nicht in den Haarfollikel , mit zellspezifischen Cre die Expression eines ROSA26 angetriebenen transgene mutante SMO zu aktivieren. Zweitens zellulären Interaktionen während BCC Entwicklung sind nicht gut verstanden. Es ist bekannt, dass Keratinozyten mit aktiviertem Hh-Signal kann zur Bildung von BCCs führen, aber auch andere zelluläre Veränderungen sind nicht gut verstanden. Darüber hinaus kann die Behandlung von Smo-Antagonisten bei Mäusen zu Resistenzen führen 26-28. So neue Targets für BCC werden dringend benötigt. Das Verständnis dieser drei Fragen erfordert Analysen der zellulären Veränderungen in Mäusen während carcinogenesis. Während mehrere Methoden zur Keratinocytenkultur, Durchflusszytometrie und Haut Stammzellisolation 29-31 veröffentlicht wurden, gibt es noch keine umfassenden Verfahren für Zellanalysen in Maus BCCs. Durch die Kombination von Methoden für die Maus-Modell der BCCs, Trennung der Epidermis, die Erzeugung von einzelnen Zellen aus Geweben und Zellen analysiert, werden wir Leser mit einer Reihe von Verfahren bereitzustellen, um Zellkommunikation, zellulären und molekularen Interaktionen während BCC Entwicklung zu studieren. Wir glauben, dass dieses Protokoll wird dem Leser, um zu sehen, wie die einzelnen Verfahren erreicht wird. Darüber hinaus stellten wir einige Daten zu veranschaulichen, was die Ergebnisse aussehen sollte und Fehlerbehebung, um den Lesern zu Schwierigkeiten bei der Durchführung dieser Verfahren zu überwinden.
Protocol
Diese Studie wurde von der IACUC Ausschuss an der Indiana University School of Medicine genehmigt.
1. Generieren Mäuse mit den richtigen Genotypen
- Stellen Sie eine Maus-Modell der BCC. Mate-K14-Creer Mäuse (Jackson Labor stock Nummer 005107) mit R26-SmoM2 YFP Mäusen (Jackson Labor stock Nummer 005130) (18) zu erzeugen, K14-Creer + und R26-SmoM2 YFP + Mäusen.
- Führen Genotypisierung. Tauchen Schwanz Proben (0,5 cm lang) in DirectPCR Schwanz Lyse-Lösung mit 1 mg / ml Proteinase K bei 55 ° C über Nacht unter Schütteln. Am nächsten Tag entfernen Gewebedebris durch Zentrifugation bei Höchstgeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge (um den Überstand für die Genotypisierung zu halten). Verwenden Sie 1 ul der Überstand für jede PCR-Reaktion mit den Primern und Bedingungen vom Verkäufer empfohlen. Wählen Sie die Mäuse mit den richtigen Genotypen (im Alter von 3-6 Wochen, Buprenorphin bei 0,05-0,1 mg / kg wird über jeden SQ 8-12 h für 2-3 Tage nach Schwanz snip angewendet werden) for Schritt 2.
2. Induce Expression von SmoM2 in Hautkeratinozyten
Induce SmoM2 Expression in Keratinozyten durch orale Gabe von Tamoxifen (5 ug / kg Körpergewicht in 50 ml Pflanzenöl in jeder Fütterung) an 5 aufeinander folgenden Tagen per Magensonde mit einer Fütterung Nadel (20 Gauge gekrümmt).
3. Vorbereiten Hautproben
Im Allgemeinen sind die Phänotypen schwereren am Ohr und Schwanz in K14creER/R26SmoM2 GFP-Mäusen. Um für die Zell-Analysen vorzubereiten, haben wir zunächst ernten die Maus Haut nach Tieropfer mit einem institutionellen genehmigten Verfahren (CO 2 plus Genickbruch).
4. Isolieren Epidermis
- Nach der Tötung Mäuse mit einem genehmigten Verfahren (siehe Schritt 3), zu entfernen Fell mit einem Trimmer. Tauchen Hautproben in Dispase-Lösung (5 mg / ml in DMEM mit 10% FBS) bei 37 ° C für 1-2 h (1 h bei Mäusen weniger als 8 Wochen alt und 2 hfür Mäuse alt als 8 Wochen).
- Nach Dispase Behandlung, separate Epidermis Dermis von Pinzette.
5. Generieren Einzelzellen
- Um einzelne Zell-Population zu erhalten, Hackfleisch Epidermis durch Schere und dann eintauchen in Collagenase IV-Lösung (1 mg / ml in DMEM mit 10% FBS) für 1-2 Stunden bei 37 ° C in einer 50 ml Tube. Versuchen Sie, schwenken Sie die Rohre alle 20 min zu Zelle Dissoziation helfen.
- Untersuchen Zelle Dissoziation unter dem Mikroskop. Wenn einzelne Zellen in der Kollagenase Medium detektiert werden kann, Inkubieren der Probe für weitere 30 min, um die Zellausbeute zu erhöhen. Im Allgemeinen kann die Epidermis von einer Maus Ausbeute bis zu 10 7-Zellen.
- Filtern Sie die Mischung durch Gewebe Zellsieb (Porengröße 70 um), Spin-Zellen nach unten bei 1500 rpm über Tischgerät Zentrifugation und waschen einmal Zeit mit PBS.
6. Label-Cells und Führen Durchflusszytometrie Analysen
- Die Zellen in 10% FBSin PBS mit 2,5 × 10 6 Zellen / ml, um die unspezifische Bindung zu blockieren (auf Eis für 30 min)
- Nehmen Sie ein Aliquot der Zellen zu je 1,5 ml Reaktionsgefäße für bestimmte Antikörpermarkierung. In verschiedenen Antikörpern in jedes Röhrchen in einer Endkonzentration von 2 ug / ml. Mix Antikörper mit Zellen über eine sanfte Vertex für einige Sekunden und lassen Sie sie auf Eis für 30 min, dann waschen mit 1 ml PBS. Für BCC Proben verwendeten wir die Antikörper für folgenden Biomarker: CD11b-PE sowie GR1-APC (myeloischen Zellen oder myeloiden abgeleitete Suppressor-Zellen); Vimentin-FITC (Fibroblasten) (siehe Reagenzien für Details).
- Zur intrazellulären Färbung, verwenden wir ein Kit und folgen Sie der Hersteller-Handbuches (siehe Reagenzien für Details). Wir verwenden frische Zellen Zelloberflächenmarker analysieren. Nach Oberfläche Marker Färbung, waschen Sie die Zellen, und resuspendieren sie in PBS. In DAPI dem Zellgemisch in einer Endkonzentration von 1 ug / ml. DAPI färbt tote Zellen, die ausgeblendet sein wird von der weiteren Analysen.
- Analysieren Sie die Daten mit speziellc Software. Wir wählen Sie zunächst einzelne Zellen auf der Basis der FSC gegen SSC Plot, und verwenden DAPI negativen Population (live-Zellen) zur weiteren Analyse.
Representative Results
Es ist bekannt, dass Mäuse nicht entwickeln Basalzellkarzinomen außer mit Hh Signal-Aktivierung. Abbildung 1 zeigt die Haut nach Phänotyp induziert die Expression der onkogenen geglättet, SmoM2 YFP. Abbildung 2 Analyse von myeloischen Zellen in normalen und Tumor-tragenden Mäusen zeigt. CD11b + Gr1 + Zellen aus Knochenmarkszellen stammen, und einige von ihnen abgeleitet Suppressorzellen myeloischen. In der normalen Situation, die CD11b + + Gr1 Zellpopulation kaum nachweisbar, wird aber in Reaktion auf eine Entzündung oder Tumor-Entwicklung zu erhöhen. Wir zeigten, dass die induzierte Expression von SmoM2YFP in Haut führt zu einer Erhöhung der CD11b + Gr1 + Zellen. Derzeit sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen diese Änderung in BCCs nicht klar.
Abbildung 1. Morphological Änderungen nach SmoM2YFP Induktion in der Haut von Mäusen. Die obere zeigt ein Diagramm der Maus Genotypen. Das mittlere Feld: die K14creER + und R26-SmoM2 YFP + Maus mit Tamoxifen behandelt wurden, zeigten grob Anomalie in der Haut (rechts) sowie Haut-Tumoren in der H & E Bereich (links). Die untere Platte: die Maus ohne SmoM2YFP Induktion zeigten normale aussehende Haut (rechts) und keine abnorme Morphologie in der H & E Bereich (links).
Abbildung 2. Flow-Analyse der CD11b + Gr1 + Zellen. Um die Änderung von CD11b + Gr1 + Zellen während der Entwicklung von Hautkrebs untersuchen, isolierten wir Einzelzellen und gefärbt mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen CD11b und Gr1. Nach der Analyse mit FlowJo, bemerkten wir einen Anstieg dieser Zellpopulation in Hautgewebe von Tamoxifen-behandelten Mäusen.
Discussion
Wir haben ein Verfahren zur Analyse Zellpopulation in BCCs beschrieben. Tumorgewebe sind konsistent vieler Zelltypen und jeder Zelltyp verhält sich anders zu einem bestimmten Zeitpunkt der Krebsentstehung, das ist sehr schwer, selbst zurückzuerobern unter den besten Bedingungen in vitro. Über dieses Protokoll haben wir gezeigt, dass die Entwicklung von Basalzellkarzinom durch Expansion der epidermalen Stammzellen sowie Rekrutierung von myeloischen Zellen begleitet wird. Im Vergleich mit Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz Analysen geben Zellpopulation Analysen eine quantitative Beurteilung der Zellpopulation Änderungen seit spezifischen Antikörpern zu einer Vielzahl von Zelltypen sind jetzt verfügbar.
Aus diesem Protokoll werden 10 Wochen benötigt, um die Studie abzuschließen, weil phänotypische Veränderung von Geninduktion erfordert Zeit. Es ist daher wichtig, um das Experiment im Voraus planen. Für Zellisolation und Analysen können zwei ganze Tage benötigt werden. Da lebende Zellen sind für analys verwendetes, ist es wichtig, eine FACSCalibur vor der Zeit zu reservieren. Wir haben auch bekannte Probleme bei der Arbeit mit diesem Protokoll (siehe unten).
Nach unserer Erfahrung sind unten gemeinsamen Probleme, die wir angetroffen:
- Schlechte Trennung der Epidermis: Dies kann durch unvollständige Dispase Behandlung (Bitte erhöhen Sie die Zeit von diapase Behandlung) oder unzureichende Dispase Lösung (Die Haut braucht, um völlig in Dispase getaucht werden) verursacht werden. Wir benutzen mindestens 5 ml Dispase Lösung für eine Maus. Das Volumen kann auf der Basis der Größe der Haut variieren.
- Geringe Ausbeute von Zellzahl: Dies kann aufgrund unvollständiger Verdauung mit Kollagenase IV. Prüfen Sie bitte zuerst Kollagenasekonzentration oder Ablaufdatum. Dies kann auch durch unzureichende Menge Epidermis zurückzuführen sein. Darüber hinaus sollte Enzymverdau bei 37 ° C unter Schütteln (justieren Sie bitte Temperatur vor durchführen Verdauung) durchgeführt.
- Zellklumpen: Dies ist sehr häufig für die Hautzellen (Pipette Zellenein paar Mal, nachdem sie durch Sieb (vor Zentrifugation), oder die Existenz von Mg 2 + und Ca 2 + in der Lösung (bitte verwenden Mg 2 + und Ca 2 +-freiem PBS für Zelle wash).
- Zu viele tote Zellen: Dies kann eine Folge der verschlechterten Gewebe sein (bitte verwenden frische Gewebe) oder über-Verdauung (vermeiden Sie längere Inkubation mit Dispase und Collagenase IV).
Dieses Protokoll kann mit Knochenmarktransplantation oder Gewebetransplantation, um die Zelle Herkunft zu prüfen kombiniert werden. Beispielsweise nach Transplantation von GFP-exprimierenden Knochenmarkzellen zu letal bestrahlten Mäusen ermöglicht es uns, den Beitrag von Knochenmarkzellen an Tumor-assoziierte Fibroblasten und myeloiden Zellen zu untersuchen. Ebenso können Hauttumoren in eine neue Mäusewirt an Tumor-Wirt-Interaktionen untersuchen transplantiert werden.
Neben Zellpopulation Veränderungen während der Krebsentstehung zu untersuchen, wird dieses Protokoll auch den Forschern ermöglichen, zu prüfen,Effekte der medikamentösen Therapie der Zellen im Tumor Umgebung. Obwohl dieses Protokoll wurde entwickelt, um für Zellpopulation Analysen während Haut verwenden Krebsentstehung, leichten Modifikationen auch für andere Krebsarten gemacht werden.
Zusammenfassend kann Zellpopulation Analysen in Mausmodellen von Hautkrebs geben uns die dynamischen zellulären Veränderungen während der Krebsentstehung, was zu einem besseren Verständnis der Zellbiologie in neoplastischen Transformation und verschiedenen zellulären Ereignissen im Transformationsprozess.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom NCI (R01-R01-94160 und 155086), IU Simon Cancer Center und Wells Center for Pediatric Research unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
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